Abstract
cistatina C é acreditado para impedir a progressão do tumor inibindo as atividades de uma família de cisteína proteases lisossómicas. No entanto, pouco se sabe sobre o mecanismo preciso da função de cistatina C no cancro da próstata. No presente estudo, examinamos a expressão de cistatina C e sua associação com metaloproteinases de matriz 2 (MMP2) e receptor de andrógeno (AR) em um tissue microarray comparando amostras benignas e malignas de 448 pacientes submetidos à prostatectomia radical para câncer de próstata localizado. Cistatina expressão C foi significativamente menor em amostras de cancro do que em tecidos benignos (p 0,001) e houve uma correlação inversa estatisticamente significativa entre a expressão da cistatina C e MMP2 (r
s
2 = -0,056, p = 0,05 ). Houve uma clara tendência que pacientes com diminuição do nível de cistatina C tinham sobrevida global inferior. a inibição específica de cistatina C usando siRNA específico resultou num aumento da capacidade de invasão das células PC3, enquanto que a indução de cistatina C superexpressão reduziu muito taxa de invasão de PC3 in vitro. O efeito da cistatina C na modulação da invasão de células PC3 foi provocada por Erk2 inibidor que a actividade inibida especificamente MAPK /Erk2. Isto sugere que a cistatina C podem mediar a invasão de células tumorais através da modulação da actividade de cascatas de MAPK /Erk. Consistente com os nossos achados imuno-histoquímica que os pacientes com baixa expressão de cistatina C e elevada expressão do receptor de andrógeno (AR) tendem a ter sobrevida global pior do que pacientes com alta expressão de cistatina C e expressão elevada AR, a sobre-expressão induzida da AR em células PC3 que expressam cystatin C siARN melhorou substancialmente a capacidade de invasão de células PC3. Isto sugere que pode haver uma diafonia entre cistatina C e as vias mediadas por AR. Nosso estudo revela um novo papel para a cistatina C e seus associados vias celulares em invasão câncer de próstata e de metástases
Citation:. Wegiel B, Jiborn T, Abrahamson M, Helczynski L, Otterbein L, Persson JL, et al. (2009) cistatina C é regulada negativamente no cancro da próstata e modula a invasão das células do cancro da próstata
via
MAPK /Erk e receptor andrógeno Pathways. PLoS ONE 4 (11): e7953. doi: 10.1371 /journal.pone.0007953
editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 17 de maio de 2009; Aceito: 29 de outubro de 2009; Publicado: November 23, 2009 |
Direitos de autor: © 2009 Wegiel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Conselho de Pesquisa sueco (não darão nenhuma 20760 e 09915.), o sueco Cancer Society (Projetos Sem 07-0458 e 02-4573), o Fundo de Investigação e do Fundo de Pesquisa do Câncer de Malmö do Hospital Universitário da Faculdade de Medicina da Universidade de Lund, Gunnar Cancer Foundation Nilssons, eo Crafoord STF, e de Governo Saúde Grant (ALF) e A. Oesterlund Foundation. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de próstata (PCA) continua a ser o tumor mais letal mais comum e segunda no sexo masculino no mundo ocidental [1]. Aproximadamente um terço de pacientes tratados recaída e não existe actualmente tratamento curativo para a doença metastática [2]. A progressão através de câncer de próstata resistente à castração e metastático hormono-dependente, é mal compreendida. Os processos de invasão e metástase de células tumorais são dependentes da sua capacidade de degradar as proteínas circundantes e outros componentes do tecido. As enzimas proteolíticas e proteases tais como a colagenase e catepsinas são necessários para o efeito, e, assim, desempenhar um papel crucial em várias etapas de crescimento e a metástase de cancros [3], [4]. Entre as proteases, as metaloproteinases de matriz MMP e lisossómica catepsina B tem sido atribuída papéis importantes na progressão do cancro da próstata [5] – [9] [10], [11]. Recentemente, MMP2 também foi associado a um fenótipo invasivo de células de câncer de próstata [12] e expressão de MMP2 no epitélio prostático maligno demonstrou ser um preditor independente de sobrevida livre de doença câncer de próstata [13].
cistatina C é um inibidor de protease de cisteína secretado que regula a reabsorção óssea, a quimiotaxia de neutrófilos, e a inflamação do tecido, bem como a resistência às infecções bacterianas e virais. Também serve como um potente inibidor da catepsina B e outras proteases de cisteína lisossómica humanos [14]. Cistatina C também é conhecido por ser um melhor marcador de lesão renal de creatinina [15], [16]. Por inactivação da actividade da protease catepsina, cistatina C inibe a invasão de células de cancro e metástase [17], [18]. níveis anormais de soro de cistatina C ou complexo catepsina B /cistatina C têm sido sugeridos como agentes de diagnóstico e de prognóstico para cancros indicadores de pele, cólon e pulmão [19]. Cistatina C tem sido sugerido para desempenhar um papel importante na diferenciação neuroendrocrine de cancro da próstata [20]. Mais recentemente, soro de cistatina C tem sido proposta como marcador útil do aumento da actividade osteoblástica associada a bifosfonato tratamentos em doentes com cancro da próstata com metástases ósseas [21]. No entanto, o papel de cistatina C na progressão do cancro da próstata e as suas redes celulares e moleculares associadas permanecem a ser investigado.
Estudos recentes têm mostrado que, durante a tumorigénese e metástase, várias cascatas proteolíticas consistindo de enzimas, tais como proteases de cisteína e MMPs actuam de forma sincronizada e auxiliar no crescimento do tumor, invasão nos tecidos circundantes [10]. Catepsina B tem sido implicada na degradação da matriz extracelular (ECM), quer na forma segregada no espaço extracelular ou ligada à superfície da célula [10]. Em particular, de MMP-2 e MMP-9 foram sugeridos para ser associado com a metástase do cancro da próstata, como níveis elevados destas proteínas foram medidos no plasma e na urina em doentes com doença metastática [5], [22], [23]. MMP9 também tem sido intensivamente estudada e é apesar de desempenhar um papel importante em dois aspectos importantes da progressão do tumor, angiogénese e vasculogénese [8].
O processo metastático envolve a coordenação das várias vias celulares e de transdução de sinal que permitir que as células cancerosas proliferam, remodelar seu ambiente circundante, invadem o site distante e formar novos tumores. MAPK vias de sinalização desempenham um papel importante na indução da secreção de enzimas proteolíticas que degradam a membrana basal, aumentando a migração celular e a manutenção do crescimento de células de tumor [7]. Os aumentos na actividade MAPK foram observados em CaP avançado sugerindo que uma via de Ras activa constitutivamente pode ser associada com a progressão e metástase do cancro da próstata [7], [24]. Importante, a activação de MAPK está associado ao desenvolvimento de cancro da próstata independente de androgénios, agora comummente designada por cancro da próstata resistente à castração (CRPC) [25], [26], [27].
do receptor de androgénio (AR), um membro da superfamília dos receptores nucleares activados por ligandos, desempenha um papel central na patogénese do cancro da próstata primário e metastático, [28], [29]. amplificação do gene AR é encontrado em um terço dos cancros da próstata avançada e se crê contribuir para a progressão e metástase de câncer de próstata [30], [31], [32], [33]. O AR não agir de forma independente na regulação do crescimento do tumor, mas requer interação com os colegas de reguladores [34]. As mutações no gene ou mensagem da AR são as razões para o aumento da sensibilidade de androgénio desses tumores. produção autócrina local da diidrotestosterona e testosterona em células de câncer de próstata diminui o efeito da castração [35]. O crosstalk entre as vias AR e outras sinalização (por exemplo MAPK), bem como alterações na AR co-reguladores [34] acelerar a activação independente do ligando de AR. Assim, AR desempenha um papel vital em ambos os tipos de câncer de próstata clinicamente localizado e avançado.
O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão de cistatina C e sua relevância clínica em câncer de próstata, e para elucidar um novo papel para a cistatina C na invasão de cancro da próstata. Cistatina C está associada com a cascata proteolítica e MAPK /Erk via juntamente com AR pode agir de uma forma sincronizada para promover o crescimento tumoral e a invasão nos tecidos circundantes. Aqui, nós estabelecemos pela primeira vez uma ligação funcional entre cistatina C e MAPK-Erk de sinalização e caminhos AR-mediadas em células de câncer de próstata.
Resultados
expressão tecidual da cistatina C no cancro da próstata está associada com MMP2 como um marcador para Invasividade e evolução clínica
Diminuição cystatin expressão de mRNA C tem sido relatada em vários tipos de tumores sólidos, incluindo câncer de mama, câncer de cólon e carcinoma renal [36], [37]. No entanto, o papel específico da expressão da proteína de cistatina C na progressão do cancro da próstata e a sua associação com características clínicas não foi relatada. Nós utilizamos um tecido de microarray (TMA) contendo amostras de tecido prostático benigno e tumores malignos de 448 pacientes submetidos à prostatectomia radical para câncer de próstata localizado. Expressão de cistatina C foi examinada por imuno-histoquímica. Virtualmente todas as amostras benignas mostrou a expressão de proteína citoplasmática marcadamente elevada de cistatina C, enquanto os tecidos de cancro da próstata combinados consistentemente apresentado mais fraca ou não detectável imunocoloração (Figura 1A, B). A diferença foi estatisticamente significativa (p 0,001), sugerindo que a expressão da proteína cistatina C é, em geral, sub-regulada no cancro da próstata em comparação com epitélio benigna. Em seguida, amostras de tumor subdividida em dois grupos com base nos graus de Gleason de biópsias individuais, Gleason de grau 2 ou 3 (Grupo 1) comparada Gleason de grau 4 ou 5 (Grupo 2) [38]. Encontrámos diminuição da expressão de cistatina C em amostras de tumor de 61% do grupo 1, em comparação com 72% das amostras no Grupo 2 (Figura 1A). Ambos MMP2 e MMP-9, em particular, foram encontrados para ser associado com a metástase do cancro da próstata [13], [39]. Recentemente, cistatina C, foi identificado como um substrato novo para MMP2 em análise proteómica à base de células, sugerindo que existe uma relação funcional directa entre MMP2 e cistatina C [40]. Por isso, explorou uma possível associação entre a expressão cistatina C ea expressão de MMP2 nas amostras de pacientes através da análise imunohistoquímica de nossa construção tissue microarray (TMA). Curiosamente, a expressão da proteína cistatina C foi inversamente associado com MMP2 no material 448 paciente, que foi estatisticamente significativa (r
s
2 = -0,056, p = 0,05). Nós investigado se a expressão de cistatina C correlacionada com o resultado clínico em doentes com cancro da próstata, e foram divididos doentes em dois grupos com base no nível de expressão de cistatina C: cistatina C elevada (intensidade de coloração 2 ou 3) ou cistatina C baixo (intensidade de coloração) grupo inferior a 2. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa nos parâmetros clínicos, incluindo pontuação de Gleason, estágio T /estágio Patologia, tempo livre metástase, os níveis pré-tratamento PSA, os níveis de recorrência de PSA bioquímicos, tempo livre bioquímica e margens cirúrgicas positivas entre cistatina C alto e cystatin baixo grupo C (Tabela 1 ). Em seguida, investigou se os resultados clínicos, incluindo geral-sobrevivência (OS) diferiu entre cistatina C alto e cistatina C pacientes de baixo. Os pacientes no grupo de alto cistatina C em 100 meses desde o diagnóstico tinha um sistema operacional de aproximadamente 40% em comparação com 25% para os pacientes do grupo de baixa cistatina C (p = 0,307) (Figura 1C). Embora nós não atingiu significância estatística, existe uma clara tendência de que os pacientes com baixo nível de expressão cistatina C tiveram pior resultado em comparação com aqueles com níveis mais elevados. Quando avaliamos se a sobrevida livre de recidiva bioquímica diferiu entre os grupos, também não houve diferença significativa (p = 0,401) (Figura 1D).
A). análise imunohistoquímica da expressão cistatina C em amostras benignas e PCA. Seções que representam benigna, tecidos e tumores de Gleason grau 3 e grau 5 são mostrados. imagens representativas foram obtidas utilizando um objetivo 40x. B). O gráfico da análise quantitativa de coloração imuno-histoquímica de cistatina C (escore 0 negativo, 1- moderada, 2- forte, 3- muito forte) mostra a comparação entre 448 amostras benignas e câncer (coloração média de duplicatas de cada amostra). análises de teste da soma de pontuação de Wilcoxon pareado foram usadas para avaliar a comparação entre os grupos. Os valores médios de intensidade de coloração (linhas horizontais) com barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% para a média são mostrados. As caixas representam a distribuição da expressão de cistatina C nos grupos. C) A sobrevida global em pacientes com expressão alta ou baixa de cistatina C em amostras de câncer de próstata. análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizada. curvas D) Sobrevivência de tempo para a recaída avaliada como uma recorrência bioquímica medida como pelo aumento de PSA [57] para a baixa (intensidade marcar 0-1,5) e alta (intensidade marcar 2-3) cystatin expressão C.
expressão tecidual do receptor andrógeno inversamente associado está com cistatina C Expressão
Ampliação e mutações do gene AR são identificados como fatores críticos relacionados com o mau prognóstico do câncer de próstata. Quisemos investigar se a expressão de cistatina C, em combinação com AR podem prever o resultado da doença. Nós avaliamos a expressão de cistatina C em um subconjunto de nossas amostras TMA compreendendo 99 pacientes com a doença mais avançada e teve alto nível de expressão AR. Nós dividimos esses 99 pacientes em dois grupos: o cystatin /grupo AR-alta C-baixa e cistatina C-alta /AR-alta grupo (Figura 2). Pacientes com níveis C baixo cistatina e alta expressão de AR tiveram menor sobrevida global (40%, em 100 meses) em comparação com pacientes com alto cistatina níveis C e alta expressão de AR (60%, em 100 meses), embora esses resultados não alcançaram estatística significância (p = 0,094). Isso indica que os pacientes que tiveram baixo cistatina C e expressão elevada AR tendem a ter piores resultados em comparação com pacientes com alta cistatina C e expressão elevada AR.
A sobrevida global em um grupo de 99 pacientes com o câncer de próstata mais avançada (Gleason grau 4-5), que foram caracterizados por uma elevada expressão de AR e foram separados para diferentes grupos com base em níveis de cistatina C (baixa intensidade marcar 0-1,5 e alta intensidade marcar 2-3).
cistatina C expressão em linhas celulares de cancro da próstata
Porque cistatina C foi regulada para baixo em tecidos de câncer de próstata e associado com aumento da expressão de MMP2 que é conhecido por contribuir para a invasão tumoral e metástase, quisemos investigar o papel da expressão cistatina C no crescimento de células de cancro da próstata, a sobrevivência e a invasão. Foi examinada a expressão de cistatina C, em três linhas de células de cancro da próstata, incluindo as células LNCaP sensíveis-andrógenos e PC3-androgénio insensível e células DU-145 (Figura 3). As concentrações de proteína cistatina C nos sobrenadantes foram medidos por ELISA, após cultura das células em meio isento de soro durante 24 e 48 horas, respectivamente. Interessantemente, as células LNCaP, que são conhecidas por serem não-invasivos níveis elevados produzidos de cistatina C, enquanto que as linhas de células invasivas PC3 e DU-145 apresentaram menores níveis de secreção de cistatina C (Figura 3). células PC3, com um nível de expressão moderada de cistatina C foram escolhidos para estudos funcionais posteriores para avaliar os efeitos da superexpressão forçada e knockdown de cistatina C na invasão celular PC3.
ensaio ELISA de sobrenadantes a partir de três células cancerosas da próstata diferentes linhas, que foram semeadas 24 h ou 48 h antes experimento foi realizado. Os dados são apresentados como média de triplicados ± DP de 3 experiências.
Down-Regulação da cistatina C está ligado à invasão das células PC3
Uma vez que as células PC3 são invasivos, expressam nível moderado de cistatina C e têm AR funcional falta, portanto, pode ser um excelente modelo para estudos combinados sobre cistatina C e função AR. células PC3 foram transfectadas com cistatina C siARN vector ou vector de ARNsi de controlo durante 24 horas. A análise de imunotransferência confirmaram que a cistatina C ARNip bloqueado especificamente a expressão da proteína de cistatina C, em células PC3 (Figura 4A). Para examinar o efeito da cistatina C derrubar na modulação da actividade invasora de células PC3, em ensaios de actividade invasiva in vitro foram realizados para avaliar a percentagem de células PC3 que expressam cistatina C ou ARNsi de controlo que invadiram através de membranas revestidas de Matrigel. Uma proporção significativamente maior de células PC3, transientemente transfectadas com cistatina C siRNA, migraram através de câmaras de matrigel revestido em comparação com a das células PC3 transfectadas com ARNsi de controlo (Figura 4B-C). Em seguida, avaliamos se cistatina C knockdown pode ter efeito sobre a proliferação de células cancerosas da próstata. células PC3 transfectadas com cistatina C ARNsi de controlo ou ARNsi foram submetidos a um ensaio de incorporação de BrdU. A proliferação celular foi avaliada após 24 horas ou 48 horas de transfecção. Não houve diferenças significativas nas taxas de proliferação entre células PC3 transfectadas com ARNsi para a cistatina C, ou ARNsi de controlo foram observadas (dados não mostrados), sugerindo que a inibição da cistatina C não teve nenhum efeito sobre a proliferação de células PC3. Nós também avaliar o efeito da cistatina C sobre a distribuição do ciclo celular. A análise de citometria de fluxo foi realizada em células transfectadas com cistatina C ou ARNsi de controlo, não se observou que o silenciamento de cistatina C tiveram qualquer influência significativa sobre a distribuição de fases do ciclo celular em células PC3 (dados não mostrados). Em seguida, quisemos testar se a inibição de cistatina C podem ter qualquer efeito sobre os restos de células PC3 em resposta ao tratamento com o agente citotóxico. células PC3 transfectadas com ARNsi para a cistatina C, ou ARNsi de controlo foram tratados com o agente citotóxico de camptotecina em 10 ng /ml para induzir a apoptose. O tratamento de células PC3 com camptotecina induziu com sucesso a morte celular em células PC3. células PC3 transfectadas com ARNsi contra a cistatina C, no entanto, não mostraram nenhuma diferença significativa da apoptose induzida por camptotecina, em comparação com células PC3 transfectadas com ARNsi de controlo (dados não apresentados).
A). Immunoblotting de cistatina C em células PC3 após o tratamento com o controle (siCtr) e cistatina C (siCys) siRNA. B-C) Ensaio de Invasão em matrigel- revestido Boyden câmaras de células PC3 com knockdown cistatina C. imagem representativos de células invasoras é mostrado em (B) e a análise quantitativa de invasão do medindo a absorvância após a coloração das células com uma solução de células invasoras contendo mancha violeta de cristal fornecido no ensaio Transwell Invasion (Chemicon, Millipore, CA) (C) dados ± SD são representativos de pelo menos 3 experiências; * p . 0,01 (T-Student)
Devido inibição da cistatina C em células PC3 teve efeito significativo sobre a invasão de células PC3, que, portanto, avaliar se superexpressão de cistatina C pode ter efeitos inibidores sobre o comportamento invasivo das células PC3. Para induzir a superexpressão de cistatina C, em células PC3, células PC3 foram transfectadas com um vector de expressão de cistatina C, ou com um vector de expressão vazio. A sobre-expressão estável de cistatina C, em células PC3 foi conseguida após selecção de antibiótico. A sobre-expressão de cistatina C, em células PC3 foi confirmada por análise de imunotransferência (Figura 5A). Quando se investigou o efeito da sobreexpressão de cistatina C na invasão de células PC3, notou-se que uma proporção significativamente mais baixa de células que sobre-expressam PC3 cistatina C migraram através de câmaras de Boyden Matrigel-revestidas em comparação com células que expressam o vector de controlo (Figura 5B-C). Tomados em conjunto, os nossos dados actuais sugerem um papel importante para a cistatina C para inibir a invasão de células de cancro da próstata.
A) de imunotransferência da cistatina C, em células PC3, após a transfecção estável com pcDNA3.1 e plasmídeos de cistatina C-pcDNA3.1 . clones estáveis foram estabelecidas após 2 semanas de selecção em neomicina. B-C) ensaio de invasão de células PC3 com sobre-expressão de controlo ou de cistatina C plasmídeos. Imagens representativas de células são mostradas em B e quantificação (absorvância) de dados + SD de 3 ensaios independentes é mostrado em C. * p 0,05 (teste t-Student)
O papel de Erk2. Caminho na cistatina C efeitos mediados sobre Invasion
em seguida, quisemos investigar os mecanismos e vias celulares pelos quais cistatina C exerce seu efeito sobre a invasão de células PC3. vias de sinalização MAPK e vias de TGF-p tem sido demonstrado ter ligação funcional com enzimas proteolíticas incluindo a família de proteínas catepsina para promover a degradação da membrana basal, aumenta a invasão de células e mantém o crescimento de células tumorais. Smad 2/3 proteínas são as efetoras a jusante de sinalização TGF e alvo de MAPK vias /ERK, bem como, que, portanto, queria investigar se cistatina C pode ter uma ligação funcional directo a estas vias de sinalização. Temos primeiro examinou se cistatina C pode mediar as atividades de MAPK e de TGF-p caminhos através da regulação da expressão e fosforilação de Smad2 e ERK1 /2 em células PC3. Examinámos a fosforilação de Smad2 e ERK1 /2 em células PC3 transfectadas com cistatina C ou ARNsi de controlo (Figura 6A). A análise de imunotransferência mostrou que um aumento no nível de fosforiladas Smad2 e ERK1 /2 foi observada nas células PC3 transfectadas com cistatina C siRNA, sugerindo que ambos Smad2 e ERK1 /2 podem ser os efectores a jusante inibida por cistatina C (Figura 6A).
A). A análise de imunotransferência da P-Smad2 em células PC-3 após silenciamento de Smad2. B-C). ensaio de invasão em células PC-3 após o silenciamento de Smad2 simultaneamente com o knockdown de cistatina C. As imagens representativas são mostradas em B e os resultados quantitativos de 3 experiências independentes são apresentados em C. * p 0,05 (teste t de Student). D). Immunoblot com o anticorpo contra fosforilada (Ser383) e -Elk1 cistatina C nos lisados de células PC3 transfectadas transientemente com ARNsi cistatina C e ARNsi de controlo e de co-tratados com o inibidor de Erk2 (25 uM). Note-se que os blocos inibidores Erk2 fosforilação jusante da Elk1 uma meta de Erk2 em células com knockdown de cistatina C. Os dados são representativos para 2 experimentos. E-F). ensaio de invasão em células PC-3 após o silenciamento concomitante de cistatina C e a inibição da Erk2 com o inibidor selectivo. As imagens representativas são mostrados na resultados quantitativos e D de 2 experiências independentes são apresentados em E. * p 0,05, # P . 0,01 (t-teste de Student)
Para examinar o papel do funcionalmente activação Smad2 em células PC3, testamos se alvo knockdown Smad2 teve qualquer efeito sobre a invasão da célula tumoral. Nós projetamos siRNA para alvejar especificamente Smad2. A inibição da fosforilação de Smad2 através Smad2 siRNA knockdown mediado foi conseguida em células PC3 e foi confirmada por imunotransferência (dados não mostrados). Os ensaios in vitro de actividade invasivos revelou que a proporção de células que migram e PC3 invasores foram semelhantes em células PC3 transfectadas com ARNsi de Smad2 e em células PC3 transfectadas com ARNsi de controlo (Figura 6B-C). Em seguida, realizada simultaneamente knockdown alvo de Smad2 e a cistatina C, em células PC3. células PC3 que foram co-transfectadas com cistatina C siRNA e Smad 2 ou ARNsi de controlo foram novamente aplicado na câmara de invasão para o ensaio de invasão. Não houve diferenças na taxa de invasão entre as células PC3 que co-expressam a cistatina C siRNA e Smad 2 siRNA e células PC3 que co-expressam a cistatina C siRNA e ARNsi de controlo (Figura 6B-C), sugerindo que a inibição de Smad2 não teve efeitos adicionais sobre modular a invasão de células PC3 que expressam cistatina C siRNA e que Smad2 pode não estar envolvido em cistatina invasão de células tumorais mediada por C.
uma vez que um aumento do nível de fosforiladas /2 foi também observada em células Erk1 PC3 transfectadas com cistatina C ARNsi nas experiências anteriores, que, por conseguinte, investigado se ainda activação de ERK1 /2 mediado o efeito inibitório de cistatina C na invasão de células PC3. O tratamento com um inibidor da MEK (PD98059), um inibidor geral de MAPK não teve efeito sobre o comportamento invasivo das células PC3 que expressam cistatina C ou ARNsi de controlo (dados não apresentados). Decidimos para inibir seletivamente as atividades de Erk 1 ou Erk2.
Em primeiro lugar, nós inibida Erk 1 expressão através de siRNA alvo knockdown. Inibição de Erk 1 não teve nenhum efeito sobre a invasão de células PC3 que expressam ARNsi cistatina C (dados não mostrados), sugerindo que a ERK1 não pode ser envolvido em cistatina C invasão de células de tumor associado. Em seguida, utilizou-se inibidor selectivo da actividade Erk2, que bloqueou a fosforilação de Elk-1, um alvo a jusante de Erk2, em células PC3 que expressam ARNsi cistatina C (Figura 6D). Observou-se que Erk 2 inibidor inibiram significativamente a taxa de invasão em células que expressam ARNsi cistatina C em comparação com células que expressam ARNsi de controlo (Figura 6E-F). O inibidor Erk2 não teve nenhum efeito sobre a proliferação celular em células PC3, nas mesmas condições (dados não apresentados). Estes resultados sugerem que Erk2 pode ser um alvo a jusante da cistatina C. Isto sugere que as células PC3 que têm baixa cistatina C e elevado nível de actividade Erk2 pode tornar-se mais invasivo em comparação com células com níveis normais de cistatina C e Erk 2 actividade. Além disso, a cistatina C pode mediar a invasão das células tumorais através de MAPK /vias de sinalização ERK2.
AR Melhora celular Invasion na Ausência de cistatina C
AR é um alvo a jusante importante das vias MAPK /ERK e e inibição de actividade de ERK1 /2 irá levar a uma diminuição da expressão de AR nas células cancerosas da próstata [41]. A sobre-expressão de AR nas células PC3 foi mostrado para influenciar a invasão de células e crescimento in vitro [42]. Desde que estabelecemos uma ligação funcional direta entre cistatina C ea atividade Erk2, e temos demonstrado que os pacientes APC com baixos níveis de cistatina C e altos níveis concomitantes da AR mostrou uma tendência para um resultado pior em comparação com pacientes com alta cistatina C e de alta os níveis de AR, que, portanto, queria para avaliar a associação celular e molecular entre cistatina C e AR. Utilizou-se células PC3 que não possuem a AR funcional para investigar um papel de cooperação entre células PC3 AR e cistatina C. foram co-transfectadas com vector de expressão de AR, juntamente com a cistatina C siARN vector designado como “siCysC, AR” ou com um vector de controlo designado como “sictr, AR”. De um modo semelhante, as células PC3 foram também co-transfectadas com um vector de CMV e a cistatina C siRNA (designado como “siCysC, CMV”) ou um vector de expressão de CMV e um siRNA de controlo ( “sictr, CMV”). As células PC3 transfectadas foram então submetidos para ensaio de invasão. A sobre-expressão de AR com knockdown concomitante de cistatina C resultou em um aumento significativo na taxa de invasão de células PC3 em comparação com os controlos (Figura 7A-B). Assim, estes resultados sugerem que as células PC3 que não possuem a cistatina C, mas têm elevado nível de AR pode ser mais invasiva do que as células de controlo com níveis normais de cistatina C e AR.
A-B). ensaio de invasão de células PC3 transfectadas com ARNsi de controlo ou contra a cistatina C e AR coexpress�. As imagens de experiência representativa são mostrados em uma e as absorvâncias quantitativos de células invasoras (* p 0,05, cistatina C siRNA versus controle siRNA, # p 0,05 AR contra CMV, Student t-test) após afirmar com Solution celular Stain fornecidos em o ensaio Transwell Invasion (Chemicon, Millipore, CA) são mostrados na B. os dados são representativos de 3 experiências independentes.
Discussão
no presente estudo, nós mostramos que
in vitro
silenciamento de cistatina C por siRNA específico aumentou a invasão de células de câncer em cooperação com Erk2 e sinalização AR. Nós desvendou mecanismos moleculares novos pelos quais cistatina C afeta a invasão da célula tumoral demonstrando que a expressão cistatina C foi regulada negativamente em tumores da próstata primários em comparação com os tecidos benignos em 448 pacientes. Usando um TMA compreendendo amostras benignas e tumorais de 448 pacientes, que mostrou uma correlação inversa entre cistatina C e expressão MMP2. Vários estudos demonstraram de forma convincente que a cistatina C é um importante inibidor da catepsina B e a invasão de células de tumor [43], [44]. Catepsina influências B microambiente tumoral pela degradação da matriz extracelular e pela activação de outras enzimas proteolíticas, tais como a-uroquinase de tipo pró activador do plasminogénio (pro-uPA) e metaloproteases da matriz (MMPs), de modo que as células tumorais podem invadir activamente e metástase [45]. A sobre-expressão de cistatina C foi mostrado para inibir o potencial invasivo de melanoma e linhas celulares de glioblastoma humano [36], [43]. A nossa descoberta presente desde a investigação de materiais clínicos indica que há uma ligação direta entre cistatina C e MMP2 proteínas da matriz extracelular no câncer de próstata. Não investigámos o papel de cistatina C na modulação das atividades catepsina B em células de câncer de próstata, no entanto, é uma possibilidade aberta, considerando as correlações semelhantes em outro tipo de tumores. proteoma assinaturas que são características de proteólise revelou clivagem de MMP-2 diversos substratos conhecidos no contexto celular. Proteomic evidência de MMP-2 de processamento de novos substratos foi encontrada. proteína de cistatina C é um componente do substrato que é clivado por MMP-2 [40]. Nós fornecer mais evidências que suportam um papel anteriormente proposto de cistatina C para evitar tumorigênese e invasão de células de câncer, possivelmente devido à sua capacidade de inibir a atividade de proteínas da matriz extracelular [46], [47].
A nossa análise funcional em células PC-3 demonstrou ainda que a inibição de cistatina C por meio de knockdown mediada por siRNA resultou num aumento significativo na taxa de invasão de células PC3. Esta observação é consistente com a demonstração anterior em tumores prostáticos primária, quando os tumores mais invasivos apresentaram expressão muito baixa ou indetectável cistatina C. Assim, a cistatina C podem ser funcionalmente importante para as células a manter um comportamento normal, o que está em concordância com os nossos resultados presentes de que as células que sobre-expressam PC3 cistatina C por meio de transfecção transiente mostradas fenótipos menos invasivos.
A via ERK-MAPK é um mecanismo de sinalização comum para vários factores de crescimento que estão envolvidas em metástase e de resistência a drogas [48]. Ao empregar siRNA contra a cistatina C, mostramos que a cistatina C foi inversamente associado com o comportamento invasivo das células PC3, e que a cistatina C estava envolvido na regulação da atividade de Erk cinase.