Abstract

esferóides de células cancerosas cultura de um biorreator versátil adequado para a cultura de células em suspensão dinâmica em condições de tensão de cisalhamento ajustáveis ​​foi desenvolvido e preliminarmente testadas. Ao adotar soluções tecnológicas simples e evitando componentes rotativos, o biorreator explora a hidrodinâmica laminares que estabelecem dentro da câmara de cultura permitindo suspensão de células dinâmica em um ambiente favorável ao transporte de massa, sob uma ampla gama de condições de tensão de cisalhamento ajustáveis. A fase de concepção do dispositivo tem sido apoiado pela modelagem multifísica e forneceu uma análise abrangente dos princípios de funcionamento do biorreator. Além disso, um exemplo explicativo é aqui apresentado com multifísica simulações utilizadas para definir as condições de funcionamento biorreator adequadas para preliminar

in vitro

testes biológicos em uma linha de células de carcinoma de pulmão humano. Os resultados biológicos demonstram que a suspensão de cisalhamento dinâmico ultrabaixo fornecida pelo dispositivo é benéfico para esferóides de células cancerosas de cultura. Em comparação com o controlo da suspensão estática, suspensão de células dinâmica preserva características morfológicas, promove a ligação intercelular, aumenta o tamanho do esferóide (aumento de 2,4 vezes) e no número de células em divisão (aumento de 1,58 vezes), e reduz os danos dupla fita de DNA (1,5 vezes redução). Prevê-se que a versatilidade deste biorreactor poderia permitir o estudo e a expansão de diferentes tipos de células no futuro

citação:. Massai D, L Isu, Madeddu D, L Cerino, Falco A, Frati C, et ai . (2016) A Versátil biorreator de cultura de suspensão celular dinâmico. Aplicação às Spheroids celular Cultura de Câncer. PLoS ONE 11 (5): e0154610. doi: 10.1371 /journal.pone.0154610

editor: Maurizio Pesce, Centro Cardiológico Monzino, ITALY

Recebido: 23 de dezembro de 2015; Aceito: 15 de abril de 2016; Publicado em: 04 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Massai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento: Este trabalho recebeu financiamento parcial a partir de (1) a Cooperação Europeia FP7 – Collaborative Projeto “Bioactive altamente poroso e injetável Scaffolds Controlling Stem recrutamento celular, proliferação e diferenciação. e ativando Angiogenesis para cardiovasculares Engineered tecidos “- BIOSCENT, 2009-2013 (ID 214539), e (2) a 2.012 Projeto Nacional Italiano PRIN” a Bioprocessos para a Optimização de 3D construções para Cardiac Medicina regenerativa Cardiosphere baseado em “- BEAT3DHEART de 2014 -2017 (20123E8FH4), bem como o financiamento adicional interna de Politecnico di Torino e Università degli Studi di Parma. Bioexpansys Srl forneceu apoio financeiro sob a forma de salário para GFDL autor e materiais de pesquisa, mas não teve nenhum papel adicional no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. As funções específicas dos autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e os autores deste manuscrito tem os seguintes interesses concorrentes: Giuseppe D’Urso Falvo Labate serve como CEO para Bioexpansys Srl, o distribuidor do dispositivo cultura dinâmica. Nenhum dos autores recebeu honorários ou taxa de consultoria em escrever este manuscrito. Não foram relatados outros potenciais conflitos de interesse relevante para este artigo. Nem Bioexpansys Srl nem qualquer outra empresa privada ter tido qualquer papel na concepção do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. As condições de Dr. Falvo D’Urso Labate ou quaisquer outros autores emprego não alteram os autores adesão a PLOS ONE políticas sobre partilha de dados ou materiais.

Introdução

A produção em larga escala de células é um passo obrigatório para configurar economicamente viável em modelos experimentais in vitro para pesquisa básica, modelagem de doenças e testes de drogas, e para traduzir definitivamente estratégias de engenharia de tecidos e medicina regenerativa para a prática clínica para aplicações terapêuticas. No entanto, escalabilidade e padronização nos processos de fabricação de celulares ainda são grandes desafios. Em particular, quando um grande número de células (10

10-10

12) são obrigatórios, bidimensionais (2D) estratégias de cultura convencionais, baseadas principalmente no Manual, as intervenções extremamente espaciais e de trabalho intensivo, são praticamente e financeiramente insustentável [1-5].

em uma perspectiva de aumento de escala e inspirado pelos processos de fabrico de terapêutica na indústria biofarmacêutica [6,7], tridimensional cultura em suspensão (3D) tem demonstrado ser uma alternativa vantajosa para monocamada técnicas para expansão em larga escala de células [4,5,8,9]. Em detalhe, os métodos de suspensão têm sido amplamente adotados: (1) para a expansão escalável e controlada de células-tronco [10-15] e células cancerosas [16-18]; (2) para guiar a diferenciação de células estaminais [13,19-22]; (3) para a produção de esferóides celulares e construções de tecido semelhante a [23-25]. A prestação de um ambiente de cultura de suspensão 3D, simulando o microambiente do nicho celular, tem provado ser benéfica, promover a sobrevivência das células e reter célula propriedades funcionais

in vitro

[9,26,27]. Além disso, quando a suspensão é obtida por mistura dinâmica do meio de cultura, (1) a formação de gradientes em, por exemplo, temperatura, pH, oxigénio dissolvido, nutrientes /metabolitos é impedido, (2) o transporte de oxigénio e nutrientes é aumentada, e (3) a sedimentação de células cultivadas /construções é evitado, indo assim além das limitações intrínsecas dos sistemas de cultura estática [4,7,9,28].

Hoje em dia, a cultura suspensão dinâmica para a produção e diferenciação escalável de células é realizada principalmente por tanque agitado e biorreactores rotativas [2,4]. Tais dispositivos são projetados para oferecer um ambiente de cultura homogênea em 3D e para permitir o acompanhamento e controle dos parâmetros de cultura, levando a processos mais reprodutíveis, robustos e de baixo custo [5, 29,30,31]. No entanto, a maioria destes biorreatores ainda sofrem de problemas críticos, limitando o upscaling ea padronização dos processos biológicos de expansão. No que diz respeito biorreatores de tanque agitado, o seu desempenho pode ser afectada por (1) colisões das células com o impulsor e (2) o início do fluxo turbulento, que tanto pode induzir não-fisiológicos tensões mecânicas e hidrodinâmico-cisalhamento sobre as células e conduzem a os danos celulares. Além disso, estas condições desfavoráveis ​​pode afectar a taxa de crescimento celular e o metabolismo, interferir com pluripotência das células estaminais, e limitar a eficiência e a reprodutibilidade do processo de cultura [4,9,28,30,32,33]. biorreactores rotativas gerar um ambiente de cultura de stress de baixo cisalhamento, o que permite superar parcialmente as limitações dos dispositivos de tanque agitado. No entanto, a complexidade das soluções tecnológicas adoptadas para rotação tornar estes dispositivos não são facilmente escaláveis ​​e não adequados para a substituição meio contínuo e monitoramento em tempo real [4].

Nós apresentamos aqui um biorreator versátil adequado para a tensão de cisalhamento sintonizável dinâmica a cultura de células em suspensão. Em pormenor, mediante a adopção de soluções tecnológicas simples e evitando os componentes rotativos, do bioreactor proposto permite suspensão de células, assegurando um regime de fluxo laminar, mistura, garantindo assim o transporte de nutrientes e de oxigénio e meio de cultura, em última análise homogénea sob uma ampla gama de condições de tensão de cisalhamento.

a fim de ir além da abordagem de tentativa-e-erro experimental e para chegar a uma compreensão mais profunda da dinâmica de fluidos em desenvolvimento dentro do ambiente de cultura [34,35], a fase de design do dispositivo tem sido apoiado por em multifísica silico modelagem, fornecendo uma análise abrangente dos princípios de funcionamento do biorreator. Além disso, os resultados das simulações multifísica serviu como critérios para definir as condições de funcionamento biorreator adequadas para

in vitro

testes preliminares. Em particular, este primeiro estudo foi focado na avaliação da adequação do biorreator como tensão de cisalhamento dispositivo de suspensão dinâmica ultralow para a cultura de esferóides de células cancerosas. Para este fim, a linha de células de carcinoma do pulmão Calu-3 humana foi submetido a suspensão de cisalhamento dinâmico ultrabaixo fornecida pelo dispositivo. Os resultados biológicos indicam que esta abordagem mantém o crescimento de células de cancro

In vitro

, incluindo a formação de esferóides, e sugerem a adequação do bioreactor proposto para a investigação sobre as propriedades funcionais de células e para a expansão de diferentes tipos de células.

Materiais e Métodos

biorreator suspensão dinâmica

o design do aparelho (Fig 1A) foi impulsionado por dois requisitos principais: (1) para fornecer cultura de suspensão dinâmica com mistura adequada; (2) para garantir um ambiente de cultura sintonizável ultra baixa a moderada de tensão de cisalhamento, ajustável em função dos requisitos de cultura, modificando as condições de funcionamento. Estes objectivos foram conseguidos combinando as características geométricas peculiares da câmara de cultura de biorreactor com a recirculação contínua do meio de cultura assegurado por um circuito de recirculação em circuito fechado, evitando a utilização de impulsores e /ou componentes rotacionais. Essa combinação promove o estabelecimento de vórtices flutuantes dentro da câmara de cultura, que mantêm células /construções em suspensão dinâmica, minimizando a sua sedimentação.

(A) sorteio esquemática do biorreator mostrando seus componentes internos e sua simetria axial (vermelho linhas). (B) Imagem do biorreator. (C) Representação esquemática da configuração do bioreactor ligado ao circuito de anel de recirculação fechada e posicionada no interior da incubadora.

O bioreactor (Figura 1B, as dimensões externas = 95 x 70 mm x 70 milímetros) é constituído por: uma base de aço inoxidável AISI 316L; uma câmara de cultura de policarbonato para a habitação as células /construções (volume da câmara = 75 mL); uma tampa de policarbonato. A curvatura e forma da parede interna da câmara de cultura foram desenhados e optimizados para a geração de vórtices de flutuação para suspensão de amostra (tal como detalhado na seguinte). As células em suspensão /construções estão confinados no interior da câmara de cultura por meio da presença de (1) um aço inoxidável válvula de retenção unidireccional AISI 316L (que evita o refluxo e garante uma entrada de fluxo simétrica), e (2) filtro de forma permeável de uma cultura ( Durapore

®, MerckMillipore, Alemanha), que impede saídas acidentais de células. O bioreactor é parte de um circuito fechado para a recirculação do meio de cultura oxigenado (Fig 1C). circuito de recirculação tais é composto de um reservatório de meio de, tubagem de silicone curado com peróxido de oxigénio-permeável (Masterflex L /S

®, Cole-Parmer, IL, EUA) com acoplamentos de desconexão rápida, e uma bomba peristáltica (Masterflex L /S

®, Cole-Parmer, IL, EUA), para um volume de trabalho total de aproximadamente 200 ml. A fim de garantir o fornecimento adequado de oxigénio no interior da câmara de cultura, o circuito de recirculação foi dimensionados utilizando um modelo de balanço de massa de oxigénio analítico de acordo com Orr et ai. [36].

O princípio de funcionamento do biorreactor baseia-se na recirculação contínua do meio de cultura no interior da câmara de cultura em regime de escoamento laminar, obtido por meio da modulação da taxa de fluxo do circuito de recirculação, a fim de produzir de ultra baixa a moderada condições suspensão dinâmica de tensão de cisalhamento. Em detalhe, o meio flui através da válvula de retenção, impulsionado pela bomba peristáltica contra o gradiente de pressão estática, e permeia a câmara de cultura. Sucessivamente, o meio passa através do filtro e flui para fora a partir da tampa, movendo-se de volta para o reservatório num processo de circuito fechado contínuo. A formação de vórtices flutuantes no interior da câmara de cultura permite a suspensão dinâmica das cultivadas células /construções (S1 Filme).

Modelos computacionais

A abordagem multi computacional apoiaram o projeto e as fases de otimização de o dispositivo, permitindo a identificação de (1) a geometria óptima da câmara de cultura, e (2) as condições de funcionamento para a cultura de células em suspensão dinâmico sob valores de tensão de corte definida. Um grande número de simulações foi realizada variando as dimensões tanto células /construção (em termos de diâmetro) e as densidades de inoculação de células altamente diluídas, de modo a estudar a sensibilidade do fluxo de fluido para estes parâmetros de cultura dentro do volume da câmara.

Tecnicamente, aproveitando a simetria axial do dispositivo (Figura 1A), um conjunto de simulações numéricas dependentes do tempo com simetria radial foi realizada utilizando um software comercial de volume finito personalizado baseado em técnica (fluente, ANSYS Inc., PA, EUA). O domínio de fluido foi discretizado utilizando software ICEM CFD (ANSYS Inc., PA, EUA). A cardinalidade de malha igual a 6.5×10

3 células quadrilateral foi considerada. Como em estudos anteriores [21,37], a presença concomitante de meio de cultura e as células foi modelado usando o modelo multifásico euleriano-Eulerian, que permite misturas de múltiplos separados fases contudo interativas de um continuum de ser descrito. Para cada fase, as equações governantes do movimento, as equações de Navier-Stokes, foram resolvidos pelo solucionador numérico. O meio de cultura, considerada como a fase primária, foi assumido como sendo Newtoniano com propriedades físicas dos meios de cultura utilizados tipicamente em aplicações de cultura de células (1×10 = viscosidade dinâmica

-3 Pa.s, densidade = 1000 kg /m

3) [21]. As células em suspensão, considerada como a fase imersa secundário, foram modeladas como grânulos esféricos não deformáveis. No exemplo explicativo relatado neste trabalho, uma densidade igual a 1070 kg /m

3 [38] e um diâmetro médio igual a 20 um (isto é, o diâmetro medido das células cancerosas Calu-3) foram considerados. A presença do filtro foi modelada como um meio poroso caracterizado por um valor de Darcy resistência hidráulica igual a 96×10

4 m

-2 para o meio de cultura e definindo a resistência hidráulica máxima aceite pelo agente de resolução (1×10

20 m

-2) para as células, tendo o filtro de um tamanho médio de poro de 5 um, assim sendo impermeável para eles. inoculação das células foi assumido como sendo uniforme na região inferior da câmara de cultura. Esta suposição foi traduzida para a prescrição quadro computacional, como condição inicial, uma fracção de volume uniforme (VF) ocupada pelas células (fase secundária) na região recipiente inferior (10 ml, no exemplo explicativo utilizando a linha de células Calu-3) . As simulações foram realizadas considerando sempre culturas altamente diluídas de suspensão (números de Stokes muito mais baixas do que 1, o valor VF inferior a 1%), para que as variações na VF inicial não significativamente afectar o campo de fluxo da fase primária. Como um valor limite indicativos de sedimentação, um valor VF superior a 20% foi considerado, o que corresponde a aproximadamente um terço do limite máximo de embalagem 63%, isto é, o limite de embalagem para grânulos esféricos não deformáveis ​​regularmente embalado [21]. Simulações foram estendidas sobre os valores de taxa de fluxo na gama de 5-120 ml /min, com um tempo de cultura simulada igual a 60 min, o que foi considerado suficiente para descrever totalmente a dinâmica do meio de cultura no interior da câmara. O esquema simples acoplados à fase foi utilizada para o acoplamento pressão-velocidade. A segunda ordem Upwind e a formulação RÁPIDA foram usadas para a discretização espacial do impulso e o transporte de fase secundária, respectivamente. Detalhes relacionados com o modelo de equações e condições de contorno são relatados em S1 texto.

Além disso, a fim de investigar a influência da mistura dinâmica que cria no interior da câmara de cultura sobre a evolução de quantidades físicas e ambientais, o transporte de um quantidade escalar dentro da câmara de cultura foi modelado. Em detalhe, o transporte de oxigénio dissolvido no meio que flui no interior da câmara de cultura foi simulada através da resolução da equação de transporte advection /difusão, juntamente com as equações de Navier-Stokes. Um meio de cultura totalmente anóxica no interior da câmara de cultura foi considerada como condição inicial (o pior caso). Este modelo computacional pode ser generalizada para todas as espécies dissolvidas caracterizadas por números de Péclet semelhantes (isto é, a relação entre as taxas de transporte advectivas e difusora). Detalhes sobre premissas e equações do modelo são relatados em S2 texto.

In vitro

cultura de células

O desempenho do biorreator foi explicativa testado no quadro cultura dinâmica ultralow tensão de cisalhamento (impondo uma taxa de fluxo de 5 mL /min), como identificado a partir do análogo in silico da experiência in vitro (ver resultados). A linha de não pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC) célula (American Type Culture Collection, ATCC, VA, EUA) Calu-3 foi seleccionado e os resultados da cultura dinâmica foram comparados com um controlo de cultura em suspensão estática. Em detalhe, as células foram cultivadas em meio completo de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM, Sigma Aldrich, MO, EUA) adicionado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 1% de penicilina /estreptomicina (P /S) e 1% de não-Essencial aminoácidos (NEAA, Sigma Aldrich, MO, EUA), e mantidos em condições padrão de cultura de células a 37 ° C numa atmosfera saturada de água de 5% de CO

2 no ar. Após expansão em frascos de cultura de células, 9×10

6 células Calu-3 (1.92×10

5 células /mL) foram inoculados no interior da câmara de cultura de biorreactor e cultivadas durante 5 dias em suspensão dinâmico com meio de crescimento completo. O biorreactor foi operado a uma velocidade de fluxo de 5 mL /min. Em paralelo, células Calu-3 foram semeadas à mesma densidade em frascos de cultura de fixação de baixo (Corning Inc., Nova Iorque, EUA), utilizado como controlo, que representa um modelo de cultura em suspensão estática. Após 5 dias, as células cultivadas em suspensão dinâmicas e estáticas foram resgatados do biorreactor e a partir do frasco de cultura de fixação de baixo, respectivamente, e re-suspensas em meio de crescimento fresco, para posterior análise. Três culturas de suspensão estáticos e dinâmicos independentes foram realizadas.

As avaliações de

in vitro cultura de células

Calu-3 células colhidas do biorreator e do frasco de cultura de baixo apego e re-suspensas em meio de crescimento fresco foram investigadas por microscópio invertido (Olympus CK40, Japão). Microfotografias foram recolhidas e analisadas por um software de análise de imagem (imagem Pro-Plus 4.0, Media Cybernetics, EUA) a fim de (1) para calcular o número de células individuais Calu-3 e o número de Calu-3 células formadoras os esferóides, e (2) para determinar os tamanhos esferóides.

Além disso, as células Calu-3 a partir de cultura em suspensão estática e dinâmica foram processadas para análise de Microscopia Electrónica de Transmissão (MET) e por imunocitoquímica. Para a análise de TEM, as células Calu-3 foram fixadas em solução de Karnovsky (formaldeído a 4%, 5% de glutaraldeído). As amostras foram fixadas posteriormente em 1% de tetróxido de ósmio e desidratada através do aumento da concentração de álcool. Em seguida, as amostras foram lavadas com óxido de propileno e embebido em resina epoxi. Secções de 0,5 mm de espessura foram corados com azul de metileno e safranina para selecionar morfologicamente o campo de interesse. Subsequentemente, secções ultrafinas foram recolhidos numa grelha de cobre de malha 300 e, após coloração com acetato de uranilo e citrato de chumbo, foram examinados qualitativamente sob MET (Philips EM 208S, Países Baixos). Para avaliar a fracção de células em ciclo celular activo, a presença de ADN reversível quebras de cadeia dupla, bem como a morte celular por apoptose, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e citocentrifugada sobre uma lâmina de vidro para se obter uma densidade de 10

5 células por local. manchas celulares foram coradas por anticorpos anti-Ki67 (Ki67, monoclonal de ratinho, DAKO, Itália) e anti-histona H2AX gama (γH2AX, policlonal de coelho, Bethyl Laboratories, TX, EUA) e revelada por DAB (3,3′-diaminobenzidina) peroxidase (HRP) reacção estojo de substrato (Dako, Itália). A avaliação quantitativa da fracção de células positivas e Ki67 γH2AX foi realizada através do cálculo do número de núcleos positivos ao longo de um total de 900-2000 núcleos contados em cada amostra analisada. A morte celular por apoptose ao nível de uma única célula foi investigada usando o In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein ensaio (solução enzimática TdT, solução da etiqueta de fluoresceína-dUTP, Roche). positividade de fluorescência nuclear verde foi medida usando microscópio Olympus BX60. Os núcleos foram reconhecidas pela fluorescência azul de 4 ‘, 6-diamidinas-2-phenyndole (DAPI, Sigma, Itália). A fracção de células mortas foi avaliado por contagem do número de núcleos apoptóticos ao longo de um total de cerca de 1000 células. Os dados foram analisados ​​utilizando o teste ANOVA one-way. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando p 0,05. De modo a investigar o possível adesão acidental de células /esferóides no filtro após 5 dias de cultura dinâmico no interior do biorreactor, o filtro foi fixado com paraformaldeído a 4% e incubou-se com DAPI, durante 15 minutos à temperatura ambiente, e sucessivamente investigada por microscopia de fluorescência para avaliar a presença de núcleos na sua superfície. Finalmente, a fim de avaliar a presença de Calu 3-células e sedimentação na região inferior da câmara de cultura aderiram, depois de célula resgatar a parede interna da câmara de cultura foi rasped por um raspador de células e lavadas com tampão fosfato salino (PBS) . O PBS foi, portanto, coletadas dentro de uma placa de Petri e observado por microscópio invertido para detectar a presença de células Calu-3.

Resultados

A dinâmica de fluxo dentro dos

câmara de cultura biorreator

multifísica simulações numéricas permitiram caracterizar o campo de fluxo dentro da câmara de cultura de biorreactor. A Fig 2 mostra representações esquemáticas das estruturas de fluxo médias típicas que estabelecem no interior da câmara de cultura, que resultam da interacção mútua entre o suporte (fase principal) e as células /construções (fase dispersa), dependendo da taxa de fluxo imposta. Em pormenor, no caso de valores de taxa de fluxo inferior a 20 mL /min (Fig 2A e 2A1), a transmissão forma para a câmara de cultura através da válvula tem energia suficiente para não interagem significativamente com a parede lateral da câmara de cultura. O equilíbrio entre as forças hidrodinâmicas e gravitacionais leva à formação de um grande vórtice dinâmica flutuante localizados longe da parede da câmara (Fig 2A1). Este vórtice flutuante está rodeado por estruturas de turbilhão menores localizados mais perto da parede, que asseguram a suspensão das células em cultura e aumentar a mistura e de transporte (Fig 2A1). Como um exemplo, a Fig 3 mostra a evolução no tempo da VF ocupado pelas células em suspensão dentro da câmara de cultura, obtido simulando a presença de 9×10

6 células inoculadas (inicial VF = 0,48%) e a imposição de um valor de taxa de fluxo de 5 ml /min (ultrabaixo condição de tensão de corte, de forma semelhante ao teste in vitro experimental). Pode-se observar que as células cultivadas são mantidos na sua maioria uniformemente distribuída na região inferior da câmara de cultura. Em pormenor, depois de um transiente de cerca de 5 min, a 95,3% das células inoculadas são suspensas a um valor médio de VF de cerca de 0,33%, o que é próximo do valor VF inicial (0,48%), com o pico da função de densidade de probabilidade valor (PDF) igual a 2,5, o que corresponde a valores de VF entre 0 e 0,5% (Figura 4A). Na parte inferior da câmara de cultura, um pequeno volume de cerca de 194 uL é caracterizado por um valor VF a cerca de 6%, o que envolve apenas o dinamicamente 2% das células inoculadas (Figura 3). Este valor de embalagem é mais do que três vezes mais baixa do que o valor limiar de sedimentação que foi definido (20%) e cerca de dez vezes menor do que o limite máximo de embalagem 63%. Notavelmente, quando uma taxa de fluxo inferior a 20 mL /min é adoptado, a distribuição dos valores de tensão de cisalhamento experimentado pelas células dentro da câmara de cultura revela que os níveis mais altos de tensão de cisalhamento são mais baixos do que 1 MPa (Figura 4B), com a média e mediana valores próximos de 1×10

-2 mPa (a chamada condição de tensão de cisalhamento ultralow).

visualização de refluxo campo da interacção mútua entre o meio (fase preliminar) e as células /construções (fase dispersa) dentro a câmara de cultura para ultralow (a e A1) e baixa a moderada (B e B1) condições de tensão de cisalhamento. campo de fluxo é representado usando ambas as linhas lineares integrais de convolução (A e B), e uma representação Streamline clássica (A1 e B1). Setas amarelas indicam a entrada e saída de fluxo. setas azuis indicam os vórtices flutuantes primários. As setas vermelhas indicam os vórtices secundários.

Gráficos de contorno da evolução temporal da VF ocupado pelas células em suspensão dentro da câmara de cultura biorreator de 0 a 60 min de tempo simulado, com uma taxa de fluxo imposto de 5 ml /min (ultrabaixo condição de tensão de cisalhamento, de modo semelhante ao experimental teste in vitro) e 9×10

6 células inoculadas (VF inicial = 0,48%). Depois de um transiente de cerca de 5 min, a 95,3% das células inoculadas são suspensas a um valor médio de VF de cerca de 0,33%, muito próxima do valor inicial de VF. Na parte inferior da câmara de cultura, um pequeno volume de cerca de 194 uL é caracterizado por um valor VF a cerca de 6%, mais do que três vezes mais baixa do que o valor limiar de conjunto de sedimentação (20%), que envolve de forma dinâmica somente a 2% de as células inoculadas.

funções de densidade de probabilidade (pdf) de células VF (a) e tensões de cisalhamento (B) valores vividos pela fase de celular dentro da câmara de cultura biorreator depois de 60 min, com um fluxo de imposto taxa de 5 mL /min e 9×10

6 células inoculadas

o aumento da taxa de fluxo para além de 20 mL /min promove a ocorrência de efeito Coanda [39] dentro da câmara de cultura biorreator:. o jato que entra na câmara de cultura é atraído para a parede mais próxima e, devido à curvatura da parede peculiar, uma região de separação ocorre longe da parede de fundo da câmara (Fig 2B e 2B1). Como resultado, uma grande vórtice flutuante dos ponteiros do relógio, que contrabalança a força gravitacional e, assim, mantém células /construções em suspensão, é gerado (Fig 2B1). Perto da parede exterior, um vórtice ainda menor se desenvolve, o que pode desempenhar o papel benéfico de aumentar a mistura e a suspensão das construções flutuantes (Fig 2B1). A adopção de uma tal margem de caudal (30-120 mL /min), enviesada distribuição de tensões de cisalhamento direita foram obtidos, com valores médios que variam de 2 a cerca de 7 MPa, com valores de tensão de pico de cisalhamento dentro da câmara de cultura inferior a 50 MPa (baixa a moderada condição de tensão de cisalhamento, ver detalhes no S3 texto).

no que diz respeito ao transporte de oxigênio dissolvido dentro da câmara de cultura imposição de uma condição inicial totalmente anóxica para o meio, a simulação numérica mostra claramente que, dentro de 840 s ( 14 minutos) a pressão parcial do oxigénio dissolvido é reposto em mais de 90% do volume da câmara de cultura (S2 filme, S2 texto). Os resultados obtidos podem ser generalizados para o transporte de outras espécies dissolvidas no meio de cultura, porque o seu transporte é caracterizado por um número de Peclet de dois a três ordens de magnitude maior do que a unidade, o que confirma que as estruturas de fluido que estabelece no interior da câmara de promover o transporte de oxigénio dissolvido e nutrientes através de mistura, assim homogeneizar a sua concentração.

In vitro

resultado cultura

Depois de 5 dias de cultura em suspensão, as células foram resgatados a partir do balão de baixa cultura de fixação (suspensão estática ) e a partir da câmara de cultura de biorreactor (suspensão dinâmica). Em primeiro lugar, elas foram analisadas morfologicamente: observada por microscopia de contraste de fase, Calu-3 cultivadas sob as células individuais suspensão mostrar estáticos ou aglomerados muito pequenos (Figura 5A), enquanto que células cultivadas no biorreactor sob suspensão dinâmico mostrar claramente a formação de esferóides (Fig 5B ). Em particular, a proporção entre células Calu-3 formam os esferóides e células Calu-3 individuais é de 59,7 para Calu-3 a partir de células colhidas do frasco de cultura de fixação de baixa e 76,0 para Calu-3 células cultivadas dentro do biorreactor.

Após 5 dias de cultura em suspensão, (a), Calu-3 células de cultura em suspensão estática mostrar células individuais ou agrupamentos muito pequenos, (B) Calu-3 células cultivadas em suspensão dinâmico mostrar a formação de esferóides. Escala de barras 200 mm.

Além disso, a análise ultra-estrutural por TEM permite observar que Calu-3 a partir de suspensão estática são parcialmente ligados por junções de aderência fracos e minúsculas (Fig 6a e 6A1), com alterações morfológicas ( Fig S1). Por outro lado, os esferóides colhidas a partir da câmara de cultura biorreator são 2,4 vezes (p 0,001) maior (área média = 23699 ± 5645 mm

2) do que aglomerados resgatados a partir do balão de baixa cultura de fixação (área média = 9787 ± 2,202 mm

2), e são compostas por células caracterizadas pelas características morfológicas típicas de Calu-3, tais como nucléolos proeminentes e membranas microvilosidades (Fig 6B), com junções de aderência bem desenvolvidos (Fig 6B1).

as imagens TEM mostram (a) um pequeno aglomerado (3 células) de células Calu-3 cultivadas em suspensão estática, e (B) um esferóide maior (9 células) de Calu-3 células cultivadas dentro do biorreactor, colhidas tanto após cinco dias de cultura em suspensão. nucléolos proeminentes (N: núcleos), estruturas citoplasmáticos e microvilosidades orientadas longitudinalmente e transversalmente são traços característicos da linha de células NSCLC Calu-3. visualizações de alta ampliação de áreas incluídas na rectângulos pretos em painéis A e B mostrados, respectivamente, (A1) uma única junção adesão pequena (seta) entre as células cultivadas em suspensão estática e (B1) várias junções de aderência bem desenvolvidos (setas) desenvolveram por Calu-3 cultivadas no biorreactor. Barras de escala: A e B = 5 uM; A1 e B1 = 1 uM.

Estas observações são suportados pela avaliação de Ki67 imunocoloração, o que indica que a fracção de células em divisão Calu-3 é significativamente superior (aumento de 1,58-vezes) quando cultivadas in dinâmica ao invés de em condições de suspensão estáticos (Figura 7A). Além disso, a partir da quantificação do DNA rupturas de filamentos duplos, é possível observar uma tendência de queda (redução de 1,5 vezes, mesmo que não seja estatisticamente significativo) na fração de γH2AX

pos Calu-3 células cultivadas dentro do biorreator comparação para as células cultivadas em suspensão estática (Fig 7B). Isto é confirmado pelo ensaio de morte celular por apoptose, na verdade, a fracção de células apoptóticas Calu-3 colhidas a partir do controlo da suspensão estática (46,5 ± 4,5%) foi de 16,9 vezes mais elevada do que as células colhidas a partir do bioreactor de (2,7 ± 0,2%), ( p 0,05)

(a) gráfico de barras da medição de células positivas Ki67, mostrando a fracção de células em divisão Calu-3, após a cultura em suspensão estática e dinâmica (*:. p 0,05 vs suspensão estática).