Abstract

BBF2H7 é um retículo endoplasmático (ER) Resident transmembrana zipper básico leucina fator de transcrição (bZIP), que é clivada no domínio transmembranar por proteólise intramembranar regulada em resposta ao stress ER. O N-terminal citoplasmático clivada contendo a activação de transcrição e domínios bZIP transloca-se para o núcleo para promover a expressão de genes alvo. Em condrócitos, luminal clivado terminal C é extracelular segregada e facilita a proliferação de células vizinhas, através da activação da sinalização de Hedgehog. No presente estudo, verificou-se que

Bbf2h7

níveis de expressão significativamente aumentada 1,070-2,567 vezes em vários tipos de tumores, incluindo glioblastoma comparados com os respectivos tecidos normais, usando o banco de dados Oncomine Cancer Profiling. Em algumas linhas de células de cancro dependente de ligandos de Hedgehog, incluindo células de glioblastoma U251MG, o BBF2H7 C-terminal foi segregado a partir de células no meio de cultura e promoveu a proliferação de células de cancro através da activação da sinalização de Hedgehog. Knockdown de

Bbf2h7

expressão suprimiu a proliferação de células U251MG por downregulating sinalização de Hedgehog. A proliferação de células auditivos e sinalização Hedgehog foram recuperados por adição de BBF2H7 terminal C para o meio de cultura de

Bbf2h7

-knockdown U251MG células. Estes dados sugerem que o luminal secretada BBF2H7 C-terminal está envolvida na proliferação de células de cancro dependentes de ligando Hedgehog através da activação da sinalização de Hedgehog. Assim, o BBF2H7 C-terminal pode ser um novo alvo para o desenvolvimento de fármacos anti-cancerígenos

citação:. Iwamoto H, K matsuhisa, Saito A, Kanemoto S, R Asada, Hino K, et al. (2015) Promoção da proliferação de células cancerosas pelo Clivadas e secretada Luminal Domínios de ER estresse transdutor BBF2H7. PLoS ONE 10 (5): e0125982. doi: 10.1371 /journal.pone.0125982

Editor do Academic: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiológico Monzino, ITALY

Recebido: 15 de dezembro de 2014; Aceito: 27 de março de 2015; Publicado em: 08 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Iwamoto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte por doações da Takeda Science Foundation, Fundação médica YASUDA, a Fundação Nakajima, o Tokyo Foundation Biochemical Research, Fundação Kobayashi Internacional de bolsas de Estudo, NAGASE Science Foundation Tecnologia , a Fundação Mitsubishi, SEI Grupo CSR Foundation e The Society Japão para a Promoção da Ciência KAKENHI (25/677, 25251014, 25650069, 25861324, 24300135, 26460099). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o retículo endoplasmático (ER) é o organelo celular central responsável pela síntese, dobragem e modificações pós-tradução de proteínas destinadas para a via secretora. Vários estados patofisiológicos, tais como a depleção de cálcio ER, o stress oxidativo, a hipoglicemia, a expressão de proteínas mutantes e hipoxia, interferir com a dobragem correcta de proteínas, e proteínas desdobradas ou misfolded acumular no lúmen do ER. Tais condições, que são designadas colectivamente por estresse er, ter o potencial para induzir danos celulares. O ER responde a essas perturbações através da activação de uma via de transdução de sinal integrado chamado a resposta de proteína desdobrada (UPR) [1,2]. A activação do RPU leva a transient atenuação de translação para diminuir as exigências feitas ao ER, a indução da transcrição de genes que codificam as chaperonas ER-residente para facilitar a dobragem de proteínas, e a degradação do ER-associado (ERAD) para degradar as proteínas desdobradas que se acumularam no ER. Em células de mamíferos, há três transdutores de tensão ER bem estabelecidos: double-stranded RNA-dependente cinase de proteína semelhante retículo endoplasmático quinase (PERK),-inositol exigindo enzima-1 (IRE1), e factor de activação de transcrição 6 (ATF6) [ ,,,0],3-5]. PERK fosforila directamente o α-subunidade do factor eucariótico de iniciação (eIF2α), levando a uma redução dramática na síntese de proteínas celulares [6]. Por outro lado, e paradoxalmente, fosforilação de eIF2α também regula positivamente a expressão de ATF4 [1]. ATF4 transactiva a expressão da proteína pro-apoptótica, C /EBP-proteína homóloga (CHOP), proteínas pró-sobrevivência, tais como er, acompanhantes e proteínas de stress anti-oxidantes, [7]. IRE1 processa formas não excisado de

X-vinculativo-box proteína-1 | (

XBP1

) mRNA para gerar formas de splicing do mRNA [4,8]. proteínas XBP1 derivadas das formas de splicing

XBP1

mRNA induzir a expressão de chaperones ER residente e moléculas relacionadas com o ERAD. ATF6 é clivada no seu domínio transmembranar pelo Site-1 e -2 proteases (S1P e S2P, respectivamente) em resposta ao estresse ER [5,8]. O ATF6 N-terminal clivado transloca para o núcleo, e induz a expressão de ER-chaperonas residente para facilitar a dobragem de proteína.

Além das três transdutores de tensão ER canónicos, existem novos tipos de transdutores de tensão que partilham ER domínios de elevada semelhança de sequências com ATF6. Estes fatores de transcrição têm activação da transcrição e domínios de zíper básica leucina (bZIP) no seu N-terminal e incluem BBF2H7 /CREB3L2 [9], OASIS /CREB3L1 [10,11], Luman /lzip /CREB3 [12], CREBH /CREB3L3 [ ,,,0],13] e CREB4 /AIbZIP /Tisp40 /CREB3L4 [14]. Um dos membros da família OASIS, BBF2H7, é preferencialmente expresso em condrócitos [15,16]. BBF2H7 é clivada no domínio transmembranar por proteólise intramembranar regulamentado (PIR), em resposta ao stress ER. A citoplasmático N-terminal clivado contendo os domínios de activação de transcrição bZIP e transloca-se para o núcleo para promover a expressão de genes alvo, incluindo

Sec23a

[15]. Em contraste, o C-terminal clivado é secretada extracelularmente e liga-se tanto directamente hedgehog indiana (Ihh) e o seu receptor, patched-1 (Ptch1), seguido pela activação de Hedgehog (Hh) de sinalização [16]. A via mediada pela BBF2H7 terminal C desempenha um papel na proliferação de condrócitos no desenvolvimento da cartilagem. As funções de ambas as extremidades N- e C-terminal são essenciais para o desenvolvimento da cartilagem rato.

sinalização de Hh é necessário para a diferenciação celular e a formação de órgãos durante a embriogénese [17]. No adulto, a sinalização de Hh permanece activa em certos órgãos em que está implicada na regulação de manutenção e proliferação de células estaminais. Nos mamíferos, a via de sinalização de Hh é iniciada por três ligandos Hh (hedgehog Sonic [Shh], Desert hedgehog [Dhh] e Ihh) [18]. ligandos de Hh se ligam ao receptor de Hh transmembranar, Ptch1. Na ausência de ligandos de Hh, Ptch1 inibe a função da proteína transmembranar Smoothened (Smo), o qual activa oncogene associadas a um glioma (Gli1) [19,20]. Uma vez que os ligandos se ligam a Hh Ptch1, Smo é libertado a partir da inibição e promove a activação do factor de transcrição Gli1. Activado Gli1 inicia a transcrição de genes alvo Hh tais como

Gli1

,

forkhead caixa de L1

(

Foxl1

),

Ptch1

,

ciclina D1

e

ciclina E1

[21].

sinalização Hh também está envolvido na promoção do câncer. Os pacientes com a síndrome de Gorlin (ou síndrome do nevo das células basais) ter herdado inactivação de mutações em Ptch1, levando a sinalização de Hh constitutivamente activa na ausência de ligandos de Hh [22]. Estes pacientes têm uma elevada incidência de carcinomas de células basais (BCC), um tumor da pele por queratinócitos, além de meduloblastomas e rabdomiossarcomas. Quase todos os casos esporádicos de CBCs são causados ​​pela activação da via de sinalização de Hh através Ptch1 perda de heterozigosidade e /ou de inactivação ou activação de mutações em Smo, que diminuem a sua inibição por Ptch1. Além disso, vários cancros dependentes de ligandos que envolvem a sobre-expressão de Hh de ligandos de Hh, foram identificados nos últimos anos, incluindo os cancros do pulmão, pancreático, da mama e da próstata [23,24]. Em todos os casos, estes cancros responder a ligandos de Hh de uma maneira autócrina. ligandos de Hh segregadas a partir de células cancerosas actuar sobre as células que segregam (ou células cancerosas vizinhas) para estimular a proliferação celular e /ou a sobrevivência, o que leva ao crescimento do tumor. Assim, os inibidores específicos de sinalização de Hh pode servir como agentes anticancerígenos. No entanto, não se sabe como ligantes HH, seu receptor Ptch1 ea sinalização a jusante são regulados em células cancerosas.

Como mencionado acima, o BBF2H7 C-terminal activa a sinalização Hh pela directamente vinculativa para ambas ligando hh e Ptch1, que promove a proliferação celular. Curiosamente, o

gene Bbf2h7

foi identificado pela primeira vez como o parceiro de

fundido no sarcoma

(

FUS

) em um gene quimérico encontrado em fibromixóide sarcoma de baixo grau (LGFMS) [25]. Relatórios recentes têm mostrado que os genes-alvo de Hh e HH são regulados positivamente em pacientes LGFMS [25,26]. Portanto, a hipótese de que BBF2H7 pode ter um papel importante na proliferação de células de cancro dependentes de ligandos de Hh. Aqui, descobrimos que a BBF2H7 C-terminal clivada é secretada a partir de determinados tipos de células cancerosas e promove a proliferação celular através da ativação da sinalização Hh.

Materiais e Métodos

conjuntos de dados Oncomine microarrays para

Bbf2h7

conjuntos de dados de expressão

Microarray para glioblastoma (The Cancer Genome Atlas-glioblastoma multiforme e Cérebro de grau inferior Glioma DNA Copiar Número de dados de 2013), carcinoma da mama ductal invasivo (O carcinoma Breast Cancer Genome Atlas-invasiva gene Expression dados de 2011), carcinoma escamoso cervical [27], adenocarcinoma da próstata [28], o adenocarcinoma do cólon [29], adenocarcinoma gástrico (The Cancer Genome Atlas-estômago adenocarcinoma DNA Copiar Número de dados de 2013), e adenocarcinoma pancreático (The Cancer Genome Atlas-pâncreas Adenocarcinoma DNA Copy Number dados de 2013) foram acessados ​​usando o banco de dados Oncomine Cancer Profiling (versão 4.4.4.4, www.oncomine.org) para investigar

expressão Bbf2h7

em vários cancros.

cultura celular

HEK293T (derivada de rim embrionário humano; American Type Culture Collection [ATCC]),

Bbf2h7

– /- fibroblastos de rato embrionárias (MEF, derivado de

Bbf2h7

– /- ratos utilizando protocolos previamente publicados [15 ]), MCF7 (derivadas de cancro da mama humano; ATCC) e HeLa (derivada de cancro cervical humano, células ATCC) foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Life Technologies) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS). LNCap (derivadas de cancro da próstata humano; ATCC) foram cultivadas em células de Roswell Park Memorial Institute forma-1640 (Life Technologies) contendo 10% de FBS. U251MG (derivado de glioblastoma humano; JCRB banco de células), e LS174T (derivada de cancro do cólon humano; ATCC) foram cultivadas em células de meio mínimo essencial de Eagle (DS Pharma) contendo 10% de FBS. Para aliviar o stress do ER, as células cancerosas foram tratados com 4-fenilbutirato de metilo (4-PBA; WAKO), uma chaperona química. Para induzir o stress do ER, as células cancerosas foram tratados com 1 uM tapsigargina. (TG; WAKO), um inibidor de ER Ca

2 + -ATPase

isolamento de ARN, transcrição reversa-PCR (RT-PCR) e quantitativa PCR em tempo real

o ARN total foi isolado pelo método de guanidina fenol utilizando ISOGEN (Nippon Gene) de acordo com o protocolo do fabricante. Alíquotas de RNA purificado 1 ug foram transcrito reversamente em ADNc de primeira cadeia em um volume de 20 ul de reacção utilizando 200 L de Moloney vírus da leucemia murina de transcriptase reversa (Life Technologies) [30]. A PCR foi realizada utilizando conjuntos de iniciadores específicos, num volume total de 20 uL de ADNc consistindo em 1 ul, 0,5 uM de cada iniciador, dNTP 0,2 mM, 1 U de DNA polimerase (Agilent), e tampão de PCR (Agilent). As sequências de iniciador foram como se segue:

Gli1

para a frente, 5′-GAAGCCGTATGTATGTAAGCTCC-3 ‘;

Gli1

reverso, 5′-CTTGGGCTCCACTGTAGAAATG-3 ‘;

Foxl1

frente, 5′- ACAGGCATAGAGGTGACTTTTGG-3 ‘;

Foxl1

reverso, 5′-TTCACAGAGGCTGAGAGTTTGG-3 ‘;

XBP1

frente, 5′- ATGGATGCCCTGGTTGCTGAAG-3 ‘;

XBP1

reverso, 5′- GGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC-3 ‘;

β-actina

para a frente, 5′-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTAC-3 ‘;

β-actina

reverso, 5′- TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3 ‘. parâmetros do ciclo de PCR foram 20 s a 94 ° C, 20 s a 58 ° C e 25 s a 72 ° C para 18-33 ciclos (

Gli1

, 33;

Foxl1

, 31 ;

XBP1

, 25;

β-actina

, 18), seguido por 72 ° C durante 5 min. Alíquotas (5 ul) de cada mistura reaccional foram sujeitos a electroforese em géis de poliacrilamida a 4,8%. A densidade de cada banda foi quantificada usando o Photoshop Elements 6.0 (Adobe Systems).

Para analisar os níveis de expressão de mRNA, quantitativa PCR em tempo real foi realizada utilizando Luz Cycler 480 Sistema II (Roche) e Luz Cycler SYBR Green I Mestre (Roche). As reações de PCR foram realizadas usando KAPA SYBR Kit qPCR RÁPIDO Otimizado para Light Cycler 480 (KAPA). Todos os resultados foram normalizados para a expressão de

ARNm endógeno

β-actina e foram expressos como aumentos relativos ou diminuições na expressão em comparação com os controlos.

Western blotting

Proteínas eram extraiu-se a partir de células utilizando tampão de lise celular (1% de Triton X-100, EDTA 100 mM, NaCl 50 mM, HEPES a 10 mM, sacarose 500 mM, e um cocktail de inibidores de protease [MBL International]). As concentrações de proteína dos lisados ​​celulares foram determinadas utilizando um kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA (Thermo). Quantidades iguais de proteína foram sujeitos a electroforese em 12% de gel de SDS-poliacrilamida, e, em seguida, transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (Bio-Rad). Para imunotransferência, foram utilizados os seguintes anticorpos e diluições: policlonal de coelho anti-BBF2H7 C-terminal (Abcam; 1: 1000), rato policlonal anti-BBF2H7 terminal-N (o anticorpo gerado [15]; 1: 1000), rato monoclonal -anti-β actina (Sigma; 1: 3000), anticorpo policlonal de coelho anti-interleucina 6 (IL-6) (Abcam; 1: 250), anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina (Sigma; 1: 3000), e alcalino conjugado com fosfatase anti-IgG de ratinho (Enzo; 1: 3000). proteínas marcadas foram detectadas utilizando cloreto nitro-azul de tetrazólio (WAKO) e 5-bromo-4-cloro-3′-indolylphosphatase sal de p-toluidina (Roche).

A imunoprecipitação

Para detectar BBF2H7 terminal C no meio de cultura, os sobrenadantes de cultura foram incubados com anti-BBF2H7 N-terminal, anti-BBF2H7 C-terminal, ou anti-IL-6 os anticorpos durante a noite. As amostras foram então precipitados com Proteína G agarose (Life Technologies), seguida por transferência de Western. IL-6 foi usado como um controlo de carga.

A imuno-histoquímica

amostras do tumor foram recolhidas durante a cirurgia do Hospital da Universidade de Hiroshima, congelado em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. As secções foram fixadas em acetona fria a -20 ° C e, em seguida, numa solução tampão de fosfato de paraformaldeído a 4%. Para a imunocoloração de BBF2H7 C-terminal, foi utilizado um anticorpo anti-BBF2H7 terminal-C como o anticorpo primário e kit Dako Envision (Agilent) para a detecção de acordo com as recomendações do fabricante. Todos os procedimentos estavam de acordo com a Comissão de Ética para Genoma Humano Research da Universidade de Hiroshima.

Plasmids e transfecção

BBF2H7 Humano full-length, N- e C-terminal cDNAs foram obtidos por blunt- a ligação de extremidades de produtos de PCR correspondentes aos aminoácidos 1-520, 1-377 e 431-520 (GenBank Número de Acesso, NP_919047.2) com uma sequência do péptido de sinal de BiP (proteína de ligação de imunoglobulina) (aminoácidos 1-16, número de acesso GenBank , NP_005338.1) na extremidade N-terminal. O full-length BBF2H7, N- e C-terminal Os cDNAs foram clonados num pcDNA3.1 (+) do vetor. células HEK293T e

Bbf2h7

– /-. MEFs foram transfectadas com cada plasmídeo usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante

Os bioensaios de proliferação celular

células U251MG (1 × 10

5) foram plaqueadas em placas de 6 cm, em cultura a 37 ° C durante 24 h, e, em seguida, transfectadas com mexidos ou

Bbf2h7

pequeno ARN interferente (siRNA) utilizando Lipofectamina 2000 de acordo com o protocolo do fabricante. Para

Bbf2h7

knockdown, foram usadas as seguintes sequências: 5′-GGAAGAAGGUAGAGGUUCU-3 ‘(siBBF2H7-1) e 5′-CCAGAAACCUGCUGAUCUA-3’ (siBBF2H7-2). células U251MG foram incubadas a 37 ° C durante 24 h após transfecção, e em seguida, o meio de cultura foi substituído. Os números de células foram contadas nos dias indicados após a transfecção. siRNAs foram adquiridos de Bioneer (Daejeon, Coreia do Sul).

Além disso, após a transfecção com ovos mexidos ou

Bbf2h7

siRNAs,

Bbf2h7

-knockdown U251MG células foram expostas ao meio condicionado recolhido a partir de células HEK293T transfectadas com um vector vazio (Mock) ou BBF2H7 C-terminal (C-Sup.), ou a C-Sup. em que BBF2H7 C-terminal foi puxado para baixo através de imunoprecipitação utilizando um anticorpo anti-BBF2H7 C-terminal (C-Sup. + Ab.). Os números de células foram contadas nos dias indicados após a transfecção. Para o ensaio de proliferação de células, foi também utilizado um kit de contagem de células (ensaio de WST-8, DOJINDO) de acordo com o protocolo do fabricante.

Para confirmar a activação da sinalização de Hh por BBF2H7 terminal C, as células foram tratadas com U251MG Shh recombinante (R D Systems), cyclopamine (WAKO) ou purmorphamine (WAKO)

Análise estatística

as comparações estatísticas entre duas amostras foram feitas usando o Student

t

. -teste.

P

valores 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

A expressão de BBF2H7 em tumores e secreção de sua clivada C-terminal a partir de células cancerosas

O

Bbf2h7

gene foi identificado pela primeira vez como o parceiro de

FUS

em um gene quimérico encontrado em LGFMS [25]. Portanto, é possível que BBF2H7 pode estar envolvida na proliferação de células cancerosas. Foram examinados os níveis de

Bbf2h7

expressão em vários tipos de tumores usando o banco de dados Oncomine Cancer Profiling (Fig 1A). Os conjuntos de dados incluiu 37, 61, 5, 28, 94, 94 e 8 amostras de tecidos normais, e 582, 389, 40, 59, 52, 173 e 32 amostras de tecidos malignos do glioblastoma, carcinoma ductal invasivo de mama, carcinoma escamoso cervical, próstata adenocarcinoma, adenocarcinoma do cólon, adenocarcinoma gástrico e adenocarcinoma pancreático, respectivamente. Como mostrado na Fig 1A,

Bbf2h7

níveis de expressão mostraram um aumento significativo de 1,070-2,567 vezes em vários tipos de tumores em comparação com aqueles nos respectivos tecidos normais. Em contraste, não houve regulação positiva significativa de

expressão Bbf2h7

em adenocarcinomas gástricos ou pancreáticas, indicando que a expressão do gene da

Bbf2h7

foi especificamente reforçada em certos tipos de tumor.

(a) a expressão aumentada de

Bbf2h7

em cancros humanos. conjuntos de dados de microarray de tumores foram acessados ​​no banco de dados Oncomine Cancer Profiling (versão 4.4.4.4, www.oncomine.org). Os diagramas de caixa mostrando aumento da expressão de

Bbf2h7

durante tumorigênese de vários cancros foram construídos a partir Oncomine. O eixo y representa o log

2 intensidade centrada na mediana (expressão normalizada). A linha dentro da caixa representa o valor da expressão mediana para cada grupo, e as bordas superior e inferior da caixa indica o po 75

e 25

percentis da distribuição, respectivamente. As linhas (filamentos) de cada caixa de estender-se ao th 90

e 10

th percentis da distribuição. Os pontos pretos fora das extremidades dos bigodes representam os maiores e os menores pontos de dados. Os diagramas de caixa que descrevem a distribuição de

expressão Bbf2h7

dentro de cada amostra e de um estudante

t

-test dando um

P valor

de comparação de

Bbf2h7

expressão entre amostras de tecidos normais e malignas foram obtidos diretamente através Oncomine. amostras de tecido do cólon normal, incluindo cólon ascendente, descendente cólon e reto. (B) Previsto características peptídicos de BBF2H7 humano. activação da transcrição, fecho de leucina de base (bZIP) e os domínios transmembranares, bem como um local de protease de local-1 (S1P) são indicadas. (C) Sob condições de stresse ER, BBF2H7 é transportada do RE para o aparelho de Golgi e clivada no local da S1P [9]. O BBF2H7 N-terminal clivado actua como um factor de transcrição por meio da ligação ao elemento de resposta a AMP cíclico (CRE) de genes alvo [15]. Em contraste, o clivado BBF2H7 terminal C é extracelular segregada [16]. (D) Western blotting do endógeno de comprimento completo e o BBF2H7 N- ou C-terminal de BBF2H7 usando lisados ​​de células (painel esquerdo) ou meio de cultura (painel da direita) de várias linhas de células de cancro humano. BBF2H7 N-terminal, BBF2H7 C-terminal ou de IL-6 no meio de cultura foi imunoprecipitado usando anti-BBF2H7 N-terminal (painel superior), anti-BBF2H7 terminal C (painel do meio), ou anticorpos anti-IL-6-anticorpos ( painel de fundo), respectivamente. β-actina ou IL-6 foi usado como controlo de carregamento. Análise (E) por RT-PCR de

XBP1

expressão de ARNm em várias linhas celulares de cancro humano.

XBP1-s

e

XBP1-u

indicam formas de splicing e não excisado de

XBP1

, respectivamente. Note-se que

XBP1-s

foi detectado em todas as linhas celulares de cancro, indicando que estas células são submetidos a estresse ER. Análise (F) por RT-PCR de

XBP1

expressão de ARNm em células U251MG tratados com 2 mM de PBA-4, um acompanhante química, durante 3 h. (L) Quantificação de

XBP1-s

expressão em F. As barras de erro representam a média ± desvio padrão de cinco experiências independentes. **

P Art 0,01. (H) transferência de Western de células U251MG BBF2H7 em tratados com 1 uM tapsigargina (TG), um inibidor de ER Ca

2 + -ATPase, durante 6 h. (I) A imuno-histoquímica de secções de tecido cerebral de pacientes com glioblastoma, utilizando um anticorpo específico do terminal C anti-BBF2H7. sinais fortes foram detectadas tanto no citosol das células do cancro (indicado por uma seta) e no seu meio circundante espaço extracelular (indicada com setas). painel esquerdo mostra uma ampliação baixa, eo painel da direita mostra uma ampliação superior do painel à esquerda. As barras de escala indicam 50 uM (painel da esquerda) e (painel da direita) de 10 um.

BBF2H7 é clivada no domínio transmembranar, em resposta ao stress ER (Figura 1B e 1C) [9]. O N-terminal promove a expressão de genes alvo, incluindo

Sec23a

[15]. Em contraste, o C-terminal é segregada a partir de células e facilita a proliferação de células vizinhas, através da activação de sinalização de Hh em condrócitos [16]. Em seguida, examinámos a expressão de BBF2H7 de comprimento completo e a sua clivado N- e C-terminal em lisados ​​das seguintes linhas de células de cancro: U251MG glioblastoma, MCF7 do cancro da mama, cancro do colo do útero HeLa, cancro da próstata LNCap e cancro do cólon LS174T. Detectamos a 80 kDa de comprimento completo e a sua BBF2H7 clivado N-terminal (50 kDa) e C-terminal (20 kDa) nos lisados ​​de quase todas as linhas de células de cancro excepto as células LS174T (Figura 1D). BBF2H7 C-terminal, mas não de comprimento completo BBF2H7 ou o seu N-terminal, foi também detectado no meio de cultura dessas linhas de células, indicando que o C-terminal clivado foi segregada a partir destas células para o meio de cultura. A clivagem da BBF2H7 depende de estresse do RE [9]. Por isso, fizemos o check-se as linhas celulares de cancro foram submetidos a estresse ER. Como se mostra a Fig 1E-1G, as formas de splicing

XBP1

[8], um marcador de ER stress, foram observadas em todas as linhas celulares de cancro. O tratamento de células U251MG com 4-PBA [31], uma dama de companhia química, diminuiu as formas de splicing

XBP1

em níveis basais e estresse ER aliviada, indicando que as células cancerosas que foram verificados sob condições de estresse ER. Além disso, constatou-se que BBF2H7 foi clivado em resposta ao stress em células de cancro ER (Fig 1H). Estes dados mostraram que BBF2H7 foi clivado e o seu C-terminal foi segregada extracelularmente em resposta ao stress ER sob homeostase nestas linhas celulares de cancro, excepto para as células LS174T. Em seguida, para confirmar que a proteína é expressa em BBF2H7 tumores, foi realizada imuno-histoquímica utilizando secções do cérebro de doentes com glioblastoma e um anticorpo anti-BBF2H7 C-terminal específico (Fig 1I). sinais fortes foram detectadas tanto no citosol das células do cancro e no seu espaço extracelular circundante. Estes resultados indicaram que BBF2H7 foi altamente expressa no glioblastoma e que o C-terminal foi clivado extracelularmente segregadas a partir de células cancerosas.

proliferação de células cancerosas de uma maneira dependente de Shh

Sabe-se que BBF2H7 C-terminal liga-se a ambos os ligandos de Hh e o seu receptor, Ptch1, e promove a sinalização de Hh [16]. Para examinar se as linhas celulares de cancro com crescimento celular elevada BBF2H7 expressão melhorada e mostra a activação da via de sinalização de Hh de um modo dependente do ligando, que tratada estas linhas celulares de cancro com Shh recombinante (Figura 2A-2C). O tratamento com Shh recombinante resultou na regulação positiva significativa de genes alvo Hh tais como

Gli1

e

Foxl1

em BBF2H7 expressando linhas celulares de cancro e crescimento celular aumentada. No entanto, as células LS174T, que não expressam BBF2H7, não mostraram resposta ao tratamento com Shh recombinante. Estes resultados sugerem que as quatro linhas celulares de cancro que segregam BBF2H7 C-terminal melhoraram o crescimento de células de uma forma Shh-dependente.

(a) a análise de RT-PCR dos genes alvo de Hh em várias linhas celulares de cancro tratados com 500 ng /mL de Shh recombinante durante 48 h. (B) as análises quantitativas-PCR em tempo real de expressão de Hh genes alvo em A. As barras de erro representam a média ± desvio padrão de cinco experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. linhas de células (C) O cancerosas foram cultivadas durante 5 dias após o tratamento com 500 ng /ml 5. As barras de erro Shh e analisados ​​por ensaios de WST-8 no dia recombinantes representam a média ± desvio padrão de cinco experiências independentes. *

P Art 0,05.

BBF2H7 C-terminal aumenta a sinalização de Hh em células cancerosas

Como se mostra na figura 1A e 1D, BBF2H7 foi elevada em alguns tumores e linhas celulares de cancro. Foram examinados os papéis de BBF2H7 N-terminal e C-terminal na proliferação de células por transfecção de vectores de expressão em células cancerosas. BBF2H7 N-terminal dificilmente afectada a proliferação das células, indicando que o N-terminal não tem o potencial para promover a proliferação celular em células cancerosas. Em contraste, BBF2H7 de comprimento completo e C-terminal ligeiramente aumentada de proliferação de células em comparação com o controlo, no entanto, as diferenças não foram significativas (dados não mostrados). A produção de BBF2H7 de comprimento completo e C-terminal pelos vectores de expressão podem não ser suficientemente elevado para promover significativamente a proliferação celular. Nós pensamos que a BBF2H7 de comprimento completo produzida e C-terminal pelos vectores de expressão teve um efeito menor sobre a proliferação celular, porque BBF2H7 endógena foi altamente expressa em células U251MG. Portanto, transfectadas BBF2H7 humana de comprimento completo, N- ou C-terminal em

Bbf2h7

– /- MEFs [15], cuja proliferação celular foi diminuída em comparação com MEFs de tipo selvagem, para eliminar o efeitos de BBF2H7 endógeno sobre a proliferação celular (Fig 3A e 3B). A transfecção de BBF2H7 de comprimento completo ou C-terminal em

Bbf2h7

– /- MEFs restaurada a proliferação de células, no entanto, a transfecção de BBF2H7 N-terminal por si só não melhorou a proliferação das células, indicando que o C humano BBF2H7 -terminus, mas não o N-terminal, tem o potencial para promover a proliferação de células

(a, B)

Bbf2h7

-. /- MEFs foram cultivadas durante 5 dias após a transfecção com BBF2H7 de comprimento completo (completo), N-terminal (N), C-terminal (C) ou um vector vazio (Mock), e analisados ​​por célula de contagem no dia 5 (a) e ensaio de WST-8 na hora indicada Os pontos (B). WT e KO indicam MEFs de tipo selvagem e

Bbf2h7

– /- MEFs, respectivamente. As barras de erro representam a média ± desvio padrão de cinco experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. (C) Análise de RT-PCR dos genes alvo de Hh em várias linhas celulares de cancro expostas ao meio condicionado recolhido a partir de células HEK293T transfectadas com BBF2H7 C-terminal (C-Sup. +) Ou um vector vazio (C-Sup.-) para 48 h. analisa (D) Quantitative PCR em tempo real de expressão de Hh genes alvo em barras de erro representam C. a média ± DP de cinco experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. análise (E) RT-PCR de genes alvo de Hh em células U251MG tratados com C-Sup., C-Sup. empobrecido de BBF2H7 C-terminal através de imunoprecipitação utilizando um anticorpo anti-BBF2H7 C-terminal (C-Sup. + Ab.), ou C-Sup. na presença de 5 uM ciclopamina (C-Sup. + PCN). Mock indica meio condicionado recolhido a partir de células HEK293T transfectadas com um vector vazio. analisa (F) Quantitative PCR em tempo real de expressão de Hh genes alvo em barras de erro E. representam a média ± desvio padrão de cinco experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. células U251MG (G, H) foram cultivadas durante 5 dias após o tratamento condicionado e analisados ​​por meio de contagem celular no dia 5 (G) e WST-8 ensaios nos dias indicados (H). As barras de erro representam a média ± desvio padrão de cinco experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01.

O BBF2H7 C-terminal segregada foi reportado para promover a proliferação de células de condrócitos através da activação de sinalização de Hh [16]. Para investigar ainda mais os efeitos de secretada BBF2H7 terminal C na proliferação de células de cancro, as linhas celulares de cancro foram expostas ao meio condicionado recolhido a partir de células HEK293T transfectadas com BBF2H7 C-terminal humano (C-Sup.) Contendo uma sequência de péptido de sinal BiP na sua N-terminal, para permitir a sua secreção a partir de células. O tratamento de linhas celulares de cancro com C-Sup. resultou na supra-regulação de genes alvo significativo HH, tais como

Gli1

e

Foxl1

, em todas as linhas celulares excepto para as células LS174T (Figura 3C e 3D). Em particular, as células U251MG e LNCap mostrou indução mais significativa de genes alvo de Hh, indicando que os efeitos de C-Sup. na sinalização de Hh não foram diferentes entre as linhas celulares de cancro. Para confirmar que o BBF2H7 C-terminal segregada promoveu a proliferação celular através da activação de sinalização de Hh, nós examinamos se a Hh sinalização em células U251MG ainda ser activado após a depleção de BBF2H7 C-terminal a partir de C-Sup. por imunoprecipitação utilizando um anticorpo anti-BBF2H7 C-terminal (C-Sup. + Ab .; Fig 3E-3H). Como esperado, o esgotamento dos BBF2H7 C-terminal de C-Sup. causou uma diminuição significativa na expressão de genes alvo de Hh e na proliferação celular. Além disso, o tratamento com ciclopamina (CPN) [32], um antagonista que inibe a Smo Smo e sua sinalização de Hh a jusante, cancelou os efeitos de C-Sup. na indução de genes alvo Hh tais como

Gli1

e

Foxl1

(Fig 3E e 3F). Além disso, a promoção da proliferação de células por C-Sup. foi suprimido por tratamento com PCN (Figura 3G e 3H), sugerindo que a BBF2H7 C-terminal segregada actua a montante de Smo e aumenta a proliferação dependente de ligandos de Hh.

Efeitos de

Bbf2h7

siARN em a proliferação de células cancerosas

a seguir, determinou se knockdown de

Bbf2h7

suprime o crescimento celular por downregulating sinalização de Hh em células cancerosas. Para este fim, foram utilizados dois siRNAs diferentes (siBBF2H7-1 e siBBF2H7-2). 0,001. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001. *

P Art *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001. *

P Art