Abstract

Fundo

sulindaco é um FDA-aprovado não-esteróides anti-inflamatórios (AINE) que afeta prostaglandina produção por ciclooxigenases inibidoras (COX) 1 e 2. sulindac também se interessou por mais de década como quimiopreventivo para pólipos colorretais adenomatosos e câncer de cólon.

principais conclusões

Pré-tratamento de cólon humano e células de cancro do pulmão com sulindac aumenta a morte por um agente oxidante tal como hidroperóxido de terc-butilo (TBHP) ou peróxido de hidrogénio. Este efeito não envolve a inibição da ciclo-oxigenase (COX). No entanto, sob as condições utilizadas, não há um aumento significativo em espécies reactivas de oxigénio (ROS) no interior das células cancerosas e uma perda de potencial de membrana mitocondrial, sugerindo que a morte celular é devida a apoptose, o que foi confirmado por ensaio TUNEL. Em contraste, esta matança reforçada não foi observado com as células do pulmão ou do cólon normais.

Significância

Estes resultados indicam que as células normais e cancerosas lidar com o estresse oxidativo em diferentes formas e sulindac podem aumentar essa diferença. A combinação de sulindac e um agente oxidante poderia ter valor terapêutico

Citation:. Marchetti M, Resnick L, Gamliel E, Kesaraju S, Weissbach H, Binninger D (2009) Sulindac Melhora a matança das células cancerosas expostas a Estresse oxidativo. PLoS ONE 4 (6): e5804. doi: 10.1371 /journal.pone.0005804

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de fevereiro de 2009; Aceito: 11 de maio de 2009; Publicação: 05 de junho de 2009

Direitos de autor: © 2009 Marchetti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por um Centro de Excelência em Biomédica e Biotecnologia marinha subvenção do Estado da Flórida (concessão 1140-190-43 atribuído a DB e HW). apoio adicional fornecido pelo National Institutes of Health (1 R15 CA 122001-01A1 atribuído a HW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Sulindac foi um dos primeiros não-esteróides anti-inflamatórios (NSAIDs), que afectam a produção de prostaglandinas por ciclooxigenases inibidoras (COX) 1 e 2 [1]. Por mais de uma década, sulindac também tem sido de interesse como um tratamento quimiopreventivo para pólipos colorretais adenomatosos e câncer de cólon [2] – [5], especialmente em doentes com polipose adenomatosa familiar [6]. Sulindac também tem sido relatado como um agente quimiopreventivo de cancro da bexiga urinária de rato [7]. A actividade anti-tumorigénica de sulindac contra o cancro do cólon pode envolver a inibição da COX [2] e as actividades que são independentes da inibição de COX [8] – [11]. Tem sido relatado que o sulindac induz a apoptose de células de cancro do cólon, [11], [12], o que parece envolver alterações na expressão do gene [12] – [18].

Sulindac é uma pró-droga que deve ser convertido para o COX-inibidor activo, sulfureto de sulindac [19]. Nós mostramos anteriormente que a conversão de sulfureto de sulindac para sulindac pode ser catalisada por MSRA, um membro da família de metionina sulfóxido reductase (MSR) de enzimas [20]. O sistema Msr foi estudado em detalhe nos últimos anos, depois de ter sido demonstrado que MSRA podem desempenhar um papel no envelhecimento e doenças relacionadas com a idade [21] – [23]. A função óbvia do sistema Msr é reduzir sulfóxido de metionina (Met (O)) em proteínas de volta para a metionina (Met) (revisto em [23]), embora também funciona como parte de um sistema eliminador de ROS, em que o MSR sistema permite resíduos Met em proteínas para funcionar como antioxidantes catalíticos [24]. Suporte para o papel limpador de MSRA veio de estudos recentes com ambos os 12 PC-células neuronais, em que MSRA foi overexpressed [25], e células do cristalino humanos, em que a expressão MSRA foi baixo regulados [26]. Assim, não há evidências que sugerem que o sistema MSR desempenha um papel importante na proteção das células contra danos oxidativos.

Desde sulindac é um substrato para MSRA [20], parecia razoável que a morte de células cancerosas, sulindac pode envolver o estresse oxidativo. Além disso, queríamos determinar se as células normais e células cancerosas respondeu de forma semelhante (s) após o tratamento com o sulindac e o stress oxidativo. Num estudo preliminar, que mostrou que o tratamento de uma linha celular de cancro das células escamosas com sulindac e um agente oxidante levou a um aumento de quase 500% no intracelulares níveis de ROS e morte celular significativa. Em contraste, os queratinócitos epidérmicos humanos normais não apresentaram um aumento nos níveis de ROS ou morte celular. Esses resultados levaram a um ensaio clínico limitado que mostrou promissor potencial do uso de aplicação tópica de sulindac e peróxido de hidrogênio para o tratamento de queratoses actínicas [27].

Nos presentes estudos nós estendemos estes resultados anteriores utilizando linhas celulares de cancro derivado a partir de tecido de pulmão e cólon. Nós fornecemos mais provas de que a morte aumentada observada com sulindac e estresse oxidativo envolve disfunção mitocondrial levando à morte celular por apoptose. Estes novos dados fortalecer o potencial para melhorar especificamente a aplicação terapêutica de sulindac e seus derivados para o tratamento do câncer, utilizando-os em conjunto com um composto que produz espécies reativas de oxigênio (ROS).

Resultados

sulindac aumenta a morte de células tumorais por stress oxidativo, mas não envolve qualquer inibição de COX ou o sistema Msr

linhas celulares de cancro do pulmão e do cólon humano foram pré-incubadas na presença ou ausência de sulindac durante 48 horas. O excesso de sulindac foi removido por lavagem antes da incubação de 2 h com TBHP como descrito nos Materiais e Métodos. Sulindac foi utilizado a 500 uM concentração final uma vez que experiências preliminares utilizando sulindac a esta concentração não mostrou nenhum efeito significativo sobre a viabilidade celular para qualquer uma das linhas celulares de cancro.

Cada linha celular de cancro tiveram uma diminuição acentuada da viabilidade celular na presença de TBHP seguinte de pré-tratamento com 500 uM de sulindac (Figura 1A e 1B). A viabilidade das células de cancro do pulmão pré-tratados com sulindac foi reduzida em mais de 80% após incubação durante 2 h com 240 uM TBHP quando comparado com células de controlo que não foram pré-tratados com sulindac (Figura 1A). Foram observadas respostas semelhantes para TBHP com células de cancro do cólon sulindac tratados (Figura 1B), embora foi necessária uma concentração mais elevada de TBHP para morte significativa de células de cancro do cólon. Sulindac também reforçada a morte de ambas as linhas de células de câncer quando TBHP foi substituído com peróxido de hidrogênio, em concentrações entre 1,0 mM e 6,0 mM (Figura 2).

células cancerosas do pulmão (A) ou células cancerígenas do cólon (B) foram incubadas na presença (▪) ou ausência (□) de 500 uM sulindac durante 48 h. As células foram então lavadas para remover o sulindac livre antes da incubação durante 2 horas com a concentração indicada de TBHP e a viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio de MTS descrito em Materiais Métodos. A viabilidade das células é expressa como% do controlo (células não pré-tratados com sulindac ou expostos a TBHP). As barras de erro são o erro padrão da média (SEM), expressa como uma% do valor médio de quatro amostras em duplicado de uma experiência representativa. A significância das diferenças entre as células tratadas com e sem o sulindac, mas exposta à mesma concentração de TBHP: * p 0,01; ** P 0,001; *** P 0,0001

células de cancro do pulmão (A) ou células cancerígenas do cólon (B) foram incubadas na presença (▪) ou ausência (□) de 500 uM sulindac durante 48 h.. As células foram então lavadas para remover o sulindac livre antes da incubação durante 2 horas com a concentração indicada de peróxido de hidrogénio. A viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio de MTS descrito em Materiais Métodos. A viabilidade das células é expressa como% do controlo (células não pré-tratados com sulindac ou expostas a peróxido de hidrogénio). As barras de erro são o erro padrão da média (SEM), expressa como uma% do valor médio de quatro amostras em duplicado de uma experiência representativa. A significância das diferenças entre as células tratadas com e sem o sulindac, mas expostos a mesma concentração de peróxido de hidrogénio: * p 0,01; ** P 0,001; *** P . 0,0001

Diversas linhas de evidência indicam que a morte aumentada de células cancerosas, sulindac e estresse oxidativo não envolve a inibição da COX. Dois outros AINEs, ácido acetilsalicílico (aspirina) e ibuprofeno, em 500 | iM, não conseguiu aumentar a sensibilidade das células cancerígenas ao estresse oxidativo (Figura 3A e 3B, respectivamente). Como observado acima, o sulindac é uma pró-droga que tem de ser convertido para a COX-inibidor activo, sulindac sulfureto de [19], principalmente através da actividade do MSRA [20]. Para determinar se a morte aumentada de células de cancro tratados com sulindac por TBHP envolvido redução de sulindac em sulfureto de sulindac, o inibidor activo de ciclooxigenases, as experiências descritas acima foram repetidas utilizando sulindac sulfona, que não é um substrato para MSRA (dados não publicados) ou um inibidor de COX [28]. Por causa do aumento da toxicidade de sulindac sulfona foi usada uma concentração mais baixa (250 uM) para estas experiências. O pré-tratamento de células de cancro do pulmão com 250 uM de sulindac sulfona (Figura 3C), seguido pela exposição ao TBHP deram origem a resultados comparáveis ​​aos observados usando 500 uM sulindac (comparar as Figuras 1A e 3C). Resultados semelhantes utilizando sulindac sulfona foram também obtidos com as linhas de células cancerígenas do cólon (dados não mostrados). Assim, os dados colectivos indicam que o aumento da sensibilidade das células de cancro tratadas sulindac ao estresse oxidativo, sob as condições utilizadas, não envolver o sistema Msr ou inibição da COX.

cancro do pulmão células foram incubadas na presença ( ▪) ou ausência (□) de qualquer das 500 uM de ácido acetilsalicílico (a), 500 uM de ibuprofeno (B) ou 250 uM de sulindac sulfona (C) durante 48 horas. As células foram então lavadas para remover o NSAID sulindac sulfona ou livre antes da incubação durante 2 horas com a concentração indicada de TBHP. A viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio de MTS descrito em Materiais Métodos. A viabilidade das células é expressa como% do controlo (células não expostas a um NSAID, sulindac sulfona, ou TBHP). As barras de erro são o erro padrão da média (SEM), expressa como uma% do valor médio de quatro amostras em duplicado de uma experiência representativa. A significância das diferenças entre as células tratadas com e sem sulindac sulfona, mas que se expõe à mesma concentração de TBHP: * p 0,01; ** P 0,001; *** P . 0,0001

Sulindac não aumentar a morte de células normais expostos ao estresse oxidativo

Foi importante para determinar se o efeito matando melhorada do sulindac e sulindac sulfona em células de cancro, na presença de TBHP (Figura 1) também ocorreu com as células normais, não imortalizadas. A Figura 4 mostra o efeito do pré-tratamento de células normais de pulmão com sulindac ou sulindac sulfona na viabilidade das células após o stress oxidativo usando TBHP. A incubação de células normais de pulmão com o sulindac 500 uM durante 48 horas antes da exposição ao TBHP não só não aumentou a matar, mas sulindac fornecida protecção contra o stress oxidativo causado por TBHP (Figura 4A). Também foi observado o efeito protector do stress oxidativo nas células pulmonares normais quando as células foram pré-tratados com sulindac sulfona (Figura 4B).

células pulmonares normais foram incubadas durante 48 horas em (A) a presença (▪) ou ausência (□) de 500 pM ou sulindac (B) na presença (▪) ou ausência (□) de 250 pM de sulindac. Ver Materiais e Métodos e legenda da Figura 1 para mais detalhes. A significância das diferenças entre as células tratadas com e sem o sulindac sulfona ou sulindac, mas exposta à mesma concentração de TBHP: * p 0,01; ** P 0,001; *** P . 0,0001

Experiências semelhantes foram realizadas utilizando as células do cólon normais. Não houve efeito sobre a viabilidade celular na presença de TBHP, quando as células de cólon normais foram pré-tratados com sulindac 500 uM ou 250 uM sulindac sulfona (dados não mostrados). Assim, nem o pulmão normal nem células de cólon normal apresentou morte por TBHP após o tratamento com sulindac ou sulindac sulfona aumentada, como foi observado com as duas linhas de células de cancro.

Sulindac pré-tratamento de células de cancro pulmonar conduz a níveis elevados de ROS e perda de potencial

células de cancro do pulmão de membrana mitocondrial foram usadas para obter mais informação sobre o mecanismo do efeito de morte aumentada de sulindac na presença de TBHP. Para investigar se a morte aumentada das células cancerosas observadas com sulindac e estresse oxidativo pode envolver a disfunção mitocondrial, foram determinadas mudanças no nível de ROS intracelular. Para estas experiências, as células do cancro do pulmão foram tratados com sulindac, durante 48 horas, exposto a TBHP e, em seguida, o nível intracelular de ROS foi visualizado utilizando um corante fluorescente, tal como descrito nos Materiais e Métodos. Os resultados são mostrados na Figura 5. Em comparação com células não tratadas com cancro do pulmão (Figura 5A), as células tratadas com o sulindac sozinho (Figura 5B) ou TBHP sozinho (Figura 5C) mostraram um aumento modesto (53-58%) nos níveis de ROS baseado em aparecimento de fluorescência verde. No entanto, as células de cancro do pulmão que foram pré-tratadas com 500 uM de sulindac seguido de uma incubação de 2 h com 80 uM TBHP (Figura 5D) tinham um aumento de 400% na fluorescência verde intracelular em comparação com as células não tratadas (comparar Figura 5A e 5D). Estes dados mostram claramente que o tratamento prévio das células de cancro do pulmão com sulindac leva a um grande aumento na ROS intracelular após a exposição ao stress oxidativo, suportando os resultados sobre as células cancerosas da pele relatados recentemente [27].

Os painéis mostram intracelular fluorescência de ROS. (A) As células não tratadas; (B) As células tratadas com apenas o sulindac; (C) As células tratadas com apenas TBHP; (D) As células tratadas com a combinação de sulindac e TBHP. As condições de incubação são descritos na Figura 1. As células foram preparadas para microscopia de fluorescência e o sinal de fluorescência verde foi quantificada tal como descrito em Materiais e Métodos. níveis de fluorescência são a média de duas experiências independentes e foram ajustadas para a percentagem de células viáveis. A SEM era inferior a 10% para cada amostra. O aumento de fluorescência em comparação com células de controlo no painel A são: B, 53%; C, 57%; D, 401%.

Para explorar ainda mais o mecanismo de matar as células cancerosas expostas a stress oxidativo, após pré-tratamento com o sulindac, nós investigamos se existe uma perda concomitante de potencial de membrana mitocondrial, o que é conhecido por iniciar morte celular por apoptose. Efeitos sobre o potencial de membrana mitocondrial foram avaliadas utilizando alterações na fluorescência do corante JC-1 como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados são mostrados na Figura 6. Os painéis superiores mostram imagens fluorescentes vermelhas e os painéis inferiores imagens fluorescentes verdes. A perda do potencial de membrana mitocondrial iria resultar numa diminuição da fluorescência vermelha e um aumento correspondente da fluorescência verde. Relativamente às células não tratadas (Figura 6A) ou de células tratadas com apenas o sulindac (Figura 6B) ou TBHP sozinho (Figura 6C), o sulindac o pré-tratamento de células de cancro do pulmão, seguido por stress oxidativo (Figura 6D) resultou em ruptura do potencial da membrana mitocondrial tal como evidenciado pela quase um aumento de 20 vezes na fluorescência verde (ver legenda da Figura 6 para obter detalhes adicionais). Em resumo, pré-tratamento das células de cancro do pulmão com sulindac seguido por tratamento com TBHP leva a um aumento acentuado na ROS intracelular e uma perda significativa de potencial de membrana mitocondrial. Estes resultados indicaram que a morte celular estava a ocorrer através de apoptose, o que foi confirmado por meio de análise de Tunel (Figura Suplementar S1)

painéis superiores mostram imagens de fluorescência vermelhos enquanto que os painéis inferiores mostram imagens de fluorescência verde. A perda do potencial de membrana mitocondrial foi detectado por um decréscimo da fluorescência vermelha com um aumento concomitante de fluorescência verde. O delineamento experimental é descrita nas lendas da Figura 1. (A) células não tratadas; (B) As células tratadas com apenas o sulindac; (C) As células tratadas com apenas TBHP; (D) As células tratadas com a combinação de sulindac e TBHP. As células foram preparadas para microscopia de fluorescência e o sinal de fluorescência foi quantificada tal como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados são uma média de três experiências independentes. SEM era inferior a 10% para cada amostra. análise quantitativa de fluorescência verde é expressa da seguinte forma em unidades arbitrárias: Painel A -1,39; painel B -1,23; painel C -1,29; Painel D -25,3.

Discussão

sulindaco e seus metabólitos, tais como sulfureto de sulindac e sulindac sulfona, têm sido demonstrado que têm actividade anti-câncer [29]. Consistente com o nosso estudo anterior de células cancerosas da pele [27], que demonstraram que a morte de linhas celulares tumorais de pulmão e cólon pode ser melhorada significativamente se o sulindac é combinado com um oxidante, tal como peróxido de hidrogénio ou TBHP. Também mostrámos que o pré-tratamento sulindac pode aumentar a morte de células cancerosas da pele causada por trióxido de arsénio (dados não mostrados), que mata as células cancerosas através da geração intracelular de ROS, como relatado noutro local para as células de cancro do pulmão [30]. Parece razoável que o sulindac pode aumentar a eficácia de qualquer droga anti-cancro em que o mecanismo de acção envolve dano oxidativo. A aplicação com sucesso de uma terapia de múltiplas drogas, foi recentemente relatado para um ensaio clínico envolvendo cerca de 300 pacientes com risco de recorrência de adenomas colorectais, que foram tratados com uma combinação de sulindac e difluorometilornitina, um inibidor da síntese de poliamina [31].

parece provável que o mecanismo da morte selectiva de células cancerígenas visto nestes estudos envolve disfunção mitocondrial, possivelmente como resultado do aumento da produção de ROS. Embora o tratamento de células cancerosas com sulindac ou TBHP leva individualmente a um aumento modesto no nível de ROS (Figura 5B e [27], [32]), há um aumento dramático nos níveis intracelulares de ROS nas células pré-tratadas com o sulindac e em seguida, expostos a TBHP (Figura 5D). Além disso, existe uma perturbação significativa do potencial de membrana mitocondrial nas mesmas condições experimentais (Figura 6), sugerindo que o sulindac provoca a apoptose em células cancerosas expostas a stress oxidativo. O efeito anti-cancerígeno de sulindac sozinho tem sido relatada a envolver a morte apoptótica [33]. Os resultados com o sulindac sulfona e outros AINEs indicam que o efeito de sulindac no nosso sistema não envolve a inibição de COX ou o sistema MSR.

Os presentes resultados indicam uma diferença fundamental na forma como as células normais e cancerosas responder aos oxidativo estresse. Sulindac e seus metabolitos pode acentuar esta diferença, o que leva a uma maior morte de células cancerosas, mas não as células normais, por stress oxidativo. Está bem estabelecido que o cancro e as células normais diferem no seu metabolismo oxidativo e que as células de cancro têm uma maior taxa de glicólise do que as células normais, um fenómeno descrito pela primeira vez por Warburg [34]. Há também evidências convincentes de que as células cancerosas são tipicamente sob maior estresse oxidativo em comparação com as células normais [35]. A diferença entre células normais e cancerosas ao estresse oxidativo que tem sido relatado é a citotoxicidade causada pela privação de glicose. Estudos de Spitz e colaboradores [36] demonstraram claramente que este efeito é mediado pela produção de ROS mitocondrial.

Os resultados descritos fornecem evidências adicionais de que uma combinação de sulindac e um agente oxidante podem ter valor terapêutico no tratamento de uma clínica variedade de cânceres. Num estudo preliminar anterior que relatou que os resultados de uma prova de conceito limitado ensaio clínico em humanos utilizando sulindac (1-5%) e peróxido de hidrogénio (25%) géis aplicado diariamente durante três semanas em ceratoses actínicas (AK) que envolvem as extremidades superiores [27]. Após a conclusão, todos os dez KAs tratados apresentaram uma redução em tamanho como demonstrado por fotografia clínico com cinco exibindo desaparecimento completo das células pré-cancerosas da pele após a biópsia. Estes resultados preliminares garante mais extensos ensaios clínicos

Materiais e Métodos

Materiais

sulindac, ácido acetilsalicílico (aspirina), (S) -. (+) – Ibuprofeno e terc-butil-hidroperóxido (TBHP) foram obtidos de Sigma (St. Louis, MO). Sulindac sulfona foi sintetizada por Síntese Personalizada Inc. (Boca Raton, FL). Todos os meios de cultura de tecidos incluindo o soro fetal de bovino e outros suplementos foram comprados a American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD).

Cultura celular

Uma linha celular de cancro do cólon (RKO), uma linha celular de cancro do pulmão (A549), e linhas celulares de fibroblastos derivados de tecido normal do cólon humano (CCD-18Co) e de pulmão humano normal (MRC-5) foram obtidas de ATCC (Rockville, MD). Todas as linhas celulares foram mantidas em meio de cultura recomendado. As linhas de células normais não foram imortalizadas e células passagem precoce foram usadas para as experiências aqui relatadas. As linhas de células foram determinadas como sendo livre de micoplasma usando o Kit de Mycoplasma VenorGeM® Detecção (Sigma-Aldrich), o qual é um ensaio baseado em PCR altamente sensível.

Ensaio de viabilidade celular

Salvo indicação em contrário , as células foram pré-tratados com sulindac, sulindac sulfona ou outro AINE durante 48 h antes da exposição ao TBHP durante 2 h. As suspensões de células (~100,000 células) contendo o suplemento indicado foram plaqueadas em placas de microtitulação de 96 poços utilizando 100 ul da suspensão de células indicada. As placas foram incubadas durante 48 h a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. O meio de cultura foi então removido e as células lavadas uma vez com meio de cultura fresco com soro. Após a remoção da solução de lavagem, o meio de cultura fresco com soro que continha a concentração final indicada de TBHP ou peróxido de hidrogénio foi adicionado às células, e as células foram incubadas durante mais 2 horas. Resultados semelhantes foram obtidos quando foi incluído o sulindac durante o tratamento de 2 horas com o agente oxidante

A viabilidade celular foi determinada pelo CellTiter 96 Aqueous One celular Ensaio de Proliferação. (Promega; Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio utiliza um novo composto de tetrazólio que as células metabolicamente activas converter para um formazano solúvel em água pela acção de desidrogenases celulares, o que é medido por absorvência a 490 nm utilizando um leitor colorimétrico placa de microtitulação (SpectraMax Além disso

384; Molecular Devices) . absorvância de fundo foi subtraída de cada amostra. Tem sido relatado que algumas drogas anti-cancro pode causar alterações na absorvância em ensaios baseados em MTS para a viabilidade celular na ausência de células [37]. As experiências de controlo utilizando sulindac sozinho, TBHP sozinho ou combinações de sulindac e TBHP no intervalo de concentração utilizada nas experiências relatadas não mostrou nenhum efeito de cada composto sozinho ou em combinação na absorção.

intracelular ROS Ensaio

níveis intracelular ROS foram determinadas usando as espécies reativas de oxigênio (ROS) Reagentes de Detecção Molecular Probes (Eugene, OR), conforme descrito em outro lugar [38]. Níveis elevados de resultado ROS em aumento da fluorescência verde, que foi visualizado por microscopia de fluorescência.

JC-1 ensaio para medir potencial de membrana mitocondrial

A perda de potencial de membrana mitocondrial foi determinada utilizando o JC-1 tintura de Molecular Probes (Eugene, OR). A perda de potencial de membrana mitocondrial leva a um aumento da fluorescência verde no citosol e uma diminuição correspondente da fluorescência vermelha mitocondrial. Assim, as mudanças no potencial da membrana mitocondrial foram determinados seguindo o vermelho para mudança de coloração verde usando um filtro FITC (Zeiss microscópio invertido-Axiovert 40 CFL). A quantificação dos sinais de fluorescência utilizados dois métodos densitométricos padrão e um Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA) de análise de imagem com base [39].

TUNEL Ensaio para demonstrar a apoptose

células

apoptóticos foram detectados utilizando o ensaio colorimétrico de TUNEL Deadend (Promega), que termina etiquetas de ADN fragmentado. As células foram fixadas com formaldeído a 4%, antes de ser permeabilizadas com 0,2% de Triton-X-100. As células foram então lavadas com PBS antes da incubação com transferase recombinante de desoxinucleotidilo terminal (TdT) e nucleótidos biotinilados durante 1 h a 37 ° C, que incorpora nucleótidos biotinilados em extremidades 3 ‘de ADN fragmentado. As células foram lavadas com PBS e depois incubadas com peroxidase de rábano-estreptavidina (HRP-Estreptavidina) à temperatura ambiente durante 30 min. HRP-estreptavidina células marcadas foram detectadas por peróxido de hidrogénio e diaminobenzidina (DAB). As células apoptóticas são visualizadas por coloração nuclear marrom escuro.

A análise estatística

Os resultados das experiências de viabilidade celular são expressos como a média de quatro repetições de uma experiência representativa. As barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM). As médias foram comparadas usando t-testes padrão e os valores P são indicados nas legendas das figuras. valores P 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A quantificação dos sinais de fluorescência utilizados dois métodos densitométricos padrão e um Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA) de análise de imagem com base [39].

Informações de Apoio

Figura S1.

a morte celular por apoptose. Um ensaio de TUNEL foi utilizado para detectar a apoptose de células de cancro do pulmão. (A) As células não tratadas; células (B) tratados com apenas 500 mm de sulindac; (C) As células tratadas com apenas 180 uM TBHP; (D) As células tratadas com a combinação de sulindac 500 uM e 180 uM TBHP. Os níveis aumentados de apoptose são indicadas pelo aumento da formação de coloração castanha. O delineamento experimental é descrita nas lendas da Figura 1 no manuscrito. Detalhes adicionais do ensaio TUNEL são fornecidos em Materiais e Métodos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0005804.s001

(0,22 MB TIF)

Reconhecimentos

gostaria de reconhecer o Dr. Daphna Sagher por sua assistência e discussões úteis. Também gostaríamos de agradecer Kelsey Binninger por sua ajuda com a arte.