Abstract
anemia de Fanconi (FA) pacientes são altamente suscetíveis para tumores sólidos em vários locais anatômicos, incluindo região da cabeça e pescoço. Um subconjunto de cabeça e cânceres cervicais (HNCS) está associada com HPVs ‘alto risco’, particularmente HPV16. No entanto, a correlação entre oncogenes de HPV e câncer em pacientes com FA ainda é incerto. Já aprendemos anteriormente que a deficiência de FA em camundongos predispõe ratos transgénicos HPV16 E7 para HNCS. Para lidar com potencial oncogênico de HPV16 E6 sob deficiência de FA no HNCS, utilizamos ratos HPV16 E6-transgênica (
K14E6
) e camundongos HPV16 E6 /E7-bi-transgénicos (
K14E6E7
) em fundos genéticos suficiente ou deficientes para um dos
dis
genes,
FANCD2
e monitorados sua susceptibilidade à HNCS.
K14E6
ratos não desenvolveram tumores. No entanto, E6 e
FANCD2
-deficiência acelerada E7-driven desenvolvimento de tumores em
K14E6E7
ratos. O aumento da incidência do tumor foi mais correlacionado com o dano ao DNA E7-driven do que a proliferação. Nós também descobrimos que a deficiência de proteínas de bolso, pRb, p107 e p130 que são alvos de E7 bem estabelecidos, poderia recapitular indução de danos no DNA do E7. Nossos resultados suportam a hipótese de que E7 induz HNCS associadas ao HPV através da promoção de danos ao DNA através da inativação de proteínas de bolso, o que explica por uma deficiência no DNA reparação de danos iria aumentar a susceptibilidade ao câncer E7-driven. Os nossos resultados demonstram ainda mais a verificação inesperada de que a deficiência de FA não predispõe os ratos transgénicos para E6 HNCS, indicando uma especificidade na sinergia entre FA deficiência e HPV oncogenes em causar HNCS
citação:. Parque JW, Shin MK, de Pitot HC, Lambert PF (2013) alta incidência de HPV-Associated Head and Neck cancros na FA deficiente Mice está associado com a indução de E7 de danos no DNA através de sua inativação do bolso proteínas. PLoS ONE 8 (9): e75056. doi: 10.1371 /journal.pone.0075056
editor: Joseph S Pagano, The University of North Carolina em Chapel Hill, Estados Unidos da América
Recebido: 15 de julho de 2013; Aceito: 06 de agosto de 2013; Publicação: 23 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Park et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. A fonte de financiamento para este trabalho foi Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (CA098428, CA022443). NIH teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem
Introdução
Anemia de Fanconi (FA), que é uma doença genética heterogénea e recessiva rara, apresentado defeitos do desenvolvimento e das alterações de células estaminais hematopoiéticas, tais como insuficiência da medula óssea e leucemia mielóide aguda, os principais fenótipos indicadas na infância precoce dos pacientes . Até à data, 15 genes celulares (
dis
genes) foram identificadas mutações para as quais homozigóticos estão associados com a doença FA.
dis
produtos de genes (dis) está compondo uma via de reparo de DNA chamado FA percurso com várias outras proteínas celulares para ajudar a reparar o DNA danificado, especificamente DNA intercadeias ligações cruzadas (ICLs) dano. Oito proteínas de dis (fanca, B, C, E, F, G, L e M) interagem entre si e formar um complexo proteína chamada do complexo núcleo FA. Fancl no complexo, o qual tem um
E3
actividade de ubiquitina-ligase colocar mono-ubiquitina em FANCD2 /I, na resposta do dano do ADN [1]. Além disso, garfos de replicação de DNA paralisadas em fase S ativa a via FA [2]. O mono-ubiquitinada FANCD2 /I são localizadas em locais de danos no DNA onde eles interagem com outras proteínas conhecidas por estarem envolvidas na reparação do DNA danificado, tais como BRCA1, FancD1 /BRCA2, FancN /PALB2 e Rad51 levando a reparação do ADN [3, 4]. Interrupção desta via FA leva a aumento da sensibilidade ao DNA reticuladores, instabilidade cromossômica, troca de cromátides irmãs espontânea, e perturbações do ciclo celular [5,6]. Estudos recentes mostraram que FANCD2 ubiquitinadas mono-recruta moléculas efectoras críticos, tais como a nuclease de FAN1 (ou SLX 4) através dos seus domínios de ligação de ubiquitina [7,8]. Assim, mono-ubiquitinação de FANCD2 é fundamental não só para a sua localização cromatina, mas também age como um andaime para fatores de reparo de DNA específicas. A via de FA actua em conjunto com o sistema de reparação de recombinação homóloga (RH) para manter a instabilidade genómica [9]. Esgotamento de FANCD2 inibe a resposta da FC, indicando que o RH atua jusante da FANCD2 [10]. O aumento da instabilidade genómica se crê contribuir para o aumento da susceptibilidade de pacientes com FA para o cancro. O transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) poderia ser uma solução para ajudar os defeitos de células hematopoiéticas. Mesmo após o bem-sucedido transplante, carcinomas de células escamosas (CEC) na região de cabeça e pescoço tornar-se um alto risco para os pacientes [11-15].
Um subgrupo de cânceres de cabeça e pescoço (HNCS) (~ 25%) , principalmente entre tumores da orofaringe na população em geral é positivo para o vírus de papiloma de alto risco humano (HPVs), em particular de HPV tipo-16 (HPV 16) que codifica os três oncogene, E5, E6, E7 e [16,17]. Em particular, os pacientes com FA da América do Norte uma elevada percentagem (84%) de HNC resultante em vários locais na região da cabeça e pescoço (ou seja, não restritos à orofaringe) foram encontrados para ser positivo para HPV de alto risco [18]. Consistente com um papel de HPV nestes cancros, as mutações em p53, um supressor de tumor que é inactivado por HPV16 E6, não foram encontrados em HNCS destes pacientes. No entanto, em pacientes de países europeus, HNCS foram DNA HPV negativo e mais de 50% destes tumores tinham mutações p53 [18,19]. Tendo em conta estes dados clínicos conflitantes, não fica claro se HPVs desempenhar um papel importante na HNCS que surgem em pacientes com FA. Vários estudos apontam para uma contribuição de deficiência de FA na doença associada a HPV, a nível molecular. Em cultura de tecidos, a expressão de HPV16 E7 foi demonstrado para estimular a transcrição da
FANCD2
[20] e activar a via FA [21]. Em outro estudo fazendo uso de culturas organotípicas de queratinócitos humanos a recapitular o ciclo de vida HPV, HPV16 e hiperplasia epitelial induzida por HPV18 foi aumentada em
fanca
células -deficient ou em células derrubado na sua expressão; Considerando que, a restauração do
fanca
expressão atenuada este efeito [22]. Estes estudos indicam que existe uma interacção entre o HPV e a via de FA.
O nosso laboratório desenvolvido um modelo animal para HNCS associadas ao HPV utilizando ratinhos transgénicos oncogene HPV16 quando tratada com um carcinogénio químico, 4NQO, que induz aductos de DNA semelhantes aos causados por substâncias cancerígenas associadas ao tabaco synergizes com oncogenes HPV16 para induzir HNC [23]. Os cancros que surgem no nosso histopatológico share modelo animal e propriedades moleculares com HNCS HPV-positivos em seres humanos. O local em que surgem tumores é menos restritiva do que nos seres humanos, presumivelmente um reflexo do padrão de expressão HPV transgene em todo o rato por via oral /superior epitélio GI. Entre E6 e E7, HPV16 E7 tem um maior potencial para causar HNC em modelos animais [23,24] com E6 contribuindo para uma maior incidência em combinação com E7 [25]. A contribuição de HPV16 E5 para HNC neste modelo de ratinho não foi totalmente avaliada, mas parece ser muito menor do que a E7 (Strati e Lambert, resultados não publicados).
Nós previamente avaliadas a influência da FA via on a incidência de HNCS em ratinhos que expressam apenas o oncogene E7 de HPV16. A deficiência na via de FA altamente aumento da incidência tumoral E7 de HPV16-driven [26]. No entanto, em cancros humanos HPV-positivos, E7 é sempre encontrada para ser co-expresso juntamente com E6. Por isso, continuou seus estudos aqui descritos a influências de endereço FA via de carcinogênese em cabeça e pescoço no contexto de camundongos que expressam E6 sozinho ou em conjunto com E7. Especificamente, geramos
K14E6
e
K14E6E7
camundongos transgênicos em
FANCD2
fundos -suficiente e -deficient. Observou-se um aumento significativo na incidência de tumores e gravidade da doença neoplásica no
K14E6E7
/
FANCD2
– /-
ratos em comparação com o
K14E6E7 Twitter /
FANCD2
+ /+
ratos; no entanto,
FANCD2
-deficiência não aumentou tanto leitura para tumorigênese em
K14E6
camundongos que expressam E6 sozinho. Ambos HPV16 E6 e E7 provocou um aumento na frequência de células que suportam a síntese de ADN e esta foi aumentada no fundo FA-deficiente. Com efeito deficiência FA sozinho conduziu a um aumento na proliferação celular. Mas esta indução da proliferação de células não se correlacionou com a influência da via de FA em tumorigénese. Por outro lado, a frequência no epitélio da língua e do esófago de células positivas focos nuclear γ-H2AX, um marcador para a resposta a danos no ADN, se correlacionou com a incidência de tumores. Este marcador foi induzida em tecidos que expressam o oncogene E7; que, E6 não induziu a expressão deste marcador de DNA danos resposta. Além disso, dois biomarcadores, MCM7 e p16, usado para distinguir HNCS HPV-positivos da HNCS HPV-negativos foram encontrados para ser altamente regulada para cima no
K14E6E7
ratos independentemente da
FANCD2
estado do gene , o que indica que eles podem ser úteis para determinar o estatuto de HPV de HNCS resultantes em pacientes com FA. Finalmente, observamos que a deficiência na expressão das proteínas de bolso, pRb, p107, e P130, que são estabelecidas metas de E7, poderia recapitular indução de respostas danos no DNA do E7 em epitélios de cabeça e pescoço. Nosso estudo atual suporta a hipótese de que E7 induz HNC através da promoção de danos ao DNA através da inativação de proteínas de bolso. Estes dados podem explicar por que a deficiência na via FA aumenta a susceptibilidade ao câncer E7-driven.
Materiais e Métodos
Mice
K14E6
transgênico
camundongos
[27]
e camundongos transgênicos K14E7
[28] sobre o fundo genético FVB, foram cruzados com
FANCD2
knockout (
FANCD2
– /-
) ratos [29], no fundo genético 129S4, para gerar F
1 ratos,
K14E6 /FANCD2
+/-
e
K14E7 /FANCD2
+/-
(FVB /129S4 fundo misto). Todos os ratos experimental (
NTG /FANCD2
+ /+
,
NTG /FANCD2
– /-,
K14E6 /FANCD2
+ /+
,
K14E6 /FANCD2
– /-
,
K14E6E7 /FANCD2
+ /+
, e
K14E6E7 /FANCD2
– /-
ratos) eram do sexo masculino gerados pelo cruzamento F
1 ratos.
K14Cre /Rb
f /f
,
Rb f
/f /
p130
– /-
, e
K14Cre /Rb
f /f /p130
– /-
foram gerados no mesmo
FVB /129 /C57
fundo genético misturado tal como descrito previamente [30].
Rb f
/f /
p107
– /-
e
K14CreER /Rb
f /f /p107
– /-
foram gerados no mesmo
CD1 /129 /C57
fundo genético misto como descrito anteriormente [30]. Todos os ratinhos foram genotipados por PCR. Os ratinhos foram injectados por via intraperitoneal com 0,3 ml de bromodesoxiuridina (BrdUrd; 12,5 mg /ml) 1 hora antes da eutanásia para medir a taxa de síntese de ADN. Línguas e esôfagos foram recolhidas e processadas como anteriormente descrito [23]. Os ratos foram alojados na Associação de Avaliação da Unidade McArdle Laboratory Animal Care Laboratório animal Care-aprovado. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com nosso protocolo de animais aprovado pela Universidade de Wisconsin Institutional Animal Care e Use Committee.
4-nitroquinolina 1-óxido (4NQO) cabeça induzida e estudo pescoço carcinogênese e análise histológica
O tratamento e diretrizes para a análise histológica de tumores foram previamente descritos [26]. Resumidamente, os ratinhos foram tratados com 4-nitroquinolina-1-óxido (4NQO; 10 ug /ml) na sua água de beber durante 8 semanas e depois mantida fora de tratamento durante mais 16 semanas. No ponto final, ou quando os ratos se tornaram moribundo, eles foram sacrificados, os tumores evidentes na língua e do esófago foram marcados, e os tecidos foram recolhidos para análise histopatológica.
Imunofluorescência
A imunofluorescência foi realizada como descrito anteriormente [31]. Os anticorpos utilizados foram anti-p16 (/5% de soro de cavalo a 1:50 em leite magro a 5%; M156, Santa Cruz Biotech.), Anti-MCM7 (1: 200 em 5% de soro de cavalo; Neomarkers), anti-citoqueratina 14 conjugado a FITC (CK14; 1: 100 em soro de cavalo a 5%; CBL 197F, Millipore), anti-bromodesoxiuridina (BrdUrd; 1:50 em 5% de soro de cavalo; Calbiochem), e anti-γ-H2AX (1: 100 em 5 soro% cavalo; Millipore)
células Quantificação de núcleos BrdUrd positivos e γ-H2AX focos positivos
Pelo menos três ratos de cada genótipo,
NTG /FANCD2
+ /+
,
NTG /FANCD2
– /-
,
K14E6 /FANCD2
+ /+
,
K14E6 /FANCD2
– /-
,
K14E6E7 /FANCD2
+ /+
, e
K14E6E7 /FANCD2
– /-
ratos, foram selecionados e ~ 8 a 10 quadros (400x) de células dentro do suprabasal (citoqueratina 14 negativo) e basal (Cytokeratin 14 positivo) camadas de língua e epitélio esôfago foram quantificadas para cada rato.
a análise estatística
Um lado teste exato de Barnard foi utilizado para determinar a significância das diferenças na incidência de tumores ostensiva entre cada grupo de ratinhos. Frente e verso do teste de Wilcoxon foi utilizado para determinar a significância das diferenças na gravidade da lesão aberta na língua dos animais e esôfago. Para determinar a significância para núcleos positivos BrdUrd e células positivas focos nuclear γ-H2AX entre cada grupo de ratos, foi utilizado o teste rank-sum de dois lados Wilcoxon.
Resultados
O rompimento da FA via aumenta de forma significativa a incidência de tumores associados HPV-oncogene em E6 /E7 ratinhos bi-transgénicos, mas não em ratinhos transgénicos E6
Para abordar o papel de E6 e a deficiência da via de FA na cabeça e pescoço carcinogénese , HPV16 E6 transgênica (
K14E6
) e HPV16 E7 transgênica (
K14E7
) ratos foram cruzados com
camundongos -null FANCD2
para gerar quatro genótipos diferentes;
K14E6
/
FANCD2
+ /+
,
K14E6
/
FANCD2
– /-
,
K14E6E7
/
FANCD2
+ /+
, e
K14E6E7
/
FANCD2
– /-
ratos. Os ratinhos foram tratados com 4NQO, um carcinógeno químico solúvel em água que actua como um co-agente cancerígeno na indução HNCS no nosso HPV16 ratinhos transgénicos [23], durante 8 semanas e depois mantida durante mais 16 semanas. No ponto final 24 semanas, línguas e esôfago foram colhidas, marcado para tumores evidentes, e os tecidos foram fixados,-embebidos em parafina, seccionados e submetidos a histopatológico análises para avaliar o pior estágio da doença neoplásica.
Em
FANCD2
fundo -suficiente, apenas dois dos 26
K14E6 /FANCD2
+ /+
ratos (8%) desenvolveram tumores de cabeça e pescoço evidentes, que não foi significativamente diferente da observada em murganhos transgênicas (NTG) (Tabela 1). Isto é consistente com o nosso estudo anterior [25]. No
FANCD2
fundo -deficient, dois dos 22
K14E6 /FANCD2
– /-
ratos (9%) desenvolveram tumores evidentes (Tabela 1) , que não foi significativamente diferente da observada no
FANCD2
fundo -suficiente (
K14E6 /FANCD2
+ /+
vs.
K14E6 /FANCD2
– /-
,
P
= 0,52). Assim,
deficiência FANCD2
não conduziu a um aumento da susceptibilidade de camundongos transgênicos E6 para tumores de cabeça e pescoço.
tamanho Genótipo
Grupo, n
tecidos animais com tumor evidente, n (%)
Tongue Esophagus
Tongue
Esophagus
*
NTG/FancD2
+
/
+
240 (0) 0 (0) 0 (0)
*
NTG /FANCD2
– /-
260 (0) 0 (0) 0 (0)
*
K14E7 /FANCD2
+
/Tablet
+
204 (20) 2 (10) 3 (15)
*
K14E7 /FANCD2
– /-
2111 (52) 5 (24) 6 (29)
K14E6 /FANCD2
+
/Tablet
+
262 (8 ) 0 (0) 2 (8)
K14E6 /FANCD2
– /-
222 (9) 0 (0) 2 (9)
K14E6E7 /FANCD2
+
/Tablet
+
146 (43) 4
a (29) 4
a (29 )
K14E6E7 /FANCD2
– /-
1411 (79) 9
b (64) 7
b (50) Tabela 1. Comparação de 4NQO induzida ostensiva . incidência de tumores na língua do mouse e tecidos esôfago
NOTA:
K14E6E7 /FANCD2
+ /
+ ratos mostram um aumento significativo da incidência de tumores em comparação com
K14E6 /FANCD2
+ /
+ camundongos (
P
= 0,01). A diferença na incidência de tumores entre
K14E6 /FANCD2
+ /+
e
K14E6 /FANCD2
– /-
grupos está mostrando sem significância estatística (
P
= 0,52). No entanto, a diferença na incidência de tumores entre
K14E6E7 /FANCD2
+ /+ Comprar e
K14E6E7 /FANCD2
– /-
grupos é estatisticamente significativa (
P
= 0,03). Todas as comparações estatísticas foram realizadas utilizando o teste exato de um Barnard unilateral.
a dois do
K14E6E7 /FANCD2
+ /+
ratos tinham tumores em ambos língua e esôfago.
b Cinco dos
K14E6E7 /FANCD2
– /-.
Ratos tinham tumores em ambos língua e esôfago
* incidências de tumor evidente de
NTG /FANCD2
+
/Tablet
NTG /FANCD2
– /-
K14E7 /FANCD2
+ /+
e
K14E7 /FANCD2
– /-
ratos são do nosso estudo anterior [26] CSV Baixar CSV
a seguir, olhou para a influência do FA-deficiência na cabeça e no pescoço tumorigênese em camundongos que expressam tanto E6 e E7. No
FANCD2
fundo -suficiente,
K14E6E7 /FANCD2
+ /+
ratos desenvolveram um aumento do número de tumores de cabeça e pescoço evidentes em comparação com
K14E7 /FANCD2
+ /+
ratos (Tabela 1), de acordo com os nossos estudos anteriores demonstrando uma capacidade de E6 para aumentar a eficiência da cabeça E7-driven e pescoço tumorigênese [25]. No
FANCD2
fundo -deficient, observou-se um aumento significativo na incidência de tumores evidentes no
K14E6E7
ratos, de 43% para 79% (
K14E6E7 /FANCD2
+ /+
vs.
K14E6E7 /FANCD2
– /-
,
P
= 0,03 na Tabela 1). A magnitude do aumento na frequência de tumores evidentes no
FANCD2
fundo -deficient visto com os ratos de E6 /E7 bi-transgénicos não era maior do que a observada com E7 única ratinhos transgénicos (Tabela 1). Estes dados indicam que a via FA influencia o potencial oncogénico de E7, mas não E6.
Deficiência de FA percurso levou a doença associada ao HPV neoplásica mais agressivo
Foi realizada análise histopatológica detalhada do tecido colhida a partir destes ratos para avaliar o grau de doença neoplástica nestes coortes de ratinhos. Tecidos com tumores evidentes foram colhidos, fixo,-embebido em parafina e secções submetido a exame histopatológico. Especificamente, cada secção de 5 um décimo da língua e do esófago foi corado com hematoxilina e eosina (H E) e analisado para determinar o pior estágio da doença neoplásica, em cada um dos animais (Tabela 2). ratinhos transgénicos-oncogene HPV16 desenvolver uma doença progressiva, que varia entre epitélio normal e papiloma benigno para cancro invasivo (isto é, carcinoma) [24,26]. Com base no nível de diferenciação (queratinização) dentro dos carcinomas, cancros foram sub-classificada em tipos I, II, e III. Na língua, só observou quatro papilomas benignos no
K14E6E7
/
FANCD2
+ /+
ratos, enquanto que no
K14E6E7
/
FANCD2
– /-
ratos observou-se três papilomas benignos, eu carcinomas de quatro grau, e dois carcinomas de grau II. Este aumento na severidade da doença foi estatisticamente significativo (
P = 0,02
na Tabela 2). Enquanto FA-deficiência também levou a um aumento da severidade da doença no esôfago de ratos com tumores, este aumento não foi estatisticamente significativa (
P
= 0,25 na Tabela 2).
Tissue
genótipo
# de ratos, n
doença grau de lesão evidente, n (%)
Nenhuma doença
Papiloma
grau de Carcinoma
I
II
III
Tongue
K14E6 /FANCD2
+ /+
2626 (100) —-
K14E6 /FANCD2
– /-
2222 (100) —-
K14E6E7 /FANCD2
+ /+
1410 (71) 4 (29) —
K14E6E7 /FANCD2
– /-
145 (36) 3 (21) 4 (29) 2 (14) Esôfago
K14E6 /FANCD2
+ /+
2624 (92) 2 (8) —
K14E6 /FANCD2
– /-
2220 (91) 2 (9) —
K14E6E7 /FANCD2
+ /+
1410 (71) 3 (21) -1 (7) –
K14E6E7 /FANCD2
– /-
147 (50) 5 (36) -2 (14) -Quadro 2. A análise histopatológica de . as amostras com lesões evidentes na língua dos animais e tecidos esôfago
NOTA: a nota global da doença na
K14E6E7 /FANCD2
– /-
grupos ratos é estatisticamente mais grave do que -lo em
K14E6E7 /FANCD2
+ /+
grupos ratos no tecido língua de animal (
P
= 0,02), mas não no tecido animal esôfago (
P
= 0,25). Todas as análises estatísticas foram realizadas por meio de um teste de soma classificação de dois lados Wilcoxon. CSV Baixar CSV
Dois biomarcadores, MCM7 e p16, são altamente expresso em tumores em camundongos K14E6E7 independentemente do FANCD2 estado do gene
Na população em geral, HNCS HPV-positivos são mais sensíveis à radiação terapia de HPV HNCS -negative [32]. No entanto, este padrão de cuidados tratamento para pacientes com HNCS não é aplicável a pacientes com FA por causa dos efeitos colaterais graves desta terapia nesses pacientes [33]. Que identifica o status do HPV em HNCS de pacientes com FA iria ajudar os clínicos a procurar soluções mais seguras e melhores para a cura destas doenças malignas. Vários estudos anteriores, incluindo o nosso demonstraram dois biomarcadores moleculares, MCM7 e p16, são úteis em distinguir HPV-positivos, de HNCS HPV-negativos, tanto em camundongos [23,26] e em seres humanos [34,35]. Queríamos monitorar se HPV16 E6 e E7 expressão dupla no fundo deficiente via FA também aumenta os níveis MCM7 e proteína p16 em tumores de
K14E6E7
/
FANCD2
– /-
ratos. As secções de tecido de tumores que surgem em
K14E6E7
/
FANCD2
+ /+ Comprar e
K14E6E7
/
FANCD2
– /-
ratos foram submetidos a imunohistoquímica para anti-MCM7 e -p16 anticorpos específicos. Sem lesões neoplásicas foram observados em
NTG /FANCD2
+ /+ Comprar e
NTG /FANCD2
– /-
ratos . Como relatado anteriormente [23], E6 não aumentou os níveis desses marcadores de expressão e
FANCD2
-deficiência não alterou esse achado (Figura 1). Os dois biomarcadores foram altamente expresso nos núcleos de todos os tumores benignos e malignos em
K14E6E7
ratos independentemente da
FANCD2
status de expressão (Figura 1). Além disso,
FANCD2
knockout não alterou o padrão desses biomarcadores expressão no epitélio normal da língua e do esófago (dados não mostrados). Esses achados nos levam a sugerir que estes dois biomarcadores será valiosa para o diagnóstico de HPV-status em cânceres de pacientes com FA.
São mostradas imagens de imunohistoquímica representativas de cortes corados com anti-MCM7 (núcleos marrom) e anti-p16 (núcleos marrom) anticorpos e contrastadas com hematoxilina (núcleos azuis). Barra de escala, 50 mm.
A proliferação celular induzida por oncogenes HPV16 é aumentada na FANCD2 deficiente fundo
A proliferação celular precisa ser estritamente regulamentado para manter a homeostase do tecido, e suas contribui desregulamentação para doenças neoplásicas. Em nosso estudo anterior, aprendemos que HPV16 E7 e
FANCD2
-deficiência aditiva e independente aumentou a frequência de células do epitélio basal da língua e esôfago submetidos a síntese de DNA [26]. Um
In vitro
estudo demonstrou que a deficiência de FA levou a hiperplasia no contexto de culturas organotípicas de jangada de queratinócitos humanos imortalizados pela combinação de oncogenes E6 e E7 [22]. Para avaliar se
in vivo
deficiência FA teve qualquer influência sobre a proliferação de células na presença de E6 sozinho ou E6 e E7 em conjunto, os ratos do estudo do cancro do pescoço e acima foram injetados intraperitonealmente com BrdUrd (12,5 mg /ml), um análogo da timidina sintética, uma hora antes do sacrifício e específicos de BrdUrd imunofluorescência foi realizada para identificar as células que suportam a síntese de ADN no epitélio que reveste a língua e o esófago de ratos (Figura 2A). A frequência de células BrdUrd-positivos foi quantificado para fornecer um índice proliferativo para cada tecido (Figura 2B).
A, para marcar o ADN sintetizado de novo nas camadas epiteliais da língua e tecidos do esófago, os ratinhos foram intraperitonealmente injetado com BrdUrd antes do sacrifício e os seus tecidos foram corados para detecção de anticorpos anti-citoqueratina 14 proteína (CK14) (verde) anti-BrdUrd (vermelho) e. DAPI (azul) é usado para uma contracoloração nuclear. Barra de escala, 20 um. B, pelo menos, três ratos de cada genótipo,
NTG /FANCD2
+ /+
,
NTG /FANCD2
– /-
,
K14E6 /FANCD2
+ /+
,
K14E6 /FANCD2
– /-
,
K14E6E7 /FANCD2
+ /+
, e
K14E6E7 /FANCD2
– /-
ratos, foram selecionados e ~ 8 a 10 quadros de células nas camadas epiteliais da língua e do esófago epitélios foram quantificadas para cada rato. A quantidade de núcleos BrdUrd-positivos sobre o número total de células foi representada graficamente em cada caso (colunas); Barras, DP. Asterisco (*) significa que a deficiência de
gene FANCD2
causou um aumento significativo na síntese do ADN entre os genótipos (
P
0,05). Todas as comparações estatísticas foram realizadas utilizando um teste de soma classificação de dois lados Wilcoxon.
No
FANCD2
fundo -suficiente, E6 sozinho ou em conjunto com E7 aumentou significativamente o número de BrdUrd células -positivas no epitélio da língua e esôfago (
NTG /FANCD2
+ /+
vs.
K14E6 /FANCD2
+ /+
ou
K14E6E7 /FANCD2
+ /+
,
P Art 0,05 na figura 2B). A combinação de E6 e E7 conduziu a um aumento significativo do número de células epiteliais BrdUrd-positivos no
FANCD2
fundo -suficiente do que E6 sozinho (
P
0,05 na Figura 2B). É importante ressaltar que a frequência de células de suporte a síntese de DNA foi significativamente aumentada nas células epiteliais da língua ou esôfago de todos os ratos que eram deficientes para
FANCD2
, independentemente do estado HPV16 oncogene (
NTG /FANCD2
+ /+
vs.
NTG /FANCD2
– /-
,
K14E6
/
FANCD2
+ /+
vs.
K14E6
/
FANCD2
– /-
, e
K14E6E7
/
FANCD2
+ /+
vs.
K14E6E7
/
FANCD2
– /-
; todos
P Art 0,05 na figura 2B). Nós refinado ainda mais a nossa análise da influência de oncogenes HPV16 e deficiência de FA sobre a indução da síntese de ADN para duas diferentes sub-compartimentos do epitélio: o compartimento basal, que é a citoqueratina 14 (CK14) positivo, e o compartimento suprabasal, que é CK14 negativa (Figura 2A). A influência indicado acima de ambos os factores (oncogenes HPV16 e FA-status) foi mais uniformemente observado no compartimento basal tanto da língua e do esófago (Figura S1). Em resumo, a deficiência em
FANCD2
levou à indução da sintese de ADN celular na língua e epitélios esófago independentemente do estado do oncogene de HPV16. Estes resultados suportam a hipótese de que FANCD2 desempenha um papel de regulação do ciclo celular na fase S [6,36,37]. No entanto, o facto de FA-deficiência não causar um aumento da susceptibilidade à cabeça e tumorigénese pescoço nos ratinhos transgénicos E6 mas causou um aumento na proliferação de células nestes mesmos ratinhos indica que a indução de hiperplasia epitelial não explica como deficiência de FA impulsiona tumorigénese .
O caminho FA suprimir especificamente danos ao DNA E7-driven
Ambos HPV16 E6 e E7 oncogenes têm sido argumentado para induzir dano ao DNA com base em ensaios cometa realizados em células em cultura de tecidos [38,39 ]. Tendo em conta que a via FA está envolvida na reparação de DNA danificado, ele estaria com a razão que o nível de danos no DNA causados por E6 e E7 seria aumentado em um fundo deficiente FA. A presença de danos no ADN em células pode ser indirectamente marcado por monitorização da presença de focos nuclear positiva para 2AX histona fosforilada na serina-139 (γ-H2AX) [40,41]. Nós já tinha demonstrado que, em
K14E7
ratos, E7 levou a um aumento robusto na frequência de células focos positivos nucleares γ-H2AX no epitélio da língua e esôfago, bem como a frequência foi ainda maior na
FANCD2
fundo -deficient [26]. No estudo atual, queríamos determinar o papel do HPV16 E6 na resposta danos no DNA em
FANCD2
fundos -suficiente e -deficient. Para este fim, imunofluorescência específica para γ-H2AX foi realizada em secções de língua e esôfago do
NTG
,
K14E6
, e
K14E6E7
ratos no
fancD2-
suficiente ou
FANCD2
fundos -deficient (Figura 3A).
A. Para avaliar a resposta a danos no DNA induzidos por HPV16 E6 e E7 na deficiência de
gene FANCD2
, tecidos de cada grupo foram coradas para anti-γ-H2AX (vermelho) e anti-citoqueratina 14 proteínas (CK14) (verde anticorpos). DAPI é usado para uma contracoloração nuclear. Barra de escala, 20 um. γ-H2AX células positivas focos são realçados por setas verdes nas imagens. B. Pelo menos três ratos de cada genótipo,
NTG /FANCD2
+ /+
, NTG /FANCD2
– /-
,
K14E6 /FANCD2
+ /+
,
K14E6 /FANCD2
– /-
,
K14E6E7 /FANCD2
+ /+
, e
K14E6E7 /FANCD2
– /-
ratos, foram selecionados e ~ 8 a 10 quadros de células nas camadas epiteliais da língua e do esófago foram quantificadas para cada rato. A quantidade de células com as células positivas de focos γ-H2AX mais o número total de células foi representada graficamente em cada caso (colunas); Barras, DP. Asterisco (*) significa que as diferenças no número de células com focos γ-H2AX entre os grupos foram comparados estatisticamente (
P
0,05). Todas as comparações estatísticas foram realizadas utilizando um teste de soma classificação de dois lados Wilcoxon. Nota: Os tempos de exposição utilizados foram os mesmos para todas as amostras analisadas. Algumas células em tecidos de
K14E6E7 /FANCD2
+ /+ Comprar e
K14E6E7 /FANCD2
– /-
ratos tiveram muito brilhante γ-H2AX específica coloração nuclear na exposição utilizada. de exposição mais curto confirmou que estas células retidas coloração nuclear pontuar reflexivo de danos no DNA focos de resposta.
No epitélio da língua e esôfago tecido, E6 camundongos transgênicos mostraram células positivas focos muito poucos γ-H2AX, semelhante ao que visto no
NTG
ratos.