Abstract

Recentemente, alvejando células-tronco cancerosas (CSCs ) metabolismo está se tornando uma abordagem terapêutica promissora para melhorar os resultados do tratamento do câncer. No entanto, o conhecimento do estado metabólico dos CSCs em câncer de pulmão de pequenas células ainda está faltando. Neste estudo, descobrimos que CSCs tinham significativamente menor taxa de consumo de oxigênio e taxa de acidificação extracelular do que as células cancerosas não estaminais. Entretanto, esta subpopulação de células consumido menos de glicose, produziram menos de lactato e mantidos níveis mais baixos de ATP. Nós também revelou que CSCs poderia produzir mais ATP através da fosforilação em nível de substrato mitocondrial durante a inibição respiratória em comparação com as células cancerosas não estaminais. Além disso, eles foram mais sensíveis à supressão da fosforilação oxidativa. Portanto, oligomicina (inibidor da fosforilação oxidativa) poderia severamente prejudicar e habilidades de iniciação do tumor de CSCs formadoras de esfera. Nosso trabalho sugere que CSCs representam subpopulações de tumor metabolicamente inativas que sustentam em um estado que mostra baixa atividade metabólica. No entanto, a fosforilação do substrato de nível mitocondrial das CSCs pode ser mais activo do que a de células de cancro não estaminais. Além disso, CSCs mostrou utilização preferencial de fosforilação oxidativa sobre glicólise para atender a sua demanda de energia. Estes resultados alargar a nossa compreensão do metabolismo dos CSCs, potencialmente fornecer novas estratégias de tratamento visando vias metabólicas no cancro do pulmão de pequenas células

Citation:. Gao C, Shen Y, Jin F, Miao Y, Qiu X (2016) Cancer Stem As células em pequenas células linhagem celular de câncer de pulmão H446: Dependência Superior na fosforilação oxidativa mitocondrial e substrato de nível fosforilação que não estaminais células cancerosas. PLoS ONE 11 (5): e0154576. doi: 10.1371 /journal.pone.0154576

editor: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, México |

Recebido: 25 Março, 2015; Aceito: 15 de abril de 2016; Publicado: 11 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Gao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. Este estudo foi apoiado pelo Programa de Pesquisa da básica aplicada e tecnologias de ponta de Tianjin sob Contrato No. 14JCZDJC35500

interesses concorrentes:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é um tipo de tumor altamente agressivo que representa cerca de 15% de todos os casos de câncer de pulmão [1,2]. Embora os pacientes com SCLC tem uma boa resposta clínica inicial para quimio- terapia de radiação, a maioria dos pacientes tratados com estas abordagens irão recair após um curto período de [3]. Isto pode, em parte, ser atribuído à incapacidade de erradicar cancro de células estaminais (CSCs), que têm a capacidade de se auto-renovar, de se diferenciarem em múltiplas linhagens e de dar início a tumores em ratinhos imunocomprometidos [4,5]. CSCs são acreditados para ser mais resistente a Radio- e quimio-terapia do que as células de cancro não estaminais [5]. Portanto, é crucial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas promissoras alvo CSCs por superar sua resistência aos medicamentos.

Recentemente, parece cada vez mais claro que a “reprogramação metabólica” de células cancerosas tem sido uma característica emergente do fenótipo do câncer [6 , 7]. Ao contrário das células normais, as células cancerígenas adoptar uma via metabólica alternativa e exibem metabolismo de glucose melhorado e a produção de lactato, mesmo na presença de oxigénio [8-10]. Este uso preferencial de glicólise aeróbica [11], é conhecido como o efeito de Warburg. Embora glicólise aeróbica é pensado para ser um fenômeno quase universal nas células cancerosas, características metabólicas dos CSCs e sua relevância na terapêutica do câncer ainda permanecem controvérsias [12]. Ciavardelli et al [13] relataram que as células-tronco do câncer de mama é mais glycolytic do que suas contrapartes não-tronco. O estudo de Liao [14] e seus colegas também mostrou que o câncer de ovário células estaminais-como predominantemente metabolizar a glicose pela glicólise anaeróbia e do ciclo das pentoses. Enquanto isso, Yuan et al [5] demonstraram que as células-tronco glioblastoma (GSCS) exibem uso preferencial da glicólise na respiração mitocondrial. No entanto, Vlashi et al [15] indicaram que GSCS confiar mais na fosforilação oxidativa (FOX) do que a glicólise. Lagadinou et al [16] também demonstraram que CSCs mostrou uma maior dependência de OXPHOS para fornecimento de energia em células de leucemia. Pasto et al [9] demonstraram que as células-tronco cancerosas de pacientes com câncer epitelial de ovário exibiu um perfil metabólico dominado por OXPHOS. Embora existam dados publicados limitados sobre as propriedades metabólicas de CSCs [17], nenhum em SCLC. Portanto, para projetar novas abordagens terapêuticas que têm como alvo vias metabólicas de CSCs em SCLC, profundo conhecimento do estado metabólico desta subpopulação de células é urgentemente necessária [7].

Para explorar as propriedades metabólicas de CSCs, a primeira missão é enriquecimento para CSCs em células SCLC. Isolamento de CSCs tanto in vivo como in vitro baseia-se em marcadores de superfície específicos que facilitam a classificação de células cancerosas em subpopulações fenotipicamente distintas [18]. -Tipo uroquinase de receptor de activador de plasminogénio (uPAR) é uma proteína de glicosilfosfatidilinositol (GPI) ancorada [19] e é geralmente regulada positivamente em vários tipos de cancros [20]. É importante ressaltar que o nosso trabalho eo dos outros identificou uPAR como um mediador da função das células-tronco do câncer [21,22]. Por exemplo, uPAR

+ células em linhas de células SCLC mostrou resistência a múltiplas drogas e atividade clonogênica melhorada in vitro em comparação com uPAR

– células [23]. Trabalhos anteriores de nosso laboratório também mostraram que as subpopulações de células estaminais-como pode ser enriquecido no uPAR

+ células [24]. Portanto, nós utilizamos uPAR classificação para enriquecer CSCs em linha de células SCLC H446.

Neste estudo, nós primeira comparou o estado metabólico dos CSCs com a de células de câncer não-tronco e descobriu que CSCs foram tumor metabolicamente inativas subpopulações que residiam em um estado que mostra baixa atividade metabólica. Em seguida, estudamos as principais vias de produção de energia de CSCs em SCLC. Ao contrário das células cancerosas não estaminais, CSCs mostrou utilização preferencial de OXPHOS sobre glicólise para atender a sua demanda de energia. Além disso, também descobrimos que CSCs poderia produzir ATP através da fosforilação em nível de substrato mitocondrial.

Materiais e Métodos

cultura celular

A linha de células SCLC NCI-H446 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC). Estas células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Biological Industries), suplementado com 10% de FBS (HyClone Thermo Scientific), 100U /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, em ar humidificado a 37 ° C com 5% de CO

2.

a citometria de fluxo análise

separação de células foi realizada em suspensão de células individuais de H446 células marcadas com o anticorpo primário contra uPAR (anticorpo monoclonal do rato, 1: 100, American Diagnostica, No. 3936). Em seguida, as células foram lavadas e incubadas com anticorpo secundário conjugado com FITC (Dako) durante 30 min. Todas as amostras foram medidas utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences) e analisados ​​com o software CellQuest (BD Biosciences). uPAR

+ células e uPAR

– células classificadas por FACS foram usados ​​em todas as nossas experiências (S1 FIG)

O consumo de oxigênio e taxa de acidificação extracelular

O Extracelular Flux Analyzer. permite a análise de taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR) de um número definido de células em tempo real e para monitorar a resposta ao tratamento da toxicodependência [15]. As células foram colocadas em placas a uma densidade de 1 x 10

5 células de cada poço de placas de 24 poços. No dia seguinte, as células foram lavadas e foi adicionado meio fresco. O cartucho foi carregado para dispensar três inibidores metabólicos pontos de tempo específicos sequencialmente como: oligomicina (inibidor da ATP sintase, 1 jiM), seguida por FCCP (protonophore um desacoplador e de OXPHOS mitocondrial, 0,3 uM), seguido pela adição de uma combinação de rotenona (complexo I mitocondrial Inhibitor, 1 uM) e antimicina (inibidor mitocondrial complexo III, 1 uM). Basal OCR e ECAR foram medidos, bem como alterações em ECAR causados ​​pelos inibidores metabólicos descritos acima. Vários parâmetros foram deduzidos mudanças no OCR, como basal OCR, capacidade máxima mitocondrial, e capacidade de reserva mitocondrial (= [capacidade máxima mitocondrial] – [basal OCR])., Como descrito anteriormente [15,25]

medições de captação e produção de lactato e de glucose no cálculo do bioenergética organização

Para a medição da absorção de glicose, células separadas foram plaqueadas a uma densidade de 1 x 10

6 /ml /poço em placas de 6 poços e incubadas em RPMI 1640 durante 2 h a 37 ° C sem glicose. Depois da adição de 2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) amino] -2-desoxi-D-glucose (2-NBDG) para uma concentração final de 100 uM, as células foram incubadas durante 1 h adicional, lavadas duas vezes com PBS, e analisadas por citometria de fluxo [26]. produção de L-lactato foi detectada utilizando um kit de ensaio de L-lactato (Eton Bioscience, San Diego, EUA) como previamente descrito [27] e de acordo com as instruções do fabricante e os níveis de L-lactato foram normalizados para o número de células. As organizações de bioenergéticos as células foram calculados como descrito no relatório de Hao et al, utilizou-se o seguinte: Lac (c) = concentração de lactato no meio de controlo após incubação 6H; Lac (O) = concentração de lactato no meio após 6 horas de incubação com 2 ug /ml oligomicina; A glicólise% = Lac (C) x 100 /lac (O); e OXPHOS% = 100 -. glicólise% [28]

ensaios de ATP

ATP celular concentração foi medida utilizando o kit de CellTiter-Glo Luminescent de viabilidade celular baseado no ATP (Promega, Madison, WI) modificado a partir do protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços a densidades diferentes. Três horas mais tarde, foi adicionado um volume igual de um reagente único de uma etapa fornecido pelo kit a cada poço e agitados durante 10 min à temperatura ambiente. teor de ATP celular foi medida utilizando um leitor de placas luminescente. Para testar o efeito de empobrecimento de ATP dos inibidores metabólicos, várias concentrações do composto foram adicionados às células semeadas a 1 x 10

4 células /cavidade durante mais 3 h, e o conteúdo celular de ATP foi medida como descrito acima.

ensaio MTT

As células foram semeadas numa placa de 96 poços a 3000 células por poço em 100 ul de meio de cultura celular e incubados a 37 ° C durante 24 horas e depois tratou-se com compostos indicados em várias concentrações. Após incubação de 72h, as células foram incubadas com 10 uL de MTT (a uma concentração final de 0,5 mg /ml) a 37 ° C durante 4 horas [29]. O meio foi removido e o precipitado de formazano foi dissolvido em 100 ul de DMSO. Após agitação durante 10 min, a absorvância a 490 nm foi detectada usando TECAN GENios Pro (BioTek Instruments).

Tumor esfera de formação de ensaio

Para obter esferas na cultura, uPAR

+ células foram tratados com os compostos indicados durante 3 h. Em seguida, 1 × 10

3 células foram semeadas em meio isento de soro (SFM) (DMEM /F12) suplementado com 20 ng /ml de factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) e factor de crescimento epidérmico (EGF) (PeproTech), 5 ug /ml de insulina (Sigma-Aldrich), 0,4% de albumina de soro bovino (BSA, Invitrogen), e 0,02 x B27 (Invitrogen). O meio de cultura foi substituído ou suplementado com factores de crescimento adicionais, duas vezes por semana. O número total de esferas de tumor foi contado após 14 dias de cultura.

ensaio de tumorigenicidade em ratinhos nus

As experiências com animais foram realizados em ratinhos nus BALB /CA quatro semanas de idade adquiridos de Pequim HFK Bio- Tecnologia. Co, LTD (Pequim, China). Os protocolos foram realizados após a aprovação da Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Medicina de Tianjin (número de autorização: TMHaMEC2014030). O uPAR classificados

+ células foram tratadas com 2 ug /ml oligomicina durante 24 h, lavadas e colhidas por inoculação subcutânea no flanco esquerdo de ratinhos nus BALB /cA. Os mesmos números de células de controlo foram inoculados nos flancos direitos dos mesmos murganhos por via subcutânea. Cada local de inoculação foi injectado com 5 × 10

5 células. Os murganhos foram então monitorizados durante a formação do tumor, sem tratamento adicional da droga in vivo. Os ratinhos foram observados 2-3 vezes por semana por pessoal de laboratório e monitorizados para sinais de perturbação (isto é, alterações na aparência, respiração, actividade, etc.). Os tumores foram medidos, uma vez por semana. Todos os animais de ambos os grupos foram ainda em boas condições até ao fim da experiência. Nenhum dos animais necessária a eutanásia antes da extremidade experimental. Após seis semanas, os animais foram anestesiados com pentobarbital de sódio experimentais (45 mg /kg, injecção intraperitoneal) e mortos por deslocamento cervical. O volume do tumor = 0,5 × comprimento x largura

2

A microscopia eletrônica

uPAR

+ células e uPAR

-. células foram classificadas por FACS como descrito acima. A análise ultra-estrutural de células classificadas foi realizada como descrito no relatório de Varum et al [30].

A análise estatística

Os dados foram analisados ​​usando SPSS for Windows versão 17.0 (SPSS Inc, Chicago , IL, EUA). Cada experiência foi realizada em pelo menos três ensaios independentes. Todos os resultados são expressos como média ± S.E.M. e comparações estatísticas dos conjuntos de dados foram analisados ​​utilizando o teste t de Student não pareado ou o teste ANOVA. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Extracelular fluxo análise revelou as diferenças metabólicas de CSCs e células cancerosas não estaminais

Para obter insights para o perfil metabólico de. CSCs e para compará-lo com as células cancerosas não estaminais, nós primeira realizada análise de fluxo metabólico extracelular [16]. O OCR e ECAR foram medidos. Como mostrado na Fig 1A, CSCs enriquecido uPAR

+ células mostraram um OCR basal inferior, indicativa de baixa respiração mitocondrial, em comparação com a sua uPAR

– homólogos. Quando ECAR basal de uPAR

+ células e uPAR

– as células foram comparados, o uPAR

+ células também foi menos ativo em relação a glicólise fermentativo. Para estudar as propriedades metabólicas de duas subpopulações em pormenor, utilizou-se uma estratégia de perfil farmacológico, por combinação da aplicação de três inibidores metabólicos (oligomicina, FCCP, uma combinação de rotenona e antimicina) [30]. Tratamento por oligomicina resultou numa diminuição na OCR de duas subpopulações de células. No entanto, uPAR

+ células exibiram uma diminuição menos pronunciada no OCR comparação com uPAR

– células (Fig 1B). Desacoplamento de OXPHOS usando FCCP aumento OCR para máximo em ambos os subpopulações de células, com uma resposta menos pronunciado ser observada em uPAR

+ células (Fig 1B e 1C). A diferença entre FCCP OCR e basal OCR é um bom indicador da capacidade respiratória (também referida como a capacidade de reserva mitocondrial) destas células [30]. Embora o OCR basal de uPAR

+ células foi menor, a capacidade de reserva mitocondrial de uPAR

+ células foi comparável à de uPAR

– células (Fig 1C). Mesmo se o ECAR basal é baixa em uPAR

+ células, é possível que uPAR

+ células pode regular positivamente a glicólise quando OXPHOS mitocondrial é bloqueada [16]. Para estudar a possibilidade, medimos a ECAR destas células tratadas com inibidores OXPHOS, que é um parâmetro de potencial compensative da glicólise [16]. Curiosamente, uPAR

+ células mostraram um diminuição significativa potencial compensative da glicólise, quando a produção de energia mitocondrial foi inibida (Fig 1D e 1E). Além disso, os nossos resultados mostraram que uPAR

+ células diminuiu os níveis de ATP em comparação com uPAR

-cells (Figura 1F). Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que CSCs enriquecido uPAR

+ células são populações de células metabolicamente inativas em SCLC

(A) Basal OCR e eCar para uPAR

+ e uPAR

-. Subconjuntos . (B) O OCR após tratamento com inibidores indicados no uPAR

+ células contra uPAR

– células. (C) a capacidade respiratória mitocondrial máximos e capacidades de reserva mitocondriais em duas subpopulações. (D) A ECAR após tratamento com inibidores indicados no uPAR

+ células contra uPAR

– células. (E) O potencial compensative da glicólise de uPAR

+ células e uPAR

– células. conteúdo (F) ATP em uPAR

+ células e uPAR

– células. Os dados são expressos como média ± S.E.M. de três experiências independentes. teste t de Student foi utilizado para calcular a significância estatística. * P 0,05

CSCs apresentaram menor captação de glicose e produção de lactato no SCLC

Para investigar mais as diferenças metabólicas de uPAR

+ células e uPAR

– células. , foi avaliada a captação de glicose de duas subpopulações. uPAR

+ células apresentaram menor absorção de glicose do que uPAR

– células (Fig 2A). Nossas medições eCar mostraram diferenças na geração de lactato entre uPAR

+ células e uPAR

– células (Fig 1A e 1D). Consistente com estes resultados, uPAR

+ células exibiram significativa diminuição dos níveis de produção de lactato em comparação com o uPAR

– células (Fig 2B). Este novo indicaram que CSCs foram menos glycolytic do que suas células cancerosas não estaminais. Glutaminolysis é geralmente ativo em células tumorais, portanto medimos a produção de lactato 2-deoxiglicose-sensível na uPAR

+ células e uPAR

– células. Como mostrado na Fig S2, 2-DG causou uma redução substancial de produção de lactato. Estes resultados sugerem glutaminolysis não foi tão ativo na linha de células de câncer de pulmão de pequenas células H446 como em outras células tumorais

(A) glicose captação por uPAR

+ células e uPAR

-. Células utilizando 2- NBDG. À esquerda, a representação histograma da intensidade de 2 NBDG. Direita, quantificação da absorção de 2-NBDG como diferença na intensidade de fluorescência média (IFM) entre as amostras e controlos. (B) as taxas de produção de lactato de uPAR

+ células e uPAR

– células. Os dados são expressos como média ± S.E.M. de três experiências independentes. teste t de Student foi utilizado para calcular a significância estatística. * P . 0,05

número mitocondrial e morfologia das CSCs era diferente daquela das células cancerosas não estaminais

Diminuição respiração mitocondrial em uPAR

+ células poderiam ser atribuídas a menor número de mitocôndrias ou imaturidade da mitocôndria nessas células em comparação com uPAR

– células. Para investigar esta questão, foi realizada microscopia eletrônica de transmissão [30] para uPAR

+ células e uPAR

– células. Como mostrado na Figura 3, a maioria das mitocôndrias nas uPAR

– as células foram arredondadas ou ovais, exibindo cristas escassa e irregular e uma matriz de elétrons-Lucent. No entanto, uPAR

+ células preferencialmente possuía mitocôndrias ativados, incluindo agrupamento de mitocôndrias, cristas engrossado, e morfologia “roda de carroça” [17,31]. Esta avaliação morfológica sugere que a mitocôndria de uPAR

+ células são mais maduros na aparência do que uPAR

– células. Estes resultados estão em forte contraste com a actividade respiratório inferior de uPAR

+ células em relação ao uPAR

-. Células

A análise ultra-estrutural do uPAR

células classificadas + e uPAR

– Células usando microscopia eletrônica de transmissão. Imagens representativas são mostrados com uma ampliação de × 10000 em painéis superiores e × 30000 em painéis inferiores. Setas no painel inferior indicam exemplos de mitocôndrias. Barras de escala: 5 (painéis superiores) mm e 1 mm (painéis inferiores)

A dependência de OXPHOS e fosforilação em nível de substrato mitocondrial variado em CSCs e células cancerosas não-tronco em SCLC

para explorar a importância relativa de OXPHOS e glicólise em CSCs, decidimos tratar ambos os subgrupos com diferentes inibidores metabólicos e reanalisar os níveis de ATP após o tratamento [15]. 2-DG era um inibidor competitivo da glicólise, e oligomicina foi usada para inibir a produção de ATP por meio da ATP sintase mitocondrial. Como mostrado na Fig 4A, os níveis de ATP de uPAR

+ células em H446 diminuiu em 43,2% e 64,1% do valor de controlo, quando tratada com 2-DG e oligomicina, respectivamente. Em uPAR

– células, 2-DG causou uma queda de ATP 81,9%, enquanto que a queda de ATP induzida pela oligomicina foi de 54,7% (Figura 4B). Quando o efeito de oligomicina e 2-DG sobre os níveis de ATP foi comparada em duas subpopulações, oligomicina teve efeito mais potente sobre a uPAR

+ células. Em contrapartida, 2-DG afetados uPAR

– células de forma mais intensa do que uPAR

+ células (S3 Fig). Os dados indicaram que o uPAR

+ células foram mais sensíveis à inibição OXPHOS comparação com uPAR

– células. Para explorar ainda mais a via geradora de energia primária em CSCs, foram calculadas as organizações bioenergéticos da glicólise e OXPHOS [28] em uPAR

+ células e uPAR

– células. As organizações bioenergéticos são heterogêneos e prever dependência bioenergética diferencial da glicólise e OXPHOS para ambas as subpopulações (S4 FIG). Estes resultados sugerem que CSCs pode depender mais da OXPHOS em vez de glicólise para atender às demandas de energia. Além disso, observou-se as duas subpopulações de células ainda poderia produzir ATP, embora tratados com a combinação de 2-DG e oligomicina. Isto implicava que estas células podem recorrer a outras vias de geração de energia, como a fosforilação em nível de substrato mitocondrial durante a depressão respiratória.

(A, B) de conteúdo ATP de uPAR

+ células e uPAR

– células tratadas com 2-DG, oligomicina (OLI) ou uma combinação de 2-DG e OLI. (C) O efeito da combinação de 2-DG e OLI para diversos tempo sobre os níveis intracelulares de ATP em uPAR

+ células e uPAR

– células. (D) O uPAR

+ células, e não o uPAR

– células poderiam produzir mais ATP através da fosforilação em nível de substrato mitocondrial em condições de hipóxia do que as condições de normóxia (E) A adição de substratos (SUB) poderia remediar a depleção de ATP causado por 2-DG e OLI em uPAR

+ células, mas não em uPAR

– células. Os dados são expressos como média ± S.E.M. de três experiências independentes. teste t de Student foi utilizado para calcular a significância estatística. * P 0,05. SUB, substratos (α-cetoglutarato e aspartato). ns, nenhum significado.

Os relatórios têm sugerido que “forçar” a fosforilação em nível de substrato para trabalhar horas extras pode ser uma estratégia viável para sobreviver na crise de energia induzida pela insuficiência OXPHOS em leveduras [32,33] . Para otimizar essa estratégia para SCLC, que inibiu a glicólise e OXPHOS e as células, assim, forçados a produzir ATP através da fosforilação em nível de substrato mitocondrial. Para este fim, primeiro estabelecidos para determinar uma dose baixa de oligomicina e 2-DG que OXPHOS completamente inibida e atividade glicólise, respectivamente. Após o tratamento de uPAR

– células com diferentes doses de 2-DG que variam de 5 a 80 mM durante 3 h, os níveis de ATP destas células foram medidos. O ATP não foi ainda mais reduzida, elevando-2 DG de 20 a 40 e 80 mM, o que indica que 20 mM de 2-DG suprimiu completamente a produção de ATP em uPAR

– células (S5A FIG). Da mesma forma, sugerimos que 2 ug /ml oligomicina podia inibir completamente OXPHOS em uPAR

+ (células S5B FIG). Observamos que uPAR

+ células produzidas mais conteúdo ATP através da fosforilação em nível de substrato do que uPAR

– células (Fig 4C). Além disso, o uPAR

+ células produziram mais ATP através da fosforilação em nível de substrato sob condições de hipóxia do que em condições de normóxia (Fig 4D). Além disso, ensaios de ATP mostrou que a suplementação /aspartato α-cetoglutarato para o meio de cultura, podem corrigir a depleção de ATP provocada pela oligomicina e 2-DG, em uPAR

+ células. No entanto, este fenômeno não foi observado em uPAR

– células (Fig 4E). Estas observações indicaram ainda que a fosforilação em nível de substrato mitocondrial em uPAR

+ células podem ser mais ativo do que no uPAR

-. Células

oligomicina prejudicado a capacidade de formação de esfera de CSCs

As nossas observações fornecem evidências de que CSCs enriquecido uPAR

+ pode dependem fortemente OXPHOS como principal via de geração de energia. Em seguida, testou-se se oligomicina poderia levar a morte eficaz de CSCs em CPPC, com base no racional de que oligomicina iria esgotar o conteúdo celular de ATP pela inibição substancialmente OXPHOS. Desde clonogenicidade in vitro é considerado como um indicador da capacidade de iniciação do tumor de células de cancro in vivo, [5], testou-se o efeito de oligomicina e 2-DG-se na capacidade de H446 em CSCs para formar esferas. 2-DG não poderia revogar clonogenicidade de CSCs, mas oligomicina diminuiu o número eo tamanho das esferas em cultura (Fig 5A-5C). A adição de 2-DG para o meio de cultura mostraram que a inibição da glicólise anaeróbia severamente afectado o crescimento de uPAR

– células, mas não uPAR

+ células. Em contraste, oligomicina diminuiu significativamente a proliferação de ambos os subtipos de células (Figura 5D).

(a) Morfologia representativas de esferas manter em meio isento de soro foram estabelecidas a partir de uPAR

+ células tratadas com oligomicina e 2- DG. (B) Valor das esferas de primeira geração gerados a partir de uPAR

+ células tratadas com 2-DG e oligomicina. potencial clonogênica de uPAR

+ células foi reduzido em oligomicina tratamento. Em contraste, 2-DG não afeta significativamente o potencial clonogênica de CSCs. (C) Número de células por esfera gerados a partir de uPAR

+ células tratadas com 2-DG e oligomicina no dia de 14. (D) oligomicina inibe a proliferação de ambas as uPAR

+ células e uPAR

– células, no entanto 2-DG afeta apenas uPAR

– células, mas não uPAR

+ células. Os dados são expressos como média ± S.E.M. de três experiências independentes. teste t de Student foi utilizado para calcular a significância estatística. * P . 0,05

oligomicina suprimida a capacidade de iniciação tumor de CSCs in vivo

Para testar o efeito de oligomicina para matar as células iniciadoras de tumores nas subpopulações CSCs, uPAR

+ foram tratados segundo o procedimento mostrado na Figura 6A. Em seguida, dois grupos de células foram inoculadas ratinhos nus BALB /CA por via subcutânea, que foram divididos em dois grupos. Os ratos foram depois observados durante a formação do tumor e o crescimento do tumor, sem mais tratamento com drogas [12]. Seis semanas mais tarde, o grupo tratado por grupo formado tumores oligomicina e de controlo (Fig 6B e 6C). O grupo tratado por oligomicina teve um volume significativamente reduzido tumor e peso (125,8 ± 13,67 milímetros

3, 0,2 ± 0,1 g), em comparação com o grupo controle (451,5 ± 16,23 milímetros

3, 0,42 ± 0,15 g) (Fig 6D e 6E). Estas observações sugerem CSCs manter suas propriedades estaminais-como por OXPHOS em linha de células SCLC H446.

(A) Esquema Experimental. (B) fotografia representativa de tumores formados por células tratadas com as células de controlo ou oligomicina. (C) fotografia Representante de camundongos machos nus BALB /cA com tumor em 42 dias. (D) O peso do tumor do volume de tumores de xenoenxerto do grupo tratado pelo grupo de controlo e oligomicina. (E) Curva de crescimento de tumores de xenoenxerto de volume do grupo tratado por oligomicina e grupo de controlo. Os dados são expressos como média ± S.E.M. de seis ratos. teste t de Student foi utilizado para calcular a significância estatística. * P . 0,05

Para a aplicação clínica, é melhor tomar as células não cancerosas em consideração. No nosso estudo, a concentração de oligomicina é 2UG /ml, o que é muito menos do que a dose letal [34], e todos os ratinhos no grupo experimental ainda estão em boas condições até ao fim da experiência. Por isso, pensamos que o efeito colateral de oligomicina é apenas um pouco em nosso estudo. Além disso, outro grupo demonstrou que a terapia anti-alvo mitocondrial usando oligomicina é eficaz para prender MCF-7 crescimento de esferóides sem efeito aparente em tecido normal da mama epitelial em doses similares [35]. Mas, em vista de tempo e nossa intenção original, que tendem a ilustrar os fenótipos metabólicos distintos de a maior parte das células e CSCs cancerosas. Portanto, nós consideramos CSCs e câncer não-haste como objetos de investigação neste papel.

Discussão

Até agora, a grande maioria dos estudos nesta área têm-se centrado sobre as células tumorais a granel, que mostram aumento da glicólise mesmo na presença de oxigênio em uma variedade de tumores [17]. No entanto, há evidências crescentes de que indica que o estado metabólico de CSCs difere a partir de células de cancro não estaminais [36-38]. Pouco se sabe sobre as propriedades metabólicas de CSCs em SCLC até agora. Aqui, mostramos que CSCs residia em um estado que mostra baixa atividade metabólica em SCLC. Nossos resultados implicou que

+ células CSCs enriquecido uPAR foram subpopulações latentes em SCLC. A dormência celular poderia trazer vantagens para as células tumorais. Por um lado, a maioria das terapias actuais tem como alvo as células de tumor em proliferação. Assim, os CSCs dormentes podem sobreviver terapias direcionadas e será responsável pela recorrência do tumor. Por outro lado, este estado relativamente adormecido provável faz CSCs persistem, mesmo sob condições altamente estressantes, como os níveis de nutrientes ou oxigénio baixas [16]. A atual pesquisa fornece chances de compreender as complexidades de dormência tumor, mas o mecanismo deste processo necessita de uma investigação mais aprofundada.

miRNAs desempenham papéis reguladores essenciais em vários processos biológicos, tais como o metabolismo [27]. Trabalhos anteriores de nosso laboratório comparou os perfis de expressão de miRNA de CSCs e células cancerosas não-tronco de H446 utilizando matriz miRNA incluindo 1212 miRNAs maduros. Na matriz, verificou-se que 86 miARNs foram diferencialmente expressos entre CCC e células cancerígenas não estaminais (P 0,01), incluindo 48 e 38 miARNs upregulated miARNs regulados negativamente em CSCs. Entre 86 miRNAs diferencialmente expressos, 18 dos 48 miRNAs regulada e 20 dos 38 miRNAs subregulado mostrou mudanças, pelo menos, um de 4 vezes nos CSCs em relação às células cancerosas não estaminais [29]. Portanto, o nosso próximo trabalho é explorar o efeito de miRNAs no estado metabólico de CSCs em SCLC.

Neste estudo, mostramos que CSCs mostrou utilização preferencial de OXPHOS sobre glicólise para atender a sua demanda de energia. Para o melhor de nosso conhecimento, CSCs residir em ambientes hipóxicos [39]. Por que os CSCs ainda altamente dependente OXPHOS em microambiente hipóxico? Achamos que as razões são as seguintes. Em primeiro lugar, a concentração de oxigénio em um ambiente hipóxico tem sido sugerido como estando dentro do âmbito da 8-57μM [4,40-42], que é mais elevada do que a concentração limitante para o O

2 constante de dissociação do citocromo c oxidase [43 ]. Portanto, CSCs poderia ainda dependem fortemente de OXPHOS mesmo sob condições de hipóxia. Em segundo lugar, existe uma simbiose metabólica entre duas sub-populações de células cancerosas com dependências distintas em vias de produção de energia [44,45]. lactato subproduto do cancro glicolítica pode ser usado como um metabólito importante para OXPHOS por subconjuntos de cancro que são dependentes do metabolismo mitocondrial. A simbiose metabólica permite que as células cancerosas para fazer pleno uso dos recursos disponíveis [45]. Em terceiro lugar, o trabalho Otto Warburg ‘mostrou que as células altamente proliferativas, muitas vezes, preferencialmente, realizar a glicólise através OXPHOS [17]. Através da glicólise, alguma glucose podem ser desviados para a acetil-CoA-redutase e o NADPH necessário para a síntese macromolecular [46].