Abstract

carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN) é uma doença agressiva com a sobrevivência pobre e é o sexto tipo de câncer mais comum em todo o mundo. O refluxo gastroesofágico é um evento comum em pacientes SCCHN. GPR4 é uma proteína G sensível à protão receptor acoplado, que pode ser activado por acidose. O objetivo deste estudo foi explorar o papel de GPR4 em exposição ácida e angiogênese tumoral em SCCHN. Neste estudo, confirmou-se que sobre-expressam GPR4 SCCHN em células pode aumentar a expressão e secreção de IL6, IL8 e VEGFA a pH 5,9. Este efeito poderia ser inibida por SB203580 (um inibidor de p38). A análise por Western blot indicou que a fosforilação da p38 em células infectadas aumentou GPR4 a pH 5,9, o qual poderia ser inibida por SB203580. No ensaio de formao de tubo, as células HMEC-1 foram incubadas com meio condicionado (CM, pH 5.9, 6.5, 7.4) derivado de controlo e células infectadas GPR4 SCCHN. comprimento do tubo foi significativamente aumentada em células HMEC-1 incubadas com CM a partir de células infectadas GPR4 em comparação com células de controlo a pH5.9, o que indica o efeito pró-angiogênico do GPR4 em pH ácido. Os anticorpos neutralizantes de IL6, IL8 e VEGFA podia inibir a formação de tubos de células HMEC-1. In vivo, o efeito de GPR4 na angiogénese foi investigada com o modelo de pintainho membrana corioalantóica (CAM). Controlo e GPR4 células infectadas SCCHN foram semeados sobre a superfície de carne superior (n = 5 em cada grupo) e 5 mL de DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5, 7,4) foi adicionado à superfície da célula a cada 24 h. Quatro dias mais tarde, a carne superior foram colhidas e a razão entre a área vascular para a área da CAM foi quantificada utilizando software de imagem-Pro Plus 6.0. células infectadas GPR4 poderia recrutar mais vascular do que as células de controlo a pH5.9. Em conclusão, nós sugerido que induz a angiogénese através GPR4 mediada por p38 IL6, IL8 e VEGFA secreção induzida por GPR4 a pH extracelular ácido na SCCHN

citação:. Z Jing, Xu H, Chen X, Q Zhong, Huang J, Zhang Y, et al. (2016) A Proton-Sensing acoplados à proteína G Receptor GPR4 promove a angiogênese em Câncer de Cabeça e Pescoço. PLoS ONE 11 (4): e0152789. doi: 10.1371 /journal.pone.0152789

editor: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, United States |

Recebido: 29 de setembro de 2015; Aceito: 18 de março de 2016; Publicação: 14 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Jing et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela bolsa do Programa Yangfan de Pequim Administração Municipal de Hospitais (sem XMLX201507.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN) é uma doença agressiva com a sobrevivência pobre e é o sexto tipo de câncer mais comum em todo o mundo [1]. A incidência mundial é de cerca de 600.000 casos por ano [2]. Tabagismo e abuso de álcool são os principais fatores de risco para SCCHN. O refluxo gastroesofágico é um evento comum em pacientes SCCHN [3], o que indica que está associada com um risco elevado de cancro do cancro da laringe e da faringe [4]. Vinte e quatro horas monitorização duplo sonda de pH indica que o pH do esfíncter esofágico superior como sendo inferior a 4 [5]. exposição ácida pode levar a várias doenças otorrinolaringológicas, como laringite crônica, nódulos vocais, edema de Reinke, o contato úlcera e granuloma, estenose de laringe, e laringoespasmo paroxística [6]. No carcinoma epidermóide de esôfago, exposição ácida contínua promove o desenvolvimento vascular [7], que desempenha um papel crítico durante o início e progressão tumoral maligna [8].

Os receptores acoplados à proteína G-sensor de prótons (GPCRs), incluindo GPR4, GPR65 (TDAG8), GPR68 (OGR1), e GPR132 (G2A) foram recentemente identificadas como novos sensores de pH que são propostos para ser activado pelo pH extracelular ácido [9]. Tem sido demonstrado que GPR4 é sobre-expressa em vários tipos de malignidades [10, 11]. No carcinoma epitelial do ovário, GPR4 densidade de expressão é acompanhado por uma maior densidade microvascular (MVD) [10], e foram correlacionados com o estado de metástases nos linfonodos e estágio clínico. Isto indica que GPR4 podem estar envolvidos na angiogénese relacionada com o cancro. Em SCCHN, a correlação entre a exposição ao ácido, angiogénese tumoral e GPR4 não tem sido bem estudada. Em um estudo anterior, confirmou que GPR4 poderia ativar AP1 e ERK vias de sinalização no pH extracelular ácida [12]. AP1 é um dos sítios regulatórios de IL6, IL8 e VEGFA [13-15]. GPR4 como um sensor de pH está positivamente correlacionada com a maior densidade microvascular, de modo que a hipótese de que ele pode aumentar a expressão de IL6, IL8 e VEGFA e induzir angiogénese no pH extracelular ácida. Neste estudo, sugerimos que GPR4 induzida angiogênese através da secreção IL6, IL8 e VEGFA induzida por GPR4 no pH extracelular ácida em SCCHN.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

permissão ética para este estudo foi concedido pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Beijing Tongren Hospital (Pequim, China).

Cultura celular

as linhas celulares SCCHN células FaDu e células Tca8113, células endoteliais microvasculares humanas (HMEC-1) foram utilizados no estudo. células FaDu foram obtidos a partir Estado Key Laboratório de Doenças Orais, Universidade de Sichuan [16]. Tca8113 células foram obtidas a partir de China Infra-estrutura de Recursos linha celular. As células HMEC-1, obtida a partir de Thermo Fisher, foi gerado por Ades et al [17]. Todas as células foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM, Hyclone, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco) e 1% de penicilina /estreptomicina. Todas as células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2.

A geração de adenovírus recombinante transportando GPR4 Gene

O adenovírus recombinante expressando GPR4 (Ad-GPR4) foi gerado de acordo com os métodos descritos anteriormente [18]. Resumidamente, GPR4 foi sub-clonado no vector adenoviral pAdxsi (Sinogenomax, China). A construção adenoviral recombinante foi transfectado para células HEK293 a embalagem e, em seguida, estas células foram congeladas-descongeladas várias vezes para libertar partículas virais intracelulares. Os títulos virais foram testados em células HEK293 e o número de unidades formadoras de placas (pfu) foi obtido utilizando um ensaio de formação de placas.

infecção das células e estimulação Ácido

FADU células e as células foram Tca8113 semeadas em placas de seis poços, atingindo 80% de confluência no dia seguinte. Em seguida, as células foram infectadas com Ad-GPR4 ou Ad-nula (um adenovírus recombinante em branco como controlo). Dezoito horas mais tarde, a estimulação ácido foi realizada como descrito anteriormente [12]. Resumidamente, 18 horas após a infecção, os meios de cultura foram substituídos por DMEM isento de soro /F12 (pH 5,9, 6,5 e 7,4). As células foram recolhidas após a estimulação, durante 6 h. SB203580 (um inibidor de p38, 1 uM) foi usada para determinar se a p38 mediada a secreção das citoquinas pró-angiogénicos. Para realizar a inibição de p38, as células infectadas foram GPR4 durante 4 horas e tratou-se com SB203580 1 uM durante 1 hora antes da estimulação de ácido e, em seguida, os meios de cultura foram substituídos por DMEM isento de soro /F12 (pH 5,9) privadas de soro. As células foram colhidas 6h depois.

condicionado

Médio

Para preparar o meio condicionado (CM), as células FaDu e células Tca8113 foram infectadas com Ad-GPR4 ou Ad-nulo para 18h, a cultura os meios foram substituídos por DMEM isento de soro /F12 (pH 5,9, 6,5 e 7,4), e as células não infectadas actuou como controlo. Seis horas mais tarde, o meio foi centrifugado (4 ° C, 1500 rpm) e o sobrenadante foi recolhido e armazenado a -80 ° C até à sua utilização.

PCR em Tempo Real (qPCR) e PCR semiquantitativa

ARN total de células e FaDu Tca8113 e tecidos SCCHN foram isolados utilizando TRIzol Reagent (Life Technologies, EUA). A transcrição reversa foi realizada utilizando um kit de RT FastQuant (TIANGEN, China). qPCR foi realizada como recomendado pelo fabricante. Os seguintes iniciadores foram utilizados para qPCR: IL6 sentido 5′-TGAGAGTAGTGAGGAACAAG-3 ‘, anti-sentido 5′-CGCAGAATGAGATGAGTTG-3′; IL8 sentido 5’-CCTGATTTCTGCAGCTCTGTGT-3 ‘, anti-sentido 5′-GGTGGAAAGGTTTGGAGTATGTCT-3′; VEGFA sentido 5’-GCCCACTGAGGAGTCCAACATC-3 ‘, anti-sentido 5′-CAAGGCCCACAGGGATTTTCT-3’. Os iniciadores para PCR de GPR4 foram como se segue: sentido 5′-AACCTCTATCGGGTGTTCGTG-3 ‘, anti-sentido 5′-TTGGCTGTGCTGTTCCTCTTGG-3’. GAPDH foi amplificada como um padrão interno. O nível relativo de RNA em cada amostra foi determinado pelo método 2 (-Delta Delta C (T)).

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

As células de controlo e células infectadas GPR4 foram estimuladas por 6h usando sem soro DMEM /F12 (pH 5,9). Em seguida, o meio foi centrifugado (4 ° C, 1500 rpm) e o sobrenadante foi recolhido. A concentração de IL6, IL8, e VEGFA no meio de cultura foi quantificada com um kit de ELISA de acordo com as instruções do fabricante (Abcam).

Análise Western Blot

As células foram lisadas em tampão RIPA ( Beyotime, China) suplementado com PMSF 1 mM de um. Um total de 100 ug de proteínas foram submetidas a electroforese em géis de 10% SDS-PAGE e electrotransferidas para membranas de nitrocelulose (Invitrogen, EUA). Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [12]. GPR4 anticorpo foi comprado de LifeSpan BioSciences (tempo de vida, EUA). A fosfo-p38 (p-p38), p38 total (p38), receptor VEGF 2-fosfo (Tyr1175) e receptor de VEGF 2 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Cell Signaling, EUA). GAPDH (Santa Cruz, CA) foi utilizado como um controlo de carga lisado.

Formação tubo de ensaio

Para confirmar o efeito de GPR4 na formação do tubo em HMEC-1, foi realizado um ensaio de angiogénese sobre growth factor-reduzida Matrigel (BD Biosciences). Um dia antes do ensaio de formao de tubo, HMEC-1 foram semeadas em um disco de 10 cm. Depois de se revestir a placa de 96 poços com Matrigel seguindo as instruções do fabricante, as células HMEC-1 foram colhidas e ressuspensas a 1 x 10

5 /mL utilizando CM suplementado com 2% de FBS. Em seguida, 0,1 ml de suspensão de células foi adicionado à placa de 96 poços. VEGFA (1 ng /mL) foi utilizada como um controlo positivo e DMEM serviu como um controlo negativo. A placa foi incubada a 37 ° C, 5% de CO

2, durante 12 horas para permitir a formação de estruturas do tipo capilar. As fotos foram tiradas com um microscópio de luz e o comprimento do tubo (pixels) foi contado usando o software Imagem-Pro Plus 6.0.

Chick Corioalantóide membrana (CAM) Modelo

fertilizados Specific Pathogen Free (SPF) ovos foram obtidos a partir de Pequim animais de Laboratório Centro de Pesquisa. Os ovos foram incubados numa incubadora humidificada a 37,0 ° C com 60% de humidade. No dia 10, os grandes vasos sanguíneos e do saco foram marcadas no ovo usando luz fria fonte (STORZ, Alemanha). Após desinfecção com álcool a 75%, uma janela redonda foi aberto na parte superior da casca do ovo, a manutenção da membrana de casca de ovo exterior. Um furo foi perfurado pontual no local do saco de ar. Em seguida, 20 ul de solução salina normal foi adicionada à membrana de casca de ovo. A membrana da casca foi perfurada com uma agulha fina e o pequeno orifício pontual no saco de ar foi aspirado com uma pipeta de bolbo de borracha, de modo que a solução salina normal separou a casca de ovo membrana externa a partir da CAM. A membrana da casca do ovo foi descascado fora sem perturbar o CAM. A janela foi coberto com parafilme e o ovo foi colocado na incubadora durante mais um dia. Em seguida, 1 x 10 de células infectadas

6control e GPR4 foram semeados sobre a superfície de carne superior (n = 5 em cada grupo). A janela quadrada no ovo foi selado. Em seguida, 5 mL de DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5, 7,4) foi adicionado à superfície da célula a cada 24h. Quatro dias mais tarde, a carne superior foram colhidas e a razão entre a área vascular para a área da CAM foi quantificada utilizando software de imagem-Pro Plus 6.0.

Bioinformatics

Bioinformatics método foi utilizado como Li [ ,,,0],19] descrito, resumidamente, os dados de matriz relacionadas com cancros do genoma U133 Affymetrixhuman mais 2,0 plataforma foram carregados para baixo a partir da base de dados GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), e genes diferencialmente expressos em Os tumores foram analisados ​​por meio do banco de dados TumourProfile (https://tumour.bjmu.edu.cn/, não publicado) como Wang et al descrito anteriormente processamento de dados e métodos de análise de microarray [20, 21]. O perfil de expressão de GPR4 em uma variedade de cânceres e o controlo correspondente tecidos (normal ou não-tumor) foi procurado nesta base de dados, e os níveis de expressão foram representados como classificar Médias (ARS).

imuno-histoquímica ( IHC)

espécimes

parafina embutido de laringe ou amostras de carcinoma de células escamosas da hipofaringe, juntamente com amostras de tecido normal peri-carcinoma foram obtidos a partir do banco de espécimes de cabeça e pescoço tumor de Pequim Tongren Hospital [12]. lâminas de tecido de parafina foram desparafinados, re-hidratados e colocados em 10 mmol /L de tampão citrato (pH 6,0), e aqueceu-se duas vezes num forno de microondas durante 5 min cada. As lâminas foram incubadas com H2O2 a 3% durante 10 min, lavadas com PBS, bloqueadas com soro de cabra normal a 10% durante 30 minutos, e, em seguida, incubadas com anti-GPR4 (diluído 1: 100; concentração final, 2 ug /mL, tempo de vida, EUA ) ou IgG normal de coelho como controlo a 4 ° C durante a noite. Após a lavagem, as lâminas foram coradas com o kit de sistema de amplificação assinado catalisada (código DAKO k5007) e as imagens foram fotografadas com um microscópio Olympus IX70. expressão semiquantitativa da GPR4 foi calculada usando o software Imagem-Pro Plus 6.0.

Análise de Dados

A análise bioinformática das diferenças na expressão GPR4 entre os cancros e tecidos de controle foram avaliados usando o rank de Wilcoxon sumtest no ambiente de software R (https://www.r-project.org/). correcção da função R “p.adjust” de Bonferroni foi utilizado para ajustar os valores de P. Os dados experimentais foram analisados ​​pelo teste t de Student com software SPSS19.0. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

GPR4 Estimula Pro-angiogénicos secreção de citocinas em ácida Extracelular pH

Para investigar se GPR4 poderia induzir. a expressão de citoquinas pró-angiogénicos no pH extracelular ácida, foi detectada a expressão de IL6, IL8, e VEGFA a diferentes valores de pH (pH 7,4, 6,5 e 5,9). A sobre-expressão de GPR4 em células infectadas GPR4 foi validado por qPCR e Western blot (Fig 1A). Os níveis de mRNA de IL6, IL8 e VEGFA nas células Ad-GPR4 aumento estatisticamente significativo em comparação com as células Ad nulo somente em pH 5,9 (Fig 1B). Em comparação com os controles, houve indução 67.8-, 118- e 12,5 vezes para IL6, IL8 e VEGFA, respectivamente, nas células DA-GPR4. Isto indicou que o pH extracelular ácida expressão aumentada de citocinas pró-angiogénico através GPR4, o qual foi adicionalmente confirmada ao nível da proteína. As concentrações de IL6, IL8, e VEGFA foram significativamente aumentados no sobrenadante de células GPR4 sobre-expressos em comparação com as células de controlo, a pH 5,9 (Fig 1C). O inibidor, SB203580, poderia reduzir a expressão e secreção de IL6, IL8, e VEGFA (Fig 2A e 2B), o que sugere que a p38 pode estar envolvida na indução de citocinas por GPR4. Western blot foi realizada para investigar se GPR4 poderia aumentar a fosforilação de p38 a diferentes pH. A fosforilação de p38 sobre-expressos em células aumentou GPR4 a pH 5,9 (Figura 2C), o que podia ser inibida por SB203580 (Figura 2D). Os nossos resultados com o correspondente que, em SCCHN, p38 constitutivamente activado e leva a aumentar a secreção de citocinas IL-6 e IL8 [22].

O ARN total e a proteína de células DA-GPR4-FADU, Ad-nulo- FADU células foram isolados depois da estimulação de ácido durante 6 h. qPCR e Western blot foram realizados. (A) A sobre-expressão de GPR4 nas células DA-GPR4-FADU foi confirmados por qPCR e Western blot. (B) A expressão de IL6, IL8, e VEGFA aumentou significativamente em células infectadas GPR4 a pH 5,9. (C) Os sobrenadantes das células foram recolhidos e as concentrações de IL6, IL8 e VEGFA foram detectadas por ELISA. Resultados semelhantes foram observados em células Tca8113 (S1) Fig.

(A) nas células DA-GPR4-FADU, SB203580 reduz a expressão de IL6, IL8 e VEGFA a pH 5,9. (B) SB203580 reduzida secreção de IL6, IL8 e VEGFA. (C) GPR4 aumento da fosforilação de p38 em pH5.9. (D) SB203580 inibir a fosforilação de p38 sobre-expressos em células GPR4. Resultados similares foram observados em Tca8113 células (S2 FIG).

GPR4 promove a angiogênese In Vitro

Para testar se GPR4 poderia promover a formação do tubo, as células HMEC-1 foram incubadas com CM derivado a partir de células de controlo e células GPR4 sobre-expressos. Os comprimentos de tubos (setas) foram significativamente aumentados em células HMEC-1 foram incubadas com o CM a partir de células infectadas GPR4 em comparação com células de controlo, a pH 5,9 (Fig 3A). Isto indicou que a sobre-expressão de GPR4 em SCCHN poderia induzir a angiogénese in vitro, a pH ácido. Em SCCHN, a angiogénese é desencadeada por IL-8, IL-6 e VEGF [23, 24]. Para testar se o efeito da angiogénese induzida por GPR4 foi directamente mediada por IL6, IL8 e secreção VEGFA, os anticorpos monoclonais neutralizantes (R D Systems) de IL6, IL8 e VEGFA foram adicionados ao CM de células DA-GPR4-FADU, respectivamente , anticorpo IgG de isotipo foi utilizado como um controlo negativo (Figura 3B). Estes anticorpos neutralizantes reduziram o comprimento do tubo de HMEC-1, e, além disso, os efeitos de anticorpos de neutralização pode ser revertida pela adição do excesso de quantidade destes factores (S3 FIG). Isto sugeriu que a angiogénese induzida por GPR4 IL6, IL8 e secreção VEGFA. Vascular receptor do factor de crescimento endotelial 2 (VEGFR2) é o principal receptor de VEGF e o principal mediador de sinalização pró-angiogénese induzida por VEGF em células endoteliais. Para testar se o aumento da fosforilação GPR4 VEGFR2 em células HMEC-1, foi efectuada transferência de western. Os resultados mostraram que o aumento da fosforilação de VEGFR2 em células HMEC-1 foram incubadas com CM (pH 5,9) derivadas de células GPR4 sobre-expressos (Fig 3D).

(A) O comprimento do tubo (setas) das células HMEC-1 foi aumentou em CM derivado de células Ad-GPR4-FaDu em comparação com células-FaDu Ad-nulo no pH 5,9. (B) Os anticorpos neutralizantes de IL6, IL8 e VEGFA inibiu a formação de tubo em células HMEC-1. anticorpo de isotipo de IgG foi usada como controlo de teste na neutralização de anticorpo. (C) VEGFA (1 ng /mL) foi utilizada como um controlo positivo e DMEM serviu como um controlo negativo no ensaio de formao de tubo. comprimentos de tubo (pixels) foram quantificados a partir de 6 campos representativos usando software Imagem-Pro Plus 6.0. (D) GPR4 VEGFR2 aumentou a fosforilação nas células HMEC-1 a pH 5,9. Resultados similares foram observados em Tca8113 células (S4 FIG).

GPR4 promove a angiogênese In Vivo

In vivo, o potencial angiogênico do GPR4 em SCCHN foi verificada no modelo CAM. células infectadas GPR4 semeadas na CAM recrutou mais vascular do que as células de controlo com pH 5.9. A densidade vascular foi quantificada através do cálculo da razão entre a área vascular para a área da CAM. Nas células DA-nula e Ad-GPR4-FADU, as densidades vasculares que rodeiam o tumor foram 8,46%, e 16%, respectivamente (Figura 4). Isto indicou que a sobre-expressão de GPR4 em SCCHN poderia promover a angiogénese in vivo a pH ácido. A in-vivo e in-vitro estudos indicaram que GPR4 induz a angiogênese em pH ácido, uma característica da progressão do tumor.

As células Ad-GPR4-FaDu recrutou mais vascular do que as células Ad-null-FaDu apenas com pH 5.9. Não foram observadas diferenças entre as células Ad-GPR4-FaDu e células Ad-GPR4-FaDu em pH 7,4 e 6,5. Os rácios de área vascular a área de CAM foram quantificados usando o programa Image-Pro Plus 6.0. Resultados semelhantes foram observados em células Tca8113 (S5 FIG).

GPR4 é abundante em SCCHN

GPR4 é sobre-expresso em vários tipos de doenças malignas incluindo cânceres de mama, câncer de ovário, câncer de cólon, cancros do fígado e cânceres renais [11]. Para avaliar a expressão diferencial de GPR4 em vários cancros e o seu controlo correspondente (normal ou não-tumoral) tecidos ao nível do ARNm, uma análise bioinformática integrado foram realizados com base nos dados relativos aos tumores cas constantes da base de dados GEO. As pontuações de classificação médios (ARS), correção de Bonferroni P-valores ajustados (Tabela 1) foram sintetizados e GPR4 foi regulada em carcinoma renal claro células renais, SCCHN e adenocarcinoma colorretal. A superexpressão de GPR4 em SCCHN é ainda apoiada pela BioXpress (https://hive.biochemistry.gwu.edu/tools/bioxpress) [25]. O banco de dados que indica BioXpress GPR4 é regulada positivamente em 85,37% de amostras de SCCHN em comparação com as suas amostras normais emparelhados com base na sequenciação de ARN (ARN-SEQ); o conjunto de dados depositados no Cancer Genome Atlas (TCGA) de um total de 72 pacientes foi recolhida e utilizada para a análise [25].

Foram coletadas 12 amostras SCCHN (Tabela 2) e executado RT-PCR (Figura 5A e 5B) e imuno-histoquímica (IHC) coloração (Figura 5C e 5D). Todos os pacientes sofriam de refluxo gastroesofágico. Como mostrado na Fig 5, GPR4 foi amplificado em 9/12 amostras e regulada positivamente nos tecidos de tumor (Figura 5A), em comparação com os tecidos normais peri-tumor (Fig 5B). A proteína GPR4 expresso em níveis mais elevados (setas vermelha) nas células tumorais em comparação com as células epiteliais normais de tecidos peri-tumorais. Resultados semelhantes foram observados em ambos os cancros da laringe e hipofaringe.

(A) RT-PCR do GPR4 em tecidos cancerosos. (B) RT-PCR do GPR4 em tecidos normais peri-canceroso. GAPDH foi usada como um padrão interno. (C) Imagem representativa de IHC de câncer de hipofaringe moderadamente diferenciado. tecido normal (D) Peri-canceroso do mesmo doente como C. densidade óptica (E) Integrada (DOI) de células de expressão positiva (setas) foi calculada utilizando o software Imagem-Pro Plus 6.0. No total, foram incluídos 12 casos de SCCHN. O nível de imunorreatividade foi classificada pelo cálculo da densidade óptica integrada (IOD) de células expressão positiva.

Discussão

Neste estudo, sugerimos que, quando expostos para um ambiente ácido, GPR4, um dos GPCRs de detecção de protões, poderia induzir a angiogénese através da secreção de citoquinas pró-angiogénico na SCCHN. As citocinas incluídos IL6, IL8 e VEGFA, e isso foi confirmado por qPCR e ELISA. O efeito pró-angiogênico do GPR4 foi observado pelo ensaio formação do tubo e modelo CAM.

A angiogênese é uma das marcas de câncer [26]. Os tumores não podem crescer além de um tamanho crítico ou metástase para outro órgão sem vasos sanguíneos [27], para que eles devem recrutar novos vasos sanguíneos, a angiogênese. O ‘switch angiogênico’ é equilibrado por moléculas pró-angiogénicos e anti-angiogênicos [27]. Um dos sinais que desencadeiam essa opção é baixo pH. Nas células de melanoma humano, pH ácido aumenta a expressão dos factores pró-angiogénico VEGFA IL8 e [28]. GPR4 predominantemente funciona como um sensor de protões e é expressa endógeno em HMEC-1 e HUVEC. acidose extracelular pode activar GPR4 e levar à produção de cAMP [29]. acidose hipercápnico também pode activar GPR4 para estimular a expressão da molécula de adesão de HUVEC e adesividade [30]. Noutro estudo, demonstrou-se que GPR4 desempenhado um papel essencial no crescimento, migração, e a formação de tubos por células endoteliais, mas as alterações de pH não poderia regular a produção de cAMP em HMEC-1 e de HUVEC [31]. Em HUVEC, acidose GPR4 activa e aumenta a expressão de IL-1, IL-2, IL-6 e IL8 [32]. GPR4, como um sensor de pH, é completamente activada a pH ácido de 6,8 e parcialmente activada na gama fisiológica (pH 7,4-6,8) [33, 34]. O refluxo gastroesofágico é um evento comum em pacientes com cancro da cabeça e pescoço [3], o que significa que a mucosa e carcinoma são muitas vezes expostos a um pH baixo. A relação entre pH baixo e na angiogénese tumoral SCCHN não tem sido bem estudada. Neste estudo, sugerimos que, em células Ad-null-FaDu e Ad-null-Tca8113, baixo pH não poderia aumentar a expressão de IL6, IL8 e VEGFA. Nas células DA-GPR4, a expressão de IL6, IL8, e VEGFA aumentou significativamente em comparação com o controlo, a pH 5,9 mas não em pH 6,8 e pH 7,4, o que pode indicar que GPR4 está totalmente activada a pH 5,9 em SCCHN e este é consistente com nosso estudo anterior [12].

o ensaio de formação do tubo e modelo CAM verificou o efeito pró-angiogênico do GPR4. CM derivado de células DA-GPR4-FADU induzida tubos mais longos em células HMEC-1 e densidade mais vascular na CAM do que nos outros grupos a pH 5,9. Os anticorpos neutralizantes de IL6, IL8 e VEGFA reduziu os comprimentos de tubo de células HMEC-1, que indica que a angiogénese induzida por GPR4 IL6, IL8 e secreção de VEGF. VEGFA e IL6 são reconhecidos como as principais moléculas pró-angiogénicos em SCCHN e têm sido relacionados com a agressividade da doença e pior prognóstico do paciente [35-40]. IL8, um produto final da via VEGF, foi também observada a níveis elevados em SCCHN [40]. Devido ao papel importante da angiogénese em progressão tumoral, agentes anti-angiogénicos têm sido desenvolvidos. Em xenoenxertos de SCCHN FaDu, a administração a longo prazo de bevacizumab, um anticorpo do factor de crescimento endotelial vascular, efectivamente modulado eficácia quimioterapêutico [41]. Na fase II de ensaios clínicos em pacientes SCCHN, bevacizumab mais cetuximab e quimioterapia mostraram encorajadores resultados de eficácia [42, 43]. Superexpressão de IL8 levou a resistência ao bevacizumab em SCCHN, de modo co-alvo de VEGF e IL8 pode ajudar a superar a resistência e aumentar a eficácia terapêutica.

medicamentos antiácidos, incluindo antagonista do receptor de histamina 2 (ARH2) e inibidores da bomba de protões (IBP ) são sempre usados ​​no tratamento de pacientes SCCHN. Alguns estudos revelaram que o uso de medicamentos anti-ácido pode ter benefícios terapêuticos significativos para os pacientes SCCHN [44, 45]. Um dos mecanismos que podem ser porque os medicamentos anti-ácido pode modular a adesão de células de tumor ao endotélio [44]. No presente estudo, demonstrámos que promove GPR4 factores pró-angiogénicos secreção a pH ácido. Estes resultados indicam que a inibição da GPR4 ou pH ácido pode conduzir à inibição de angiogénese tumoral. Assim, especula-se que um outro mecanismo provável é que os medicamentos anti-ácido pode inibir a secreção de factores pró-angiogénicos por aumento do pH, e, em seguida, reduzir a angiogénese, que desempenha um papel crítico durante a progressão tumoral. Anteriormente, mostrámos que o pH extracelular ácida aumenta a expressão de metaloproteinases da matriz (MMP), através da via de sinalização de ERK em células GPR4 sobre-expressos. Neste estudo mostramos que GPR4 poderia aumentar a fosforilação de p38, a pH 5,9, o qual poderia ser inibida por SB203580. SB203580 poderia reduzir a expressão de citoquinas pró-angiogénicas, as quais podem indicar p38 desempenham um papel importante na mediação da expressão de citocinas.

Em conclusão, nós sugerido que induz a angiogénese através GPR4 IL6 mediada por p38 induzida por GPR4, IL8 e VEGFA secreção no pH extracelular ácida em SCCHN.

Informações de Apoio

S1 Fig. GPR4 estimula a secreção de citocina com pH ácido em células Tca8113.

Total de ARN e de proteínas de células DA-GPR4-Tca8113, as células DA-null-Tca8113 foram isolados depois da estimulação de ácido durante 6 h. qPCR e Western blot foram realizados. (A) A sobre-expressão de GPR4 nas células DA-GPR4-Tca8113 foi confirmados por qPCR e Western blot. (B) A expressão de IL6, IL8, e VEGFA aumentou significativamente em células infectadas GPR4 a pH 5,9. (C) Os sobrenadantes das células foram recolhidos e as concentrações de IL6, IL8 e VEGFA foram detectados por ELISA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s001

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S2 Fig. SB203580 reduz a secreção de citoquina por inibição da fosforilação de p38 em células Tca8113.

(A) nas células DA-GPR4-Tca8113, SB203580 reduz a expressão de IL6, IL8 e VEGFA a pH 5,9. (B) SB203580 reduzida secreção de IL6, IL8 e VEGFA. (C) GPR4 aumento da fosforilação de p38 em pH5.9. (D) SB203580 inibir a fosforilação da p38 em células infectadas GPR4

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s002

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S3 Fig. Os efeitos de anticorpos de neutralização pode ser revertida pela adição do excesso de quantidade de IL6, IL8 ou VEGFA no ensaio de formao de tubo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s003

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S4 Fig . ensaio tubo de formação de células Tca8113.

(A) o comprimento do tubo (setas) de células HMEC-1 foi aumentado em CM derivado de células Ad-GPR4-Tca8113 em comparação com células Tca8113 Ad-nulo-no pH 5,9. (B) Os anticorpos neutralizantes de IL6, IL8 e VEGFA inibiu a formação de tubo em células HMEC-1. anticorpo isotipo IgG foi usado como um controle na neutralização teste de anticorpos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s004

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S5 Fig. As células Ad-GPR4-Tca8113 recrutou mais vascular do que as células Ad-null-Tca8113 apenas com pH 5,9 em modelo CAM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s005

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S1 Arquivo . ficheiro Excel contendo os dados de suporte de informação deste estudo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s006

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Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Pingzhang Wang ( Departamento de Imunologia da Faculdade de Ciências Médicas básicas, Peking University Health Center Ciência; Centro Universitário Peking para a doença Human Genomics) para a análise bioinformática

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