Abstract

O cancro do pulmão ou carcinoma pulmonar é derivada principalmente de células epiteliais que são finos e linha na superfícies alveolares do pulmão para a troca gasosa. ANO1 /TMEM16A, inicialmente identificado a partir de células epiteliais das vias aéreas, é membro de Ca

2 + -activated Cl

– canais (CaCCs) que funcionam para regular a secreção epitelial e do volume da célula para manutenção de íons e homeostase do tecido. ANO1 /TMEM16A foi recentemente mostrado ser altamente expresso em vários carcinomas do epitélio originado. No entanto, o papel de ANO1 no cancro do pulmão permanece desconhecida. Neste estudo, que mostram que a inibição do canal de cloreto activado por cálcio ANO1 /TMEM16A suprime o crescimento tumoral e a invasão do cancro do pulmão humano. ANO1 é regulada positivamente em diferentes linhas celulares de cancro do pulmão humano. Bater-down ANO1 por pequenos RNAs hairpin inibiu a proliferação, migração e invasão de GLC82 e NCI-H520 células avaliadas por CCK-8, faria-cura, transpoço e ensaios de agar mole 3D cancelar. ANO1 proteína é sobre-expresso em 77,3% dos casos de adenocarcinoma do pulmão tecidos humanos detectados por imuno-histoquímica. Além disso, o crescimento do tumor em ratinhos nus com células implantadas GLC82 foi significativamente suprimida por ANO1 silenciamento. Tomados em conjunto, os nossos resultados fornecem evidências de que ANO1 superexpressão contribui para o crescimento do tumor e invasão de câncer de pulmão; e suprimindo ANO1 superexpressão podem ter potencial terapêutico no tratamento do câncer de pulmão

Citation:. Jia L, Liu W, Guan L, Lu M, Wang K (2015) Inibição da Activated-cloreto de cálcio Canal ANO1 /TMEM16A Suprime Tumor crescimento e invasão no câncer de pulmão humano. PLoS ONE 10 (8): e0136584. doi: 10.1371 /journal.pone.0136584

editor: Shang-Zhong Xu, da Universidade de Hull, Reino Unido

Recebido: 28 Abril 2015; Aceito: 05 de agosto de 2015; Publicação: 25 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Jia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação para KWW do Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2013CB531302 e 2014ZX09507003-006-004) ea National Science Foundation da China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro do pulmão ou carcinoma pulmonar que deriva de células epiteliais é geralmente classificados em câncer de pulmão de pequenas células (CPPC) e câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Como o tipo mais comum de câncer de pulmão, NSCLC é responsável por 84% dos casos estimados com dois subtipos principais: adenocarcinoma eo carcinoma espinocelular [1]. Actualmente, a patogênese e desenvolvimento de câncer de pulmão não foi claramente definida. Evidências crescentes indicam que os canais iónicos desempenhar um papel significativo na proliferação de células cancerosas e a invasão, e na condução de progressão do cancro em todos os estágios diferentes [2, 3].

canais de iões são poros cheios de água e proteínas transmembranares presentes em todas as células vivas, participando em diversas actividades fisiológicas integrais para a excitabilidade, a contração, secreção, ciclo celular e cascatas metastáticos [4, 5]. a expressão normal dos canais de iões é crucial para manter Ca

2 + e homeostase do tecido durante a proliferação celular e a diferenciação através rege fluxos iónicos celulares, que regula o volume de células, e geração de potencial de membrana [6, 7]. canais de cloreto são importantes para muitos processos biológicos incluindo o transporte transepitelial de fluxos de iões, regulação do volume celular, a diferenciação e a apoptose [8, 9]. volume celular estável e constante e homeostase iónica durante a proliferação e a diferenciação celulares são estritamente necessárias para a função celular e sobrevivência [10, 11]. Cloreto de fluxo através de canais de cloreto em resposta à célula inchaço é um dos mecanismos pelo qual as células críticas restabelecer o seu volume a seguir perturbações osmóticos e estresse causado pelas actividades metabólicas intensivos resultou da água, não-eletrólito e de permuta de iões nas superfícies epiteliais [12-14]. Desregulação da expressão do canal de íon torna-se epigenetically anormal em células cancerosas metastáticas [15-17]. Por exemplo, a regulação positiva de cloreto de canal intracelular 1 (CLlC1) está envolvida na migração de células de câncer de cólon e invasão através mediar diminuição do volume regulamentar mecanismo (RVD) [18]; e a sobre-expressão de cloreto channel3 (ClC3) contribui para múltiplos carcinomas humanos, tais como glioma, pulmão, da mama, do colo do útero e tumores [19]. Também tem sido relatado que o aumento do cálcio intracelular durante a ocorrência desafio hipotónica é relativa a RVD e envolvido com cancro apoptose, indicando a interacção entre a homeostase do cálcio e do volume homeostase [20, 21].

Ca

2 + -activated Cl

– canais (CaCCs) são importantes reguladores da secreção epitelial e regulação do volume celular [22, 23]. TMEM16A, também conhecido como DOG1, ORAOV2 ou TAOS-2, foi identificada a partir de células epiteliais das vias aéreas como um CACC bona fide que medeia endógena Ca

2 + cloreto de corrente -activated [24-26]. TMEM16A também tem sido referido como anoctamin 1 (ANO1) por causa de sua seletividade ânion e segmentos oito (OCT) transmembrana [25]. O

gene ANO1 /TMEM16A

é localizada em 11q13, uma das regiões mais frequentemente amplificados em cancros humanos [27, 28] e associada a um mau prognóstico [29]. Foi recentemente demonstrado que ANO1 /TMEM16A é amplificado ou sobre-expressos em vários cancros humanos tais como tumores estromais gastrointestinais (GIST), cancro da próstata, cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP), cancro da mama e células de cancro colorrectal [27, 30- 33]. ANO1 superexpressão também está correlacionada com mau prognóstico dos pacientes com CECP e câncer de mama [30, 34], e inibição farmacológica da atividade CACC ANO1 por CaCCinh-A01 e T16Ainh-A01 pode inibir a proliferação de células cancerígenas [32, 35, 36]. Embora a razão para a alta expressão de ANO1 em tumores não é claro, vários estudos têm mostrado que ANO1 está envolvido na sinalização oncogénica através da activação do EGFR e CaMK vias para promover a progressão do ciclo celular e cancro [30, 37]. Tem sido relatado que as proteínas ANO1 interactuantes, tais como proteínas reguladoras se ligam à actina de sinalização /andaimes ezrina, radixina, moesina e RhoA podem participar na regulação da função ANO1 [38, 39]. Mais recentemente, ANO1 e EGFR se encontram para formar um complexo funcional que regula a proliferação de células de carcinoma epidermóide [40]. No entanto, se ANO1 /TMEM16A desempenha um papel na génese do tumor de câncer de pulmão permanece desconhecida.

Neste estudo, descobrimos que CACC ANO1 é altamente regulada em tecidos de câncer de pulmão humanos. ANO1 regulação positiva foi confirmada em diferentes linhas celulares de cancro do pulmão humano. Knockdown de expressão ANO1 por RNA hairpin curto inibida celular proliferação, migração e invasão em células de câncer de pulmão GLC82 e NCI-H520. A inibição do crescimento do tumor também ANO1 suprimida em ratinhos nus implantados com células estável transfectada GLC82. Nossos resultados fornecem evidências de que a proteína ANO1 membrana pode servir como um potencial biomarcador e alvo para diagnóstico e terapia de câncer de pulmão.

Métodos

cultura celular

2BS linha de células de pulmão normal , linhas celulares de cancro do pulmão A549 e H1299 foram presentes de Dr. Hongti Jia do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade de Pequim Saúde Science Center. As células A549 e H1299 foram originalmente obtidas a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). células 2BS foram originalmente obtidas do Instituto Nacional de Produtos Biológicos (Pequim, China). linhas celulares de cancro do pulmão GLC82 e Calu-3 para adenocarcinoma e NCI-H520 para carcinoma de células escamosas foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC). As células 2bs foram cultivadas em DMEM (Invitrogen, Carlsbad, EUA), e as outras linhas celulares foram propagadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen). O meio foi suplementado com 10% de soro fetal de vitela e 1% de penicilina-estreptomicina. Todas as células foram mantidas em meio a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2.

transfecções shRNA e criação de linhas celulares estáveis ​​

e ANO1 shRNAs scrambled plasmídeos foram shRNA construído por GeneChem Co., Ltd. (Xangai, China). O shRNA foram clonados nos locais BamHI e HindIII do pGCsi-U6 /Neo /GFP vecor, e utilizou-se a sequência de laço na TTCAAGAGA. A sequência alvo de três ANO1 shRNA foram como se segue: shRNA1, CGTGTACAAAGGCCAAGTA; shRNA2, GCATCTATTTGACTTGTCT; shRNA3, CGAAGAAGATGTACCACAT. A sequência mexidos foi CGAGTGGTCTAGTTGAGAA. Para a transfecção, 8 ug de ADN foi utilizado por placa de 60 mm, com Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante, e meio de transfecção foi substituído por meio de cultura de 4 horas após a transfecção. Todas as experiências subsequentes foram realizados a 48-72 h após a transfecção e repetida em triplicado. Para gerar linha de células GLC82 estável expressando ANO1 shRNA, as células transfectadas foram selecionados menos de 800 ug /ml de G418.

imuno coloração

amostras de tecido de cancro humano cirurgicamente ressecados que consistem em 44 casos de adenocarcinoma de pulmão e 40 casos de carcinoma do pulmão de células escamosas foram obtidos retrospectivamente a partir de Peking University Third Hospital. As amostras de tecido foram totalmente de-identificados antes que o acesso por nós e todos os pacientes foram informados e consentiram para a utilização dos seus tecidos excisada para futuras pesquisas. As secções de tecido foram incubadas numa câmara seca a 60 ° C durante uma hora antes em xileno parafinado-de três vezes e hidratado através de uma série graduada de etanol. Tratado em peróxido de hidrogénio a 3% durante 10 minutos, os tecidos foram então fervidos em 10 mM de solução de recuperação de antigénio de citrato (pH 6,0) durante 20 minutos, utilizando um forno de microondas. Imuno-histoquímica (IHC) coloração foi realizada por incubação dos tecidos com o anticorpo primário a ANO1 (1: 100; ab53212, Abcam) a 4 ° C durante a noite. Após a incubação os tecidos com anticorpo de cabra anti-IgG de coelho-HRP durante 30 minutos a 37 ° C, o sistema de cromogénio DAB foi usado para visualização. Os resultados foram também calculados multiplicando a intensidade (número inteiro entre 0 e 3).

análise Western blot

células foram lavadas três vezes em solução tampão de fosfato arrefecido em gelo e lisadas em tampão RIPA com 1 X fosfatase Halt e protease cocktails inibidores (Pierce, Rockford, IL). As amostras foram quantificados utilizando um kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific, EUA). Quantidades iguais de proteína (50 ug) foram separados utilizando PAGE (8%) e transferidos para membranas de nitrocelulose. Depois bloqueou-se com soro fisiológico tamponado com Tris (TBS) contendo leite a 5%, a membrana de blot foi incubado durante a noite a 4 ° C com anticorpo de coelho anti-ANO1 (1: 1000; Abcam) e de coelho anti-actina -β (1: 500; de Santa Cruz, CA). A membrana foi incubada com um anticorpo anti-IgG de coelho-HRP secundário (1: 5000, Santa Cruz) durante uma hora à temperatura ambiente e visualizado usando o substrato de HRP Immobilon Ocidental

proliferação celular CCK8

ensaio.

a proliferação celular foi medida com a contagem celular Kit-8 (Dojindo Laboratories, Japão). 500 células por poço, foram inoculados em placas de 96 poços. 10 ul da solução de kit de contagem celular foram adicionadas a cada poço a 24, 48, 72 e 96 horas depois de semeada. Em seguida, as placas de 96 poços foram incubadas durante 2 horas a 37 ° C antes de a densidade óptica (OD) foi medida a 450 nm por um leitor de microplacas.

Colónia ensaio de formação em cultura

Para a formação de colónias em cultura, as células transfectadas (tratados com 800 ug /ml de G418 durante 2 dias, após 48 horas de transfecção) foram plaqueadas a 200 células por poço em placas de 6 poços e incubadas em meio RPMI-1640 contendo soro bovino fetal a 10% para 12-15 dias. As colónias remanescentes foram coradas com 0,1% de violeta de cristal e contadas, e as imagens foram tiradas após a coloração.

suave formação de colónias em ágar de ensaio

ensaio de formação de colónias em agar mole foi realizado num 6- bem placa. A camada de base foi preparada por mistura de 1,2% de agarose (Invitrogen) e o volume equivalente a 2 × meio com FBS a 20%. Em seguida, as células de cada grupo foram colhidas e suspensas em meio contendo 0,4% de agarose e plaqueadas sobre a camada de base em triplicado a uma densidade de 3000 células por poço. Após 30 dias, os clones foram observados aparentemente e as células foram congelado durante quatro horas, e, em seguida, coradas por 0,02% de violeta de cristal. As imagens foram tiradas após a coloração.

-cicatrização de feridas ensaio

Para medir a actividade de migração, as células foram inoculadas em placas de seis poços, cultivadas a 90% de confluência em meio RPMI-1640 contendo 10% soro fetal bovino. Em seguida, as células foram privadas de mudar o meio para meio isento de soro e meio RPMI-1640 cultivou-se durante 24 h. As células foram raspadas com 100 ul pontas de pipeta de plástico e lavou-se com solução tampão de fosfato. As imagens foram coletadas a cada 24 horas por um microscópio de contraste de fase invertida (Olympus; ampliação: 10 ×). A relação entre a área da ferida remanescente foi calculada em relação à área da ferida inicial e normalizados para o grupo de grupo ou DMSO shRNA mexidos.

Transwell ensaio

atividade celular invasão foi avaliada em tamanho de poro 8,0 Transwell câmaras de placas 24 de inserção (Corning, Acton, MA, EUA) revestidas com BioCoatMatrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA). Depois de pré-fome de 24 horas por cultura em meio sem soro, 3X10

4 (NCI-H520) ou 5X10

4 células (GLC82) por poço foram colocadas nas câmaras superiores com meio sem soro e incubadas por 48 (NCI-H520) ou 72 horas (GLC82). As câmaras inferiores foram cheias com meio de soro fetal de bovino a 10%. Depois de limpar as células fora a partir do lado de cima da câmara superior, o lado inferior da câmara superior foi fixada com metanol e coradas com 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; Sigma). As imagens foram fotografadas ao microscópio. A área de coloração DAPI na câmara inferior foi normalizado para grupo shRNA mexidos ou grupo DMSO, indicando a sua capacidade de invasão relativa.

In vivo

xenotransplante crescimento do tumor

comprado do departamento do Laboratório de Ciência animal da Universidade de Pequim Centro de Ciências da Saúde, balb /c nu camundongos 5 semanas de idade do sexo feminino /nu foram colocados em quarentena por uma semana antes da sua utilização no estudo. Os animais (8 animais por jaula) foram alojados em microisolat com acesso livre a ração padrão para roedores e água sob condições de temperatura controlada (23 ± 2 ° C) a 70% de humidade [33]. Os animais foram mantidos em um reverso 12 h /12 h ciclo de luz /escuridão (luzes acesas às 07:00). Os protocolos experimentais com animais foram aprovados pelo uso e cuidados Comitê da Universidade de Pequim o animal e foram consistentes com as Diretrizes Éticas. células estáveis ​​GLC82 (1 x 10

7 células por rato) foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). As células foram transfectadas por GLC82 shRNA mexidos, ANO1 shRNA1 e ANO1 shRNA2, respectivamente, e seleccionados por G418 durante duas semanas antes da utilização. GLC82 células foram inoculadas em hipodermicamente os membros anteriores direito dos ratinhos nus, e em cada grupo foram utilizados oito animais. No sétimo dia após a injecção, os tamanhos dos tumores foram medidos cada 2-4 dias durante um período de 2 semanas e calculada pela (L x W

2) /2 (L e W representados o diâmetro longitudinal e transversal mais longo, respectivamente ). O ponto final das experiências foi no dia 19 após a injecção das células GLC82 para se certificar de que a massa tumoral não interferir significativamente com as funções normais do corpo de ratos ou dor causa. Os ratinhos foram sacrificados por injecção intraperitoneal de pentobarbital (120 mg /kg) combinado com 0,25% de lidocaína antes que os tumores foram removidos. imagens representativas foram obtidas antes tumores foram pesados ​​com uma balança eletrônica.

A análise estatística

O GraphPad Prism 5 foi usado para analisar dados. Todos os dados são expressos como média ± S.E.M. Student

t

-test foi utilizado na análise de dados de experiências celulares entre dois grupos. A ANOVA foi utilizado para analisar os níveis de proteína de ANO1 em várias linhas de células, e para comparar a diferença no crescimento do tumor. Para a análise de coleções de tecidos patológicos humanos, foi realizado o teste do qui-quadrado. O valor de

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A superexpressão de ANO1 em Adenocarcinoma pulmonar tecidos humanos

Para examinar a nível de proteínas ANO1 canais de cloreto de cálcio activada expressão, usamos anticorpo ANO1 para coloração imuno-histoquímica e detectou expressão ANO1 no pulmão amostras de tecido patológico de 84 pacientes. Como mostrado na Fig 1, a proteína ANO1 foi altamente expressa no adenocarcinoma de pulmão, ao passo que a partir de tecidos benignos alvéolos adjacentes ao carcinoma e carcinoma de células escamosas mostrou coloração negativa de ANO1. A análise de coloração imuno-histoquímica revelou que a expressão da proteína ANO1 foi positiva em 34 dos 44 (77,3%) amostras de tecido de adenocarcinoma do pulmão humano (Tabela 1). Em tecidos de carcinoma do pulmão de células escamosas, 6 de 40 (15%) foram coradas ANO1 positivo. Estes resultados indicam que a proteína ANO1 é sobre-expresso na tumorigénese de cancro do pulmão humano e em particular, o adenocarcinoma do pulmão.

(A) benigna alvéolos adjacentes ao carcinoma mostrando coloração ANO1 negativo. (B) de carcinoma do pulmão de células escamosas, mostrando coloração ANO1 negativo. (C) pulmão tecido de câncer de adenocarcinoma humano que mostra coloração ANO1 (cor marrom) do epitélio neoplásico. A barra de escala indica 50 um.

A sobre-regulação da expressão ANO1 em linhas de células de câncer de pulmão humanos

Usando imunohistoquímica, a nossa conclusão inicial revelou que ANO1 foi sobre-expresso em cancro do pulmão humano tecidos, especialmente no adenocarcinoma. Para confirmar os resultados imuno-histoquímica e determinar se ANO1 também é regulada positivamente em diferentes tipos patológicos de linhas celulares de cancro de pulmão, seleccionados e testados 6 linhas de células diferentes que incluem as células 2bs para a linha celular de pulmão humano normal, GLC82 e Calu-3 células de adenocarcinoma , as células NCI-H520 para o carcinoma de células escamosas, e A549 e H1299 células para tipo não confirmado de câncer de pulmão (Figura 2). As proteínas extraídas de 2BS, NCI-H520, GLC82, Calu-3, A549 ou células H1299 foram separadas por electroforese em gel sob condições desnaturantes e sondadas com um anticorpo específico ANO1. Como mostrado no painel inferior da Figura 2, a análise quantitativa do nível de expressão da proteína ANO1 mostrou uma elevação de cerca de 2,8 vezes na NCI-H520, 6,9 vezes na GLC82, 6,3 vezes na Calu-3, 3,1 vezes na A549 e 8,0 em vezes de H1299, em comparação com células normais de pulmão 2bs. O aumento em GLC82, células H1299 Calu-3 e era estatisticamente significativo, mas não para NCI-H520 e A549 células (P = 0,149 e P = 0,238, respectivamente), embora tenha havido uma tendência de aumento da expressão ANO1. Este resultado é consistente com a análise imuno-histoquímica de tecidos de cancro de pulmão obtidas de doentes (Tabela 1), confirmando ainda que a expressão ANO1 é mais elevada em adenocarcinoma do pulmão GLC 82 células do que as células de carcinoma escamoso HCl-H520. As células GLC82 e NCI-H520 que tinham diferentes níveis de proteínas ANO1 expressão foram selecionados para futuras investigações

Painel superior:. Imagens de Western blot representativos de expressão ANO1 em diferentes linhas de células de pulmão. Painel inferior: estatística gráfico de barras análise (n = 3) de ANO1 níveis relativos em NCI-H520, GLC82, Calu-3, A549 e linhas de células H1299 (em comparação com células normais 2bs). A expressão de ANO1 foram normalizados para o nível de expressão β-Actina. ANO1 é significativamente sobre-expressos em GLC82, Calu-3 e de células H1299 linhas. A significância estatística por análise de variância é dada como *

p Art 0,05; **

p Art 0,01 e ***

p Art 0,001. Todos os dados são apresentados como média ± SEM

A inibição da proliferação de células GLC82 e NCI-H520, silenciando ANO1

Para avaliar o papel biológico de ANO1 na proliferação de células do cancro do pulmão, usamos shRNAs knockdown para a expressão de ANO1 em diferentes linhas celulares. A eficácia de três shRNAs foi avaliada por Western Blot em células de câncer de pulmão GLC82 e NCI-H520. Em comparação com a transfecção de shRNA mexidos, ANO1 shRNA1 transfecção foi mais eficaz em silenciar a expressão endógena de proteínas ANO1 em ambas as células GLC82 e NCI-H520 (figura 3a), e, assim, ele foi utilizado para o resto das experiências.

(a) RNAi knockdown da expressão da proteína em células que expressam ANO1 ANO1 foi mostrado pelas imagens de Western blot. As proteínas da membrana extraídos de células GLC82 e NCI-H520 no 3º dia após a transfecção de diferentes ANO1 shRNAs (shRNA1, shRNA2 e shRNA3) foram coradas imunologicamente com anticorpo ANO1. ANO1 shRNA1 mostrou a inibição mais eficaz da expressão ANO1, em comparação com os outros dois e shRNAs scrambled shRNA. proliferação celular (B) GLC82 ou NCI-H520 foi avaliada por ensaio de CCK8 com base na extracelular diminuindo de WST8 por NADH produzido nas mitocôndrias. Utilizando um leitor de microplacas, o número de células foi quantificada pela medição da absorvância a 450 nm. A transfecção de ANO1 shRNA1 resultou na inibição significativa da viabilidade celular GLC82 e NCI-H529 em modo dependente do tempo, em comparação com as células tratadas com shRNA mexidos (n = 6). (C) a proliferação celular de células de carcinoma foi avaliada pelo ensaio de formação de colónia em cultura na presença de ANO1 shRNA1. A análise quantitativa do grupo de silenciamento ANO1 mostraram menos génese colônia, em comparação com o grupo de shRNA mexidos (n = 3). Imagens representativas são mostrados abaixo gráficos de barras. (D) de ARNi ANO1 inibe a clonogenicidade de células GLC82 em agar mole (n = 3). NCI-H520 não formaram colónias em agar mole. A significância estatística pelo aluno de

t

-teste é indicado como *

p Art 0,05; **

p Art 0,01 e ***

p Art 0,001. Os dados são expressos como média ± S.E.M.

Para determinar a viabilidade e proliferação, foi realizado ensaio de proliferação celular CCK8 usando células GLC82 e NCI-H520. Como mostrado na Fig 3B, silenciando ANO1 significativamente retardado o crescimento de GCL82 adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso de células NCI-H520 pulmonares. A proliferação de células foi inibida em GLC82 maneira dependente do tempo a partir de 89,1% no dia 2, 81,6% nos dias 3 a 75.0% no dia 4. A proliferação de células NCI-H520 foi também inibida a partir de 89,0% no dia 2, 75,3% no dia 3-71,7% no dia 4. para confirmar ainda mais estes resultados, foram utilizados dois ensaios de formação de colónias em ambos os placa de cultura e ágar macio. Como mostrado na Fig 3C, silenciando ANO1 resultou numa diminuição da formação de colónias de 36,2% em células GLC82 e 30,7% a formação de colónias em células NCI-H520, em comparação com o controlo shRNA mexidos. Para confirmar ainda mais o efeito de silenciamento ANO1 sobre a proliferação, utilizou-se o ensaio de formação de colónia em agar mole que monitora o crescimento celular independente de ancoragem. células GLC82 poderia formar colónias em agar mole em trinta dias, mas as células NCI-H520 não formaram colónias. Como mostrado na Fig 3D, a proliferação das células tratadas com GLC82 ANO1 shRNA foi significativamente inibido, em comparação com o grupo de shRNA mexidos. Estes resultados indicam que o silenciamento ANO1 endógena pode inibir a proliferação de células de câncer de pulmão GLC82 e NCI-H520.

Redução da migração celular GLC82 e NCI-H520 e invasão de silenciar ANO1

Para investigar a migração de células de câncer de pulmão, utilizamos ensaio de cicatrização que avalia o fechamento da ferida. Dois dias após a transfecção, as células foram semeadas numa placa de seis poços até 90% confluentes antes de fome durante 24 horas. A camada celular foi cuidadosamente ferido por pontas estéreis, incubadas com meio sem soro. Como mostrado na Fig 4A e 4B, a transfecção de células de cancro do pulmão GLC82 com ANO1 shRNA inibiu a ferida enchendo cerca de 66,8% em 24 horas, 67,5% às 48 h e 74,3% às 72 horas, em comparação com shRNA mexidos. Em células de cancro do pulmão NCI-H520 (figura 4C e 4D), a cicatrização de feridas no grupo knockdown ANO1 foi apenas cerca de 29,1% em 24 horas e 27,6% às 48 h, em comparação com o grupo de controlo shRNA mexidos. Nas 48 h, a cicatrização de feridas era quase total no grupo de controlo shRNA mexidos. Estes resultados mostram que endógena ANO1 promove a migração de células tumorais, e silenciamento ANO1 inibe a migração de células de cancro do pulmão.

Migração de GLC82 e as células NCI-H520 transfectadas com ANO1 shRNA1 mexidos ou shRNA foi avaliada por ensaio de cicatrização . Dois dias após a transfecção, as células foram semeadas numa placa de seis poços até 90% confluentes e, em seguida, após jejum de 24 horas. A camada celular foi cuidadosamente ferido por pontas estéreis, e incubadas com meio isento de soro. (A) imagens de campo claro de ferida em pontos de tempo 0 h, 24 h, 48 he 72 h (GLC82) foram mostrados em pequeno aumento. (B) Quantificação por a mudança na cicatrização de feridas de células GLC82 foi apresentado no gráfico de linha e normalizada para o grupo shRNA mexidos. (C) Fotos de NCI-H520 experimento cicatrização de feridas a 0 h, foram apresentados 24 h e 48 h. (D) Gráfico de linhas de células do NCI-H520 que mostram que a migração celular foi inibida por ANO1 shRNA1 knockdown (n = 3). A significância estatística (Estudante de

t

-teste) é indicado como *

p Art 0,05; **

p Art 0,01 e ***

p Art 0,001. Todos os dados são apresentados como média ± S.E.M.

A característica mais ameaçadora de malignidade no cancro do pulmão é o potencial de invasão e metástases. Para examinar melhor se calar ANO1 também afeta invasão celular, foi utilizado o ensaio transpoço. Dois dias após a transfecção com ANO1 shRNA1 ou mexidos shRNA, GLC82 e células NCI-H520 foram fome de 24 horas antes de incubação adicional na câmara superior. Após 48 horas de incubação para as células NCI-H520 ou 72 horas de incubação para GLC82 células, células invasoras para dentro da câmara inferior foram fixadas com metanol e coradas com DAPI. Como se mostra na figura 5, a capacidade de invasão de células tumorais foi dramaticamente suprimida por ANO1 knockdown. A área de ANO1 silenciados GLC82 células que atravessaram a câmara superior era de apenas 4,0% do grupo shRNA mexidos (Fig 5A e 5B). Como mostrado na Fig 5C e 5D, a área relativa do Transwell ANO1 knockdown em células NCI-H520 foi de 12,2%, em comparação com células transfectadas por shRNA mexidos. Estes resultados indicam que o silenciamento ANO1 inibe a migração e invasão de câncer de pulmão GLC82 e células NCI-H520.

Células

GLC82 e NCI-H520 foram fome de 24 horas antes incubadas na câmara superior com filtros de Matrigel transpoço. Após 48 horas (NCI-H520) ou 72 horas (GLC82), células invasoras para dentro da câmara inferior foram fixadas com metanol e coradas com DAPI. (A) Imagens representam campos microscópicos das células GLC82 invasores. (B) A capacidade de invasão de células que expressam um ou ANO1 shRNA mexidos shRNA foi quantificada por área manchada de invadir células GLC82. A área de invasão é normalizado para grupo shRNA mexidos. (C) fotos representativos de células NCI-H520 invadiram através de filtros de Matrigel transpoço. (D) de chat barra de células NCI-H520, mostrando a diminuição de invasão de células por ANO1 shRNA1 knockdown (n = 3). A significância estatística pelo aluno de

t

-teste é indicado como *

p Art 0,05; **

p Art 0,01 e ***

p Art 0,001. Os dados são expressos como média ± SEM

A supressão do crescimento do tumor xenoenxerto em ratinhos nus por ANO1 knockdown

Para investigar o efeito da ANO1 knockdown no crescimento de tumor xenoenxerto

in vivo

, três grupos de células foram transfectadas individualmente GLC82 com ANO1 shRNA1, ANO1 shRNA2 e mexidos shRNAs, e a sua eficiência knockdown foi confirmada por western blot antes da injecção para a formação de xenoenxerto de tumor em ratinhos (Fig 6A). Nós injetamos 10

7 GLC82 células por rato em membros anteriores direitas de 5 semanas de idade ratos pelados em quatro grupos para a formação de um xenotransplante tumoral. O tamanho dos tumores foi medido pela primeira vez 7 dias após a injecção (dia 0). Como mostrado na Fig 6B e 6C, ANO1 silenciamento resultou numa redução significativa do crescimento do tumor por 68,8% no grupo shRNA1 e 42,1% no grupo shRNA2, respectivamente, em comparação com o grupo mexidos na observação do dia 12. No dia 12, os tumores foram removidos dos ratos e pesados. Uma redução notável de peso do tumor em grupos ANO1 shRNA foi observada (Fig 6D e 6E). Em comparação com o controlo scrambled shRNA, o peso médio do tumor de grupos ANO1 shRNA1 e shRNA2 foi de cerca de 38,7% e 70,1%, respectivamente (Figura 6D e 6E). Além disso coloração imuno-histoquímica de ANO1 no tumor xenoenxerto confirmaram que a redução dos níveis de expressão de proteína ANO1 foi consistente com o volume do tumor nos grupos tratados por ANO1 shRNAs com potência diferente e no grupo de controlo (Fig 6F e 6G). Estes resultados indicam que o silenciamento ANO1 não só inibe a migração e a invasão de células de cancro de pulmão, mas também suprime significativamente o crescimento do tumor.

GLC82 células normais ou células estáveis ​​que expressam GLC82 ANO1 shRNA 1, 2 e ANO1 shRNA mexidos shRNA foram inoculados hypodermically nas patas dianteiras direitas dos ratinhos nu feminino 5 semanas de idade (1×107 células por rato). (A) a análise ocidental da eficiência knockdown para o tipo selvagem GLC82 e células GLC82 estáveis ​​que expressam mexidos shRNA, ANO1 shRNA 1 e ANO1 shRNA 2. (B) imagem representativa de camundongos nus que transportam GLC82 tumores implantados em quatro grupos: grupo em branco (n = 7), mexidos shRNA grupo (n = 8), um grupo grupo ANO1 shRNA1 (n = 8) e ANO1 shRNA2 (n = 8). (C) O tamanho do tumor foi medido cada 2-4 dias por Vernier paquímetro durante o seu desenvolvimento desde o sétimo dia após a injecção. O crescimento de tumores que expressam ANO1 shRNA1 e ANO1 shRNA2 foi significativamente inibida de uma maneira dependente do tempo, em comparação com o grupo de shRNA mexidos. (D) imagem representativa de tumores colhidos de ratinhos no dia 12 de geração. (E) Os tumores foram pesados ​​e analisados ​​após remoção cirúrgica. Comparando com tumores shRNA mexidos, tumores ANO1 shRNAs eram mais leves. A significância estatística (ANOVA) é mostrado como *

p Art 0,05; **

p Art 0,01 e ***

p Art 0,001. Os dados são expressos como média ± S.E.M. (F) Imagens representativas de coloração imuno-histoquímica de expressão ANO1 em tecidos tumorais de xenotransplante. (G) Análise de expressão ANO1 em tecidos tumorais de xenoenxertos foi realizado marcando 0-3 de acordo com a intensidade ea área da coloração.

Discussão

O objetivo deste estudo foi investigar se Ca

2 + -activated Cl

– canal (CACC) ANO1 ou TMEM16A, originalmente identificada a partir de células epiteliais das vias respiratórias, está envolvida na progressão do carcinoma do pulmão de células não pequenas, isto é típico de pulmão epitelial câncer.

neste estudo, nós demonstramos que ANO1 é altamente sobre-expressos em várias linhas celulares de cancro do pulmão e amostras de tecido adenocarcinoma humanos. Silenciamento ANO1 suprime a proliferação celular, migração e invasão, e o crescimento de tumores implantados.