Abstract

carcinoma adrenocortical (ACC) é um tumor raro, mas altamente maligno de origem desconhecida. Inibina α-subunidade (

Inha

) camundongos knockout desenvolver ACCs seguintes gonadectomia. No homem,

INHA

expressão varia amplamente dentro dos tecidos de ACC e sua circulante peptídeo inibiria pro-aC tem sido descrito como um novo marcador tumoral para ACC. Nós investigamos se as alterações genéticas e epigenéticas do

gene INHA

na perda causa ACC humano ou variação da expressão

INHA

. Para este fim, as análises de

INHA sequência

, metilação do promotor e a expressão de ARNm foram realizados em tecidos humanos adrenocorticais. os níveis de pró-aC inibina soro também foram medidas em pacientes com CAC.

INHA

análise genética em 37 ACCs única revelou 10 romance, variantes raras heterozigotos. Dos 3 bases de codificação afetadas, uma variante era sinônimo e duas variantes missense: S72F e S184F. O alelo menor de rs11893842 em -124 pb foi observada a uma frequência baixa (24%) em amostras de ACC e foi associada com a diminuição

INHA

níveis de mRNA: 4,7 ± 1,9 unidades arbitrárias para AA, em comparação com 26 ± 11 para os genótipos AG /GG (p = 0,034). A metilação de quatro proximal

Inha

CpGs promotor foi anormalmente aumentada em cinco ACCs (47,7 ± 3,9%), em comparação com glândulas supra-renais normais (18,4 ± 0,6%, P = 0,0052), enquanto que os outros 14 ACCs estudados apresentaram diminuído metilação do promotor de (9,8 ± 1,1%, P = 0,020). CpG metilação foi inversamente correlacionada com os níveis de mRNA

Inha

em ACCs (r = -0,701, p = 0,0036), mas não associado com os níveis de inibina soro pro-aC. Em conclusão, a metilação aberrante e variação genética comum no INHA

promotor ocorrer em ACCs humana e está associada com a diminuição

INHA

expressão

Citation:. Hofland J, J Steenbergen , Voorsluijs JM, Verbiest MMPJ, de Krijger RR, Hofland LJ, et ai. (2014) Inibina subunidade alfa (

INHA)

Expressão em Câncer Adrenocortical está vinculado ao genéticas e epigenéticas

INHA

Promotor Variação. PLoS ONE 9 (8): e104944. doi: 10.1371 /journal.pone.0104944

editor: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Março, 2014; Aceito: 17 de julho de 2014; Publicação: 11 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Hofland et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados estão presentes dentro do manuscrito e do Quadro Suplementar

Financiamento:. Os autores não têm financiamento ou apoio ao relatório

Conflito de interesses:. Prof. Wouter de Herder é uma placa Editorial PLOS ONE membro. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

carcinoma adrenocortical (ACC) é um tumor maligno raro com uma taxa de sobrevivência pobres [1], [2] . A ocorrência de ACC tem uma preponderância do sexo feminino e uma distribuição bimodal, com um aumento da incidência em crianças e em adultos com mais de 60 anos [3]. Familial ACC ocorre no contexto de síndromes genéticos, tais como o síndroma de Beckwith-Wiedemann [4] e síndrome de Li-Fraumeni [5]. Mutações em genes subjacentes a estes distúrbios também têm sido associados à formação ACC esporádica, especialmente no caso de

TP53

[6]. A alteração mais freqüente encontrada em ACC é a sobre-expressão do locus maternalmente impressa IGF-II [7]. Mais recentemente, as mutações na via de /β-catenina Wnt foram demonstrado que ocorrem durante a progressão do tumor adrenocortical [8]. causas genéticas e o papel de aberrações cromossómicas em tumorigênese adrenocortical permanecem largamente desconhecidos.

A inibina α-subunidade (codificada pelo

INHA

) forma inibina A ou B pelo acoplamento à inibina βA- ou βB-subunidades, respectivamente. A sua expressão é limitada ao gónadas, placenta e córtex adrenal. O principal efeito de circulação de inibinas A e B é a inibição da secreção local da hormona folículo-estimulante induzido-activina (FSH) pela glândula pituitária em [9]. Em um modelo murino knockout, o α-subunidade da inibina foi encontrada para ter um papel supressor de tumor para tecido gonadal [10] e, após gonadectomia, para o córtex supra-renal [11]. Noventa e nove por cento dos

Inha viajantes – /- ratos desenvolveram carcinomas secretoras de esteróides adrenocorticais após gonadectomia [11]. Caminhos envolvidos neste efeito incluem a diferenciação em células semelhantes a células da granulosa com expressão de marcadores fetais ou gonadal, como

GATA4

,

Lhr, FSHR

e

CYP17A1

[12 ].

Inha-

relacionada carcinogênese em ratos também foi atribuída à diminuição da activina sinalização expressão potencial e aberrante e os efeitos do TGF-β2 [13], [14].

No homem, a função de inibinas adrenais é desconhecida, embora o seu homólogo ativina a tem sido descrita para ser envolvido na regulação específica da zona da esteroidogênese adrenocortical [15]. A evidência para

INHA

como um supressor tumoral em ACC humano é conflitante. Vários estudos de mRNA e análise de proteínas mostraram ausência de

INHA

expressão numa proporção de doentes com ACC bem como

INHA

sobreexpressão num outro subconjunto [16], [17], [18] , [19], [20]. Recentemente, foi relatado que os níveis séricos de péptido sob a forma livre da subunidade α, inibina pró-aC, foram aumentadas em doentes com carcinomas adrenocorticais e que estes níveis pode ser utilizada como um marcador de tumores [21]; os níveis de pró-aC inibina pode ser útil para a diferenciação entre tumores malignos e benignos adrenocorticais, bem como para o acompanhamento de pacientes individuais. Embora a maioria dos pacientes ACC apresentavam títulos séricos de inibina pró-aC um subconjunto de pacientes tinham níveis normais, possivelmente representando os tumores que não expressam

INHA

[21].

ADN Vários alterações são conhecidos por influenciar a expressão do gene durante tumorigênese. Para além das mudanças genéticas que causam a expressão aberrante ou ausente, alterações epigenéticas, como a remodelação da cromatina e CpG metilação, pode afetar a transcrição do gene e, frequentemente, ocorrem em câncer [22]. Metilação de ilhas CpG em regiões promotoras de genes pode resultar em silenciamento transcricional e perda da expressão do gene devido à interferência com a ligação de fatores de transcrição [23].

Insights sobre o controlo regulador do

INHA

expressão poderia lançar mais luz sobre o papel da

INHA

na tumorigênese adrenal humana e sobre a variabilidade das gratuitos que circulam os níveis de inibina de soro que poderiam funcionar marcador tumoral como soro em pacientes ACC. A fim de desvendar esse investigamos os mecanismos de regulação da

INHA

expressão em ACC humano. Sequenciamento do

gene INHA

foi realizado para procurar variações genéticas que podem afetar a função do gene ou expressão níveis. Além disso, a análise quantitativa da metilação INHA

promotor foi realizada a fim de estudar se a metilação de CpG contribui para as diferenças na expressão. Estas análises foram acoplados a níveis de mRNA tumor das concentrações de inibina subunidade e séricos de inibina pro-aC.

Materiais e Métodos

Amostra coleção

tecido

parafina-embedded blocos foram coletados a partir dos arquivos patológicos do Erasmus MC. As amostras de tecidos provenientes de pacientes operados entre 1991 e 2010 neste hospital. O diagnóstico de carcinoma adrenocortical foi feito se o índice van Slooten excedeu 8 [24]. O estadiamento do tumor foi realizada de acordo com a Rede Europeia para o Estudo da Adrenal Os tumores do sistema (ENSAT) estadiamento [1]. Hematoxilina e lâminas coradas-eosina foram avaliadas por um patologista e seções com uma elevada percentagem de células tumorais viáveis ​​foram microdissectados para análise posterior. Tecidos excisadas antes de 2007 foram coletados a partir dos arquivos patológicos do Erasmus MC. O consentimento informado para a utilização secundária de tecido excedente foi obtido de todos os pacientes verbalmente antes da cirurgia. recusa da paciente para fazer tecido disponível para pesquisa foi registrada por escrito e estas amostras não foram incluídos neste estudo de acordo. De 2007 em diante, as amostras foram coletadas em um estudo prospectivo de tumores adrenais e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. Estas amostras também incluiu tecidos adrenais de pacientes submetidos a adrenalectomia devido ao carcinoma de células renais, hiperplasia adrenal e adenoma. secções de tumor foram coletados a partir de peças tumorais viáveis ​​e congeladas em nitrogênio líquido ou gelo seco logo após a ressecção. Os níveis séricos de pré-operatórias de inibina pró-aC foram medidos em subconjuntos de pacientes, utilizando um ensaio imunométrico ligado a enzima (Diagnostic Systems Laboratory, Webster, TX, EUA). O estudo foi realizado de acordo com os regulamentos holandeses sobre o uso de tecidos residuais e aprovado pela Comissão de Ética Médica do Erasmus MC.

DNA sequenciamento

O DNA foi isolado com um DNA mini-kit ( Qiagen, Venlo, Países Baixos) de acordo com o protocolo do fabricante e dissolveu-se em H

2O. A sua concentração foi medida utilizando um dispensador Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).

O gene da subunidade α inibina, localizado em 2q35, é composto de dois exões (Figura 1). Para a análise de DNA de tecidos embebidos em parafina foram selecionados pares de primers para amplificar regiões de 200-250 pb. Para as regiões tecidos frescos congelados até 500 bp pode ser amplificado com sucesso. locais de iniciadores encontram-se resumidos na Tabela 1. Os iniciadores coberto a região de codificação, até -331 pb do local de iniciação ATG (que contém a ligação de cAMP, SF-1 e GATA elementos de resposta em -151 a -112 pb [25], [ ,,,0],26]) e, pelo menos, 153 pb do intrão adjacente ao exão-intrão limites (Figura 1).

Localizadas em 2q35,

INHA

é composto por dois exões, separados por um intrão de 2 kb. A sequência de codificação é composta de 1101 bps. As regiões sequenciadas neste estudo são indicadas pelas setas contínuas. As regiões investigadas para a metilação são representadas pelas setas a tracejado; dinucleótidos CpG caracterizadas com sucesso são mostrados como círculos a branco.

a amplificação por PCR foi realizada num volume de 30 ul de 0,05 U /uL FastTaq polimerase (Roche Applied Science, Almere, Países Baixos), 1 ng /ADN uL, 250 nM de iniciadores directo e reverso, 200 uM de dNTPs (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) e tampão contendo MgCl

2 (Roche), num GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan IJssel, Países Baixos) sob as seguintes condições: 7 minutos a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de intervalos de 1 minuto a 95 ° C, 56-63 ° C e 72 ° C, terminando com 10 minutos a 72 ° C. Os produtos de PCR foram purificados por Pure PCR Kit alta purificação do produto (Roche).

Tanto a frente e inverter iniciadores de PCR foram utilizados em reações de seqüência separadas com o Kit de sequenciação do ciclo v1.1 Big Dye Terminator (Applied Biosystems). Três ul de produto de PCR purificado foi usado com 500 nM de iniciador numa reacção de 1 minuto a 96 ° C e 25 ciclos de 30 segundos a 96 ° C, 15 segundos a 50 ° C e 4 minutos a 60 ° C. Os produtos da reacção foram purificados de sequência com a utilização do corante Ex-96 Purification Kit (Qiagen) e colunas de purificação de micro-bio-spin (Bio-Rad, Veenendaal, Holanda). detecção de sequência foi realizada utilizando o ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). de software Sequencher (genes códigos Corporation, Ann Arbor, MI, EUA) foi utilizado para análise de ADN.

A metilação análise

Um ug de ADN, obtido a partir de amostras congeladas, foi tratado com bissulfito utilizando o EZ kit de metilação de ADN (investigação Zymo, Irvine, CA, EUA), eluiu-se em 100 ul de H

2O e armazenado a -80 ° C. Bissulfito-tratada de ADN na região promotora de

INHA

foi amplificado por PCR enquanto um promotor de T7 foi introduzida no iniciador inverso. Usando o software EpiDESIGNER fornecida por Sequenom (San Diego, CA, EUA), dois conjuntos de iniciadores foram concebidos que cobria vários dinucleótidos CpG a montante do

INHA

começar local (Figura 1); as sequências de iniciadores são descritas na Tabela 1.

A PCR foi realizada num volume de 5 ul contendo 0,04 U /uL HotStar polimerase Taq (Qiagen), 200 pM de dNTP, 200 nM de ambos os iniciadores, 1 ul de bissulfito ADN tenha sido tratada com, tampão HotStar PCR e H

2O. Após 10 minutos a 95 ° C, 35 ciclos foram realizados de 30 segundos a 95 ° C, 30 segundos a 53 ° C e 45 segundos a 72 ° C. A reacção terminou com um passo de recozimento de 7 minutos a 72 ° C. Após a confirmação de produto de PCR num gel contendo agarose a 2%, o produto foi tratado com 0,3 U de fosfatase alcalina de camarão para 20 minutos a 37 ° C e 5 minutos a 85 ° C.

Em seguida,

in vitro

transcrição e clivagem específica de bases foi realizada numa mistura de 7 mL contendo 20 L de T7 R ADN-polimerase, mistura de clivagem de t-específica, 3,14 mmol /l de DTT, RNase a, produto de PCR e tampão de polimerase de T7 (Sequenom ). Os fragmentos resultantes foram diluídos com H

2O e 6 mg de resina LIMPO foi adicionado durante 10 minutos para remover os iões de sódio e de potássio. Esta mistura foi centrifugada a 3000 rpm durante 5 minutos e distribuída numa SpectroCHIP com o instrumento MassARRAY Nanodispenser RS-1000 (Sequenom). metilação quantitativa foi detectada por uma dessorção a laser assistida por matriz /ionização de tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrómetro de massa (analisador de MassARRAY compacto, Sequenom) e a análise foi realizada usando software que acompanha EpiTYPER.

curvas padrão para estes Os ensaios foram construídos por ensaio misturas de amostras de DNA mistas contendo 0% a 100% de metilação com intervalos de 10%. análise de metilação foi bem sucedida por 8 CpGs no

INHA

promotor:. localizado 149, 203, 241, 285, 558, 599, 719 e 751 bps a montante do

INHA

começar site

ARNm

O ARN total foi isolado a partir de tecidos congelados por adrenocorticais reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). transcriptase reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa de

INHA Comprar e limpeza genes

HPRT1

e

GAPDH

foram realizadas em duplicata, como descrito anteriormente [16]. As sequências de iniciadores e sondas foram indicadas na Tabela 1. Os níveis de expressão de

INHA

foram calculadas em relação ao do ciclo limiar médio (Ct) de

GAPDH

e

HPRT1

usando o método delta-Ct e multiplicado por 1000.

a análise estatística

o conjunto de dados para este estudo está incluído na Tabela S1. As análises de diferenças entre os grupos foram realizadas com os testes qui-quadrado, one-way análise de variância seguido de vários testes de Tukey de comparação ou t-testes usando software Graphpad Prism (Graphpad Inc, La Jolla, CA, EUA). níveis de mRNA foram log-convertidos antes da análise. As correlações foram analisadas pelo coeficiente de correlação de Spearman. Todos os testes foram calculados como bicaudais e um nível de P menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Sequência análise

O

INHA

sequência foi analisada em 37 tecidos ACC únicos (12 fresco congelado, 25 de parafina-embedded). Resulta da sequência de análises foram resumidos na Tabela 2.

No total, a sequenciação do

INHA

gene em 37 ACCs revelou 10 novas variantes genéticas raras em 8 ACCs. Um ACC abrigava três variantes heterozigotos (-77G A, -63 G e -56G T) na UTR 5 ‘, enquanto que uma variante heterozigótica directamente após o codão de terminação (* 1G A) foi detectada em outro ACC. Nós localizado três variantes intrônicas, localizado 179, 72 e 9 pontos base a montante do intron 1-exão 2 fronteira. Na região codificadora do

INHA

detectamos uma mudança sinónimo de nucleotídeos (75C T, Ala25Ala) e 2 variantes missense, em 3 distinta ACCs. As variantes últimos dois compreendia heterozigotos C → T, em bps 215 e 552, levando a serina para mudanças de fenilalanina nos aminoácidos 72 e 184, respectivamente

Em nossa série completa de amostras de ACC, o -124A g. SNP, rs11893842, foi a variação genética mais prevalente com uma freqüência do alelo menor (MAF) de 24%, em comparação com 44% em uma população de referência (www.1000genomes.org [27]). Além disso, o alelo menor do SNP intrónica IVS1-87G A (rs116399602) estava presente em 16% das amostras de ACC, aparentemente mais elevada do que em indivíduos saudáveis ​​(2,8% MAF). Rs7588807 (IVS1-314G T) foi medida no subconjunto de amostras de ADN congelados. O alelo T menor foi previamente relatado para ocorrer em 48% nos indivíduos de controlo; o ACC mostrou uma MAF menor, de 29%. Rs35118453 (-16C T) e rs12720063 (532c T) estavam presentes em baixas frequências, comparável ao de referência [27]: 9% e 12%, respectivamente. Rs144941390, rs374972575 e rs148455844 dentro do

INHA

gene foram, cada um detectados numa amostra de ACC.

A metilação análise

A primeira série em que

INHA

promotor metilação foi investigada, englobados ADN a partir de 3 glândulas supra-renais normais e 12 ACC. Para os 4 dinucleótidos CpG 558, 599, 719 e 751 bps a montante do

INHA

começar rácios de metilação do site baixo foram obtidos em todas as amostras testadas: 4,4 ± 1,1%, 4,5 ± 0,8%, 1,7 ± 0,7% e 2,5 ± 0,6% (média ± SEM), respectivamente. Além disso, não houve diferença entre os tecidos e os ACC adrenais normais (dados não mostrados). Os CpGs na proximidade do local de início foram metilados a um grau mais elevado de um subconjunto de amostras; portanto, um adicional de 7 analisados ​​ACC apenas com o par iniciador a jusante.

Os resultados da análise de metilação de CpG em -285, -241, -203 e -149 está representado na Figura 2. Cinco ACC tinha aberrantemente elevada taxas de metilação de todos os quatro CpGs proximais investigados no

INHA

promotor. rácio médio de metilação desses ACCs foi de 47,7 ± 3,9%, em comparação com 18,4 ± 0,6% para supra-renais normais (P = 0,0052) e 9,8 ± 1,1% para o outro ACCs (P 0,0001). A diferença entre a metilação em adrenais normais e o outro ACC também foi estatisticamente significativa (P = 0,020). A percentagem de

INHA

metilação do promotor nas amostras ACC não foi associada com as características tumorais, tais como excesso de produção hormonal, índice ou fase ENSAT van Slooten (dados não mostrados).

análise quantitativa de metilação quatro dinucleótidos CpG no INHA

promotor foi realizada em 3 supra-renais normais e 19 ACCs. CpGs individuais estão indicados no eixo-x pelo número pb localizada a 5 ‘do local de início ATG. 0 indica ausência de metilação de ADN enquanto que 1 indica que todo o ADN testada na amostra de tecido é metilado. Os pontos de dados individuais são compostas por uma média de medições em triplicado.

Análise da expressão

INHA

níveis de expressão de mRNA foram medidos em adrenal normal (n = 10), hiperplasia supra-renal (n = 20), adenoma (ADA, n = 11) e ACC (n = 25) tecidos. O estudo incluiu 10 adrenal normal, 4 hiperplasia adrenal e 14 amostras de ACC em que

níveis INHA

foram relatados antes [16]. A presente análise mostrou ausência de

expressão INHA

em 3 ACC enquanto o outro ACCs demonstrado uma grande variedade de expressão de 0.080 para 220 unidades arbitrárias (A.U.). No geral, não houve diferenças significativas entre os níveis de

expressão INHA

em todos os grupos investigados (Figura 3A). Além disso, os níveis de mRNA de

INHA

em ACCs não estavam relacionadas com as características do tumor (dados não mostrados).

(A) Quantitative

INHA

análise de mRNA foi comparável em glândulas supra-renais normais (Nl, N = 10), hiperplasia supra-renal (Hyp, n = 20), adenomas (ADA, n = 11) e carcinomas (ACC, n = 25). A amostra ACC abrigar o S184F variantis exibido como um círculo aberto. Barra representa a média. (B) Variação de rs11893842 (-124A G) foi associado a alterações no

expressão INHA

gene. As barras representam o meio, * P 0,05. (C) associação negativa entre a metilação do promotor do

gene INHA

e

INHA

expressão de mRNA (r = -0,701, P = 0,0036). (D) A falta de correlação entre o

INHA

expressão de mRNA e pró-aC Z-scores inibina soro em pacientes ACC (r = -0,473, p = 0,10).

Do 3 amostras de ACC com variantes genéticas raras no

INHA

exons, apenas um estava disponível para análise de expressão; este ACC abrigar a mudança S184F mostrou um nível normal de

INHA

mRNA (15 A.U., Figura 3A, círculo aberto). Quando estratificado para os cinco SNPs comuns, somente a variação do gene rs11893842 foi associado com mudanças no

INHA

mRNA: média de expressão em tecidos com o genótipo AA foi de 4,7 ± 1,9 A.U., em comparação com 26 ± 11 A.U. para os genótipos AG /GG (P = 0,034, Figura 3B).

mRNA Combinada e metilação análises estavam disponíveis para 15 tecidos. Em geral, houve uma associação negativa significativa entre a taxa de metilação média das ilhas proximais CPG e

INHA

expressão de mRNA (Figura 3C, r

s = -0,701, p = 0,0036).

os níveis de inibina de soro pró-aC estavam disponíveis em um subconjunto de pacientes. Não houve relações significativas entre inibina soro pro-aC Z-scores em uma relação de mão e metilação (n = 9, r

s = -0,10, P = 0,81, dados não mostrados) ou expressão de mRNA (n = 13, r

s = -0,47, P = 0,10, Figura 3D), por outro. Os níveis de inibina pro-aC estavam disponíveis apenas para um paciente ACC com raras

INHA

variantes: esta paciente do sexo feminino na pré-menopausa com três variantes raras na 5’UTR de

INHA

teve altamente aumentada pro- inibina níveis aC a 3000 ng /l. (normal, 780 ng /l)

Discussão

O α-subunidade inibina tem sido implicado na tumorigênese adrenocortical desde que foi observado que gonadectomized

Inha Restaurant – /- ratos desenvolveram carcinomas adrenocorticais com penetrância quase completa [11]. Perda de

INHA

expressão foi detectada em apenas um pequeno subgrupo de ACC humano [16], [17], [18], [20], [28], [29], defesa contra um tumor significativa papel supressor de

INHA

na carcinogênese adrenocortical humano. Este é o primeiro estudo que mostra que a grande variação no

expressão INHA

em ACCs é parcialmente causado por metilação e variação genética comum do INHA

promotor e não é devido a variações genéticas raras.

no modelo knockout murino,

Inha

é pensado para predispor as células do córtex adrenal subcapsular se submeter a um interruptor fenotípica às células gonadais-like [11], [12], [14]. Este foi levantada a hipótese de ser causada pelo aumento da disponibilidade do receptor de FTC-β tipo III betaglicano levando a sinalização de TGF-β2 aumentada [13]. O aumento concomitante nos níveis de gonadotropina circulantes poderia garantir a proliferação de células do córtex adrenal através de uma via de ciclina D2-dependente [30]. Embora a histologia dos tumores que se assemelha de carcinoma adrenocortical no homem [11] que são funcionalmente mais comparável às células gonadais-como secretoras de estrogénio [12]. Se knockdown local do

INHA

no córtex adrenal humanos contribui para a tumorigênese adrenocortical é desconhecida. Uma vez que a ocorrência de ACC mostra predominância em mulheres pós-menopáusicas têm níveis aumentados de gonadotropinas, este mecanismo pode ocorrer neste subgrupo de pacientes.

estudos de expressão anteriores revelaram que a inibina de sub-unidade α não é expresso num pequeno subconjunto de amostras ACC [16], [17], [18], [20], [28], [29]. Em contraste,

In vivo

estudos têm níveis aumentados reveladas do α-subunidade de inibina no soro de pacientes com ACC [21], [31], [32]. Estas conclusões são susceptíveis de ser uma consequência da grande variação de tumor

Inha

níveis de expressão, no presente estudo ao longo de um vezes 1000. Causas de perda ou variação no

INHA

expressão eram desconhecidos.

Um estudo anterior investigou

INHA

variantes genéticas em ACCs. Longui

et al.

[19] estudaram pacientes ACC pediátricos com linha germinal

TP53

mutações e encontrou 3 raros, heterozigotos

variantes INHA Online em 6 dos 46 (13%) pacientes. Destes três novas variantes, um (G227A, rs12720061) foi subsequentemente demonstrado ser um SNP comum e não ocorreu na nossa coorte ACC. Implicações das outras duas variantes genéticas (P43A e A257T) são desconhecidos; eles não foram encontrados no presente inquérito de ACCs esporádica. Curiosamente, o acima mencionado estudo encontrou perda de heterozigosidade (LOH) na vizinhança do INHA

gene em oito dos nove ACC estudados [19], o que sugere que poderia causar uma redução na LOH níveis de expressão. Além disso, hibridização genômica comparativa análises de ACCs humana descrita perda cromossômica esporádica do

INHA e região de 2q33-36, com predomínio em tumores da infância [33], [34], [35]. Por outro lado, a inibina de sub-unidade α foi anteriormente mostrado para ser sobre-expresso em ACC pediátrica [21].

No presente estudo, duas variantes genéticas missense heterozigótica novos foram detectados. A serina para substituições de fenilalanina nos aminoácidos 72 e 184 pode afectar a actividade da α-subunidade da inibina resultante, mas uma vez que a função da inibina na glândula adrenal humano é desconhecido [36], é difícil para investigar as consequências de potencialmente alterados atividade. O tumor abrigar a mudança S184F expressa um nível normal de

INHA

mRNA, mas a função ou a degradação da proteína ainda pode ser afetado pela introdução do anel lateral benzilo. As variantes genéticas localizados 179, 72 e 9 pontos base a montante da fronteira intron-exon pode levar a splicing alternativo do

gene INHA

. Importante, há variantes homozigotos foram detectados, implorando contra nocaute total de

INHA

levando à formação de ACC. Infelizmente, tivemos apenas um paciente com

variantes e concomitantemente disponíveis inibina níveis séricos de pró-aC INHA

. Aqui, os níveis séricos elevados foram encontrados apesar de três variantes da região de promotor aumentando a probabilidade de um aumento da actividade do promotor. Dada a baixa freqüência de

INHA

variantes genéticas em esporádica e familial ACCs [19], estas alterações de DNA só poderia estar envolvido na tumorigênese adrenocortical em um pequeno subgrupo de pacientes ACC. Vários comum

Inha

SNPs foram detectados em nossos pacientes. alelos menores de rs11893842 e rs758807 foram encontrados para ocorrer em pacientes ACC a frequências mais baixas do que o previamente relatado em coortes saudáveis, o que pode sugerir que os principais alelos desses SNPs desempenhar um papel na oncogénese adrenal. Curiosamente, o alelo menor de rs11893842, localizado na região promotora em estreita proximidade com as sequências reguladoras cruciais [25], [26], foi associada com níveis mais baixos de

INHA

expressão de ARNm. A menor frequência deste SNP em amostras de ACC parece contradizer a hipótese de que

INHA

é um supressor tumoral em ACC humano.

A metilação das regiões promotoras dos genes supressores de tumor é um mecanismo comum envolvido em carcinogênese [23]. Diminuição

expressão INHA

em ACCs poderia ser causada pelo aumento da metilação do INHA

promotor. A metilação da folistatina, envolvida na via de sinalização de activina e inibina como um antagonista da activina, foi anteriormente encontrada na linha celular humana ACC H295R [37]. Mostramos agora que um subconjunto de ACC humano (21%) tem uma maior proporção de metilação de CpG em vários INHA a

promotor, contrariamente à maioria dos ACC que mostram uma diminuição da metilação

INHA

promotor comparação com o tecido supra-renal normal. Esta ampla gama de metilação presumivelmente responsável por parte da ampla

INHA

gama expressão, como mostra a relação inversa entre

INHA

metilação do promotor e

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expressão de mRNA. Esta modificação epigenética na INHA

promotor e rs11893842 também podem estar envolvidos no controle regulatório do

INHA

expressão em outro

INHA

tecidos -expressing, ou seja, gônadas e placenta.

os níveis de metilação do

INHA

promotor e

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expressão de mRNA não foram associados com os níveis de inibina soro pro-aC. Além disso, que anteriormente não encontrou nenhuma associação entre os níveis-aC Pro e estágio do tumor ou o tamanho [21]. Portanto, estes níveis poderão ser principalmente dependente (pós-) translacionais, a atividade das células do tumor, ou a depuração da circulação.

As limitações do estudo incluem o pequeno tamanho da amostra, a incerteza sobre a presença de LOH e se o romance variantes são germinal ou somática. Dada a incidência muito baixa de

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variantes genéticas neste conjunto substancial de 37 ACCs, é muito improvável que

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mutações desempenham um papel significativo na formação de ACC no homem. Embora LOH não foi estudada directamente nestas amostras, a ocorrência de variantes heterozigotas nos ACC invoca contra nocaute do gene completo. Importante, única homozigotos ratos

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knock-out desenvolveram tumores adrenocorticais [11] pleiteando contra potencial tumorigénico do número de cópia única eliminação. Finalmente, emparelhado sequenciamento de tecido normal e tumoral pode revelar se as variantes anteriormente undescribed têm uma linha germinal ou origem somática, mas este não estava disponível para o estudo atual. Estes resultados revelam uma ligação romance entre metilação e expressão de inibina. Knockdown da inibina α-subunidade durante a formação ACC através de metilação pode predispor a TGF-β ou activina ação parácrina sem oposição sobre a proliferação adrenocortical ou esteroidogênese. Restaurar inibina e também folistatina [37] em níveis ACC por agentes de desmetilação pode contribuir para os efeitos anti-proliferativos e esteroidogênicas observados com o inibidor de metilação do DNA 5-aza-2′-desoxicitidina em células adrenocorticais [38]. Por outro lado, a metilação do promotor da inibina pode também ter um mecanismo de regulação comum de expressão da inibina na gonadal, tecido supra-renal e da placenta e o tratamento com agentes demetilantes Pode ser especulado para afectar a produção de inibina nestes órgãos.

Em conclusão, aberrante metilação e variação genética comum na região promotora do

gene INHA

estão associados com

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expressão de mRNA em ACC humano. Estes epigenética genética e

Inha

mudanças poderiam contribuir para tumorigênese adrenocortical humano, semelhante à situação na murino

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modelo knockout. Rare

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variantes não parecem estar envolvidos na fisiopatologia da ACC esporádica.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Estudo conjunto de dados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0104944.s001

(XLSX)