Abstract

Os dados recentes suportam um papel para SHARP1, um repressor básica de transcrição hélice-alça-hélice, na regulação da comportamento de células malignas em vários cancros humanos. No entanto, a expressão eo papel dos SHARP1 durante o desenvolvimento de cancro do endométrio (CE) permanecem obscuros. Aqui, mostramos que a regulação positiva de SHARP1 suprimida a angiogénese tumoral, diminuindo hipoxia-inducible factor-1α (HIF-1α), a viabilidade celular e inibiu o crescimento do tumor em CE. coloração imuno-histoquímica mostrou que a expressão de SHARP1 foi negativamente correlacionada com o estágio do tumor, grau histológico, invasão miometrial, metástase linfonodal, permeação vaso sanguíneo no miométrio e expressão HIF-1α. estudos mecanicistas mostraram que SHARP1 interagiu com HIF-1a fisicamente, eo nível de proteína de HIF-1α e o nível de mRNA de seus genes-alvo (

VEGFA, ANGPTL4

e

CA9

) foram diminuiu SHARP1 sob hipóxia. A sobre-regulação de SHARP1 em CE impedida a angiogénese induzida por hipoxia, reduzindo a secreção de VEGF. A análise imunohistoquímica verificada uma correlação entre a diminuição da expressão SHARP1 e aumento da densidade de microvasos em tecidos da CE. Além disso, SHARP1 inibiu a viabilidade celular em linhas de células de CE. A sobre-expressão de SHARP1 in vivo inibiu o crescimento tumoral e angiogénese, e a diminuição da expressão de HIF-1α. Neste estudo, nós estabelecemos SHARP1 como novo supressor de tumor da CE e lançar luz sobre os mecanismos de como SHARP1 inibiu a progressão CE. Portanto, SHARP1 pode ser um biomarcador de prognóstico valioso para a progressão CE e mostra a promessa como um novo alvo potencial para terapias antiangiogênicas em CE humana

Citation:. Liao Y, Lu W, Che Q, Yang T, Qiu H, Zhang H, et al. (2014) SHARP1 Suprime Angiogenesis de cancro do endométrio por Reduzir hipoxia-inducible factor-1α Nível. PLoS ONE 9 (6): e99907. doi: 10.1371 /journal.pone.0099907

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de fevereiro de 2014; Aceito: 19 de maio de 2014; Publicação: 11 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Liao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (81272885, 81172476, 81072139, 81072140), o Projeto Fundação de Xangai Ciência e Tecnologia Municipal Comissão (No. 13JC1404500) eo Ph.D. Fundação programas do Ministério da Educação da China (No. 20120073110090). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer endometrial (CE) é uma das principais causas de morbidade relacionada ao câncer e mortalidade entre as mulheres. É a quarta neoplasia maligna mais comum entre as mulheres nos Estados Unidos, com um número estimado de 49.500 novos casos e 8200 mortes em 2013 [1]. Embora em estágio inicial CE é muitas vezes tratada com sucesso com a intervenção cirúrgica, o tratamento do avançado CE pode ser difícil e seu prognóstico é pobre [2], [3], em particular no contexto de doença metastática ou recorrente, com uma sobrevida média de apenas 7 -12 meses [4]. opções de tratamento atuais, como a histerectomia, a terapia hormonal, e combinações de radioterapia e quimioterapia, são eficazes para início de carreira CE; No entanto, as terapias alvo eficaz para pacientes com metastático ou recorrente são CE [5] indisponíveis, porque a etiologia e mecanismos biológicos desta doença heterogénea não são completamente compreendidos. Por conseguinte, maior elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes a progressão CE é urgente.

A angiogénese, a formação de novos vasos sanguíneos a partir preexistentes, tem um papel importante no crescimento do tumor, progressão, metástase e [6], [7 ]. Inicialmente, a actividade angiogénica é ausente no início de neoplasias. No entanto, como os tumores crescem além da taxa de oferta existente, o oxigênio se esgota no interior do núcleo. A condição hipóxica resultante (PO

2 10 mmHg [-1,5% O

2]) evita a degradação do factor-1α indutível por hipoxia (HIF-1α) através de supressor de tumor de VHL, permitindo trans-activação de pró- fatores angiogênicos, entre os quais o mais notável é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) [8] – [11]. A investigação recente demonstrou que a via de sinalização de HIF-1α /VEGF está envolvida na proliferação endotelial celular, diferenciação, migração, e permeabilidade vascular [12]. Além disso, a inibição da neovascularização por supressão da via de sinalização de HIF-1α /VEGF pode atrasar a progressão do tumor e talvez mesmo privar células tumorais à morte [13] – [15]. Tal como outros tumores sólidos, o crescimento e a metástase de células CE depende da angiogénese [16]. O mecanismo subjacente a regulação da angiogénese tem sido amplamente descrito em outros tipos de câncer, mas apenas pouco estudada no CE [15].

SHARP1 (também conhecido como bHLHE41 ou DEC2), um membro da subfamília repressor da transcrição do hélice básico -loop-hélice (bHLH) fatores de transcrição [17], [18], é expressa em vários tecidos embrionários e adultos [19], [20]. Existem provas sugere que é um regulador chave da progressão do tumor no cancro oral e da mama, onde os seus efeitos sobre a apoptose de células de cancro, proliferação, e metástase têm sido amplamente investigados [21] – [24]. Além disso, SHARP1 regula negativamente a expressão de VEGF [25], e um estudo recente mostra que SHARP1 suprime a metástase do cancro da mama [23]. No entanto, não se sabe se e, em caso afirmativo, como SHARP1 contribui para o desenvolvimento e progressão da CE, especialmente no que diz respeito à angiogênese, em que a via HIF-1α /VEGF está envolvido.

No presente estudo , demonstramos que a diminuição da expressão de SHARP1 foi significativamente correlacionada com mau resultado clínico na CE. Além disso, pela primeira vez, mostrámos que SHARP1 tem um papel supressivo durante a progressão CE; em particular, SHARP1 inibiu a angiogênese de forma HIF-dependente 1α e pode ser um marcador valioso para a seleção terapia antiangiogênica.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética de Investigação Humana da Paz maternidade Hospital da Criança filiados a Shanghai Jiao Tong University. As amostras de CE e tecidos endometriais normais foram recolhidos depois de receber o consentimento informado escrito dos pacientes. A pesquisa animal foi realizada em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da China. Os procedimentos foram aprovados pelo Departamento de Ciência da Shanghai Jiao Tong University School Laboratory Animal of Medicine. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal.

Pacientes e amostras

amostras de tecidos

parafina-encaixadas foram obtidas de 110 pacientes com câncer de endométrio e 52 pacientes com endométrio normal que se submeteram à ressecção cirúrgica para tratar a outra doenças como mioma ou adenomiose na paz maternidade Hospital Infantil Saúde filiados a Shanghai Jiao Tong University, de 2009 a 2013. A média de idade dos pacientes com CE foi de 56,9 ± 8,8 anos (média ± SD; mediana, 57 anos; intervalo, 33-78 anos). A idade média dos pacientes com endométrio normal foi de 53,9 ± 8,6 anos (média ± SD; mediana, 53 anos; intervalo, 34-70 anos). Não houve diferença significativa em relação à idade do paciente quando as amostras CE e controle foram comparados (

P

= 0,054). No grupo controle, todas as amostras foram espécime de histerectomia, entre os quais 16 casos eram de mulheres pós-menopáusicas, 17 casos eram de mulheres na perimenopausa e os outros eram de mulheres na pré-menopausa. Os estágios (I-IV) e graus histológicos (G1-G3) desses tumores foram estabelecidos de acordo com os critérios da Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) sistema cirúrgico encenação (2009) [26]. Nenhum dos pacientes tinham sido submetidos a terapia hormonal, radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia.

imuno-histoquímica (IHQ) e Avaliações

As secções de tecido (4 mm de espessura) foram preparados a partir de amostras de tecido embebidos em parafina. Os cortes foram desparafinados com xileno seguida de reidratação em álcool graduado. A recuperação de antígenos foi realizada em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA; pH 9,0) durante 20 minutos por aquecimento em um forno de microondas. Em seguida, a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação das secções com peróxido de hidrogénio a 3% durante 10 min, e a coloração não específica foi bloqueada por incubação com soro de cabra normal a 10% durante 30 min. As secções foram incubadas com anticorpo policlonal de coelho contra SHARP1 (uma razão de diluição de 1:100 a 10 ug /ml; Novus, Littleton, CO), anticorpo monoclonal de ratinho contra a HIF-1α (uma razão de diluição de 1:50 a 5 ug /ml ; BD Biosciences, Bedford, MA), anticorpo monoclonal de coelho contra CD34 (uma razão de diluição de 1:100 a 5 ug /ml; Abcam, Cambridge, Reino Unido), e anticorpo policlonal de coelho contra Ki67 (uma razão de diluição de 1:100 a 5 ug /ml; Epitomics, Burlingame, CA) numa câmara humidificada a 4 ° C durante a noite e, em seguida, foram incubadas com o anticorpo secundário biotinilado (uma razão de diluição de 1:1000 a 1 ug /ml; Beyotime, Nanjing, China) durante 30 min, seguido por estreptavidina peroxidase durante 15 min. solução tamponada com fosfato (PBS) foi usada para diluir os anticorpos. A actividade da peroxidase foi detectada por aplicação de 3,3′-diaminobenzidina tetracloreto. Cada etapa de incubação foi realizada a 37 ° C e foi seguido por três lavagens sequenciais com PBS durante 5 minutos cada. Finalmente, as secções foram desidratadas em álcool e limpou em xileno.

O escore foi realizado por dois patologistas independentes que foram cegos aos dados clínicos e patológicos. SHARP1 coloração foi avaliado considerando tanto o número de células com nuclear positivo e coloração citoplasmática e a intensidade da coloração em cada núcleo e citoplasma positivo. O número de células positivas foi classificada como se segue: 0 ( 5%); 1 (5-25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 ( 75%). A intensidade foi classificada como se segue: 0 (negativo); 1 (fraca); 2 (moderada); 3 (forte). A pontuação final foi calculado multiplicando as duas pontuações acima. Dezenas de 0-2 foram definidas como ” expressão negativa ”; dezenas de 3-8 como ” expressão fracamente positivo ”, e dezenas de 9-12 como ” expressão fortemente positiva ” [27]. Para a coloração HIF-1α, apenas a porcentagem de negros, núcleos homogeneamente coradas foi avaliada e coloração citoplasmática foi ignorado. Foi considerado positivo quando 1% de núcleos foram coradas [28]. A densidade microvascular (MVD) foi avaliada por coloração IHC para CD34, que destaca a vascularização do tumor /tecido. Os microvasos foram contadas em três campos diferentes por secção da seguinte forma: lâminas foram primeiro digitalizado sob baixa potência (× 100) para determinar três ” hotspots ” ou áreas com o número máximo de microvasos, em seguida, os vasos sanguíneos positivos manchada no áreas selecionadas foram analisadas no × 400 ampliação [29].

Cultura de células, hipóxicos Condições, e reagentes

linhagens de células CE Humano (Ishikawa e RL95-2) foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). células vasculares umbilicais humanos endoteliais (HUVECs) foram obtidos a partir de Key-GEN Biotech (Nanjing, China). células de Ishikawa e RL95-2 foram cultivadas em DMEM /F12 (Gibco, Auckland, Nova Zelândia) suplementado com soro fetal bovino a 10% (Gibco, Carlsbad, CA). As HUVECs foram cultivadas em RPMI1640 (Gibco) suplementado com soro bovino fetal a 10%. As células foram cultivadas em 5% de CO

2 incubadora humidificada a 37 ° C. Para as experiências de hipoxia, as células foram cultivadas em um hipóxica in vitro ( 0,1% O

2) sistema de recipiente (BD Diagnostics, Sparks, MD). meio condicionado (CM), proteína e RNA foram coletadas imediatamente quando as células foram removidas do recipiente hipóxico.

transfecções transitórias e estáveis ​​para SHARP1-superexpressão

A expressão SHARP1 plasmídeo Pez-M02-SHARP1 e plasmídeo vazio pReceiver-M02-NEG foram adquiridos de GeneCopoeia (Guangzhou, China). transfecção transiente foi realizada em 70% confluentes células de Ishikawa, utilizando Lipofectamine 2000 de reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Para a expressão estável em células de Ishikawa, o gene SHARP1 humano foi clonado em vectores lentivirais com Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP utilizando tecnologia Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o manual de funcionamento (http: //products.invitrogen. com /ivgn /produto /12538120).

pequena interferência RNA (siRNA)

siRNAs foram sintetizados por GenePharma Biotech (Xangai, China). As sequências estão apresentadas na Tabela 1. O siARN foi transfectado em células utilizando Lipofectamina 2000 reagente tal como descrito acima.

Isolamento de ARN e quantitativa PCR em tempo real (qPCR)

O ARN total extraiu-se a partir de células cultivadas utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Da primeira cadeia de ADNc foi transcritos de modo inverso a partir de 1 ug de ARN total utilizando o kit de reagente de primeiro-Script RT (Takara, Dalian, China), e o ADNc foi analisada por qPCR utilizando SYBR Premix Ex Taq (Takara). Para experiências qPCR, os valores no

eixo y

representam 2

(- ΔΔCt), onde ΔCt é a diferença entre o Ct para o gene de interesse e que do gene que codifica β-actina e ΔΔCt é a diferença entre o ΔCt do grupo de controlo e grupo experimental ou primeira pista [30]. Os conjuntos de iniciadores são apresentados na Tabela 2. Os dados foram obtidos em triplicado a partir de três experimentos independentes.

Western Blot

As células foram lisadas em tampão de lise RIPA (Beyotime, Nanjing, China) com protease fluoreto de fenilmetanossulfonilo inibidor (PMSF; Beyotime). A concentração de proteína foi determinada por um kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime). Quantidades iguais de proteína foram carregadas em cada faixa de um gel de SDS-PAGE para a separação de proteínas e transferido para fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA). As membranas foram bloqueadas e depois incubadas com anticorpo policlonal de coelho contra SHARP1 (uma razão de diluição de 1:500 a 2 ug /ml; Novus), anticorpo monoclonal de ratinho contra a HIF-1α (uma razão de diluição de 1:200 a 5 ug /ml; Abcam), e anticorpo policlonal de coelho contra β-actina (um razão de diluição de 1:5000 a 0,2 ug /ml; Epitomics) individualmente a 4 ° C durante a noite. Os anticorpos anti-coelho e anti-murganho secundário, então ligado à peroxidase (uma razão de diluição de 1:5000 a 0,2 ug /ml; Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Foram utilizados para detectar os anticorpos primários ligados

co-imunoprecipitação (co-PI) Ensaio

para estudar endógena SHARP1 /HIF-1α de ligação, as células Ishikawa foram incubadas em condições de hipoxia durante 24 h antes da colheita. Em seguida, dois pratos confluentes de 10 cm de células foram lisadas, como descrito acima. Antes da imunoprecipitação, os lisados ​​celulares totais foram incubadas com IgG de ratinho de 1 ug e 20 ul de uma proteína A + G-agarose a suspensão do grânulo (Beyotime) a 4 ° C durante 2 h, para eliminar a ligação não específica. A centrifugação foi então levada a cabo e o sobrenadante foi recolhido e incubado com rato HIF-1α anti-humano (concentração final: 10 ug /ml; Abcam) ou IgG de ratinho de controlo (concentração final: 10 ug /ml; Beyotime) durante a noite. No dia seguinte, 40 ul de uma proteína A + G-agarose a suspensão do grânulo foi adicionado às misturas de reacção e incubado durante 4 h a 4 ° C com rotação. As proteínas imunoprecipitadas-Co foram analisadas por transferência de Western como descrito acima

enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

kit de VEGF humano

Quantikine foi adquirido a R . D systems (Minneapolis, MN). As células foram semeadas em placas de 12 poços. Às 24 h pós-transfecção, o meio foi substituído por DMEM /F12, e as células foram cultivadas em condições de hipoxia ou normoxia durante mais 24 h. Em seguida, os sobrenadantes foram recolhidos, e VEGF extracelular no meio foi quantificada de acordo com as instruções do fabricante.

endotelial formação de células tubo de ensaio

Uma placa de 96 poços foi revestido com 100 ul de Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA) por poço e mantido a 37 ° C durante 30 min. Em seguida, 2 × 10

4 HUVECs foram suspensos em 1 ml diluídos meio condicionado (CM; 1:10) e aplicada à placa de 96 poços pré-revestidos a uma densidade de 2000 células /poço. CM foi recolhido a partir do sobrenadante de células cultivadas em condições de hipoxia Ishikawa ou normoxia durante 24 h. Após incubação a 37 ° C durante 14 h, o comprimento total dos tubos capilares, como que se tinham formado foram contadas e a média em seleccionados aleatoriamente três campos microscópicos. alterações morfológicas foram observadas sob um microscópio, e as células foram fotografadas em 100 vezes.

Nude mouse tumor xenoenxerto Ensaio

Dezenove camundongos BALB /c nu feminino 6 semanas de idade foram obtidos a partir de Xangai Instituto de Ciências da vida (SLAC Laboratório animal Co., Ltd, China). Para estabelecer um modelo de ratinho nu tendo CE, as células de Ishikawa transfectadas com vector lentiviral contendo o gene humano SHARP1 (Lenti-SHARP1) ou com vector vazio sozinho (Lenti-Control) foram utilizados. Todos os ratinhos foram divididos aleatoriamente em dois grupos de cinco ratinhos (as outras nove ratinhos foram utilizadas para o ensaio de tampão de Matrigel; ver abaixo). As células foram injectadas subcutaneamente no flanco de cada murganho (1 × 10

7 células por injecção). formação de tumor subcutâneo foi monitorizada em todos os ratinhos nus a cada 7 dias a partir de 14 dias após a injecção. Os diâmetros curtos e longos dos tumores foram medidos com paquímetro e tumorais volumes (cm

3) foram calculados usando a seguinte fórmula padrão: volume do tumor (cm

3) = × (maior diâmetro) (os diâmetro mais curto)

2 × 0,5. Os ratos foram sacrificados após a injecção 6 semanas, após o que os tumores foram cuidadosamente removidos e os seus pesos e volumes foram medidos antes de posterior avaliação histológica.

Mouse Matrigel plug Ensaio

Nine nu BALB /c os murganhos foram divididos aleatoriamente em três grupos de três ratos. factor de crescimento reduzido Matrigel (BD Biosciences) (300 ul) foi misturado com as células de Ishikawa transfectadas com plasmídeo vazio sob normoxia ou hipóxia ou SHARP1 plasmídeo de comprimento completo sob hipoxia, ou misturado com o CMS correspondentes (100 ul) a partir das mesmas células mencionadas acima. As células ou CMS correspondentes foram recolhidas ao mesmo tempo depois cultivados sob as condições indicadas, durante 24 h. As misturas foram injectadas subcutaneamente no flanco de cada murganho (lado direito, mistura com células; lado esquerdo, com mistura correspondente CM). Os ratinhos foram sacrificados e os tampões foram removidos 14 dias após a inoculação e fotografada. tampões de Matrigel foram coradas com hematoxilina e eosina (H E) para exame histológico e analisadas por IHC como descrito acima utilizando anticorpos contra a CD34 de rato (1:100, Abcam)

Trans-bem Migração Ensaios

.

para os ensaios de migração trans-bem HUVEC, 1 × 10

4 células suspensas em 200 ul de RPMI 1640 foram semeadas na câmara superior e médio (CM) a partir de diferentes fontes, como descrito nos Materiais e Métodos foi adicionado ao condicionado a câmara inferior, onde as células de Ishikawa foram cultivadas sob normoxia ou hipoxia durante 24 h antes de CM foi recolhido. Cada amostra foi plaqueada em triplicado. Após 24 h de incubação, as células no lado superior da câmara superior foram removidas com um cotonete. As células migratórias (no lado inferior do filtro) foram fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas com violeta de cristal a 0,5%, e, em seguida, o número de células que migram foi contado. Um total de seis campos foram contadas para cada filtro de trans-bem. Cada campo foi contado sob um microscópio e fotografadas com a ampliação de 200 x.

Metil Tiazolil tetrazólio (MTT) Ensaios

As células transfectadas foram semeadas em placas de 96 poços a 5000 células /poço e foram cultivadas de 1 a 4 d. Durante a última 4 h de cultura, o tiazolilo metil tetrazólio (MTT; 5 mg /ml) do reagente (Sigma, St. Louis, MO) foi adicionada ao meio de cultura. Os valores de absorvância foram medidas a 490 nm com um leitor de microplacas (modelo 680; da Bio-Rad, Hercules, CA). Para a detecção de viabilidade HUVEC, 2 × 10

4 HUVECs foram suspensos com 1 ml diluídos cm (razão de diluição 1:10) e semeadas em placas de 96 poços a 2000 células /poço. Após 24 h de incubação, a viabilidade das HUVECs foi detectada pelo ensaio MTT como descrito acima. Em cada experimento e em cada condição, a viabilidade celular foi avaliada em triplicado, e experiências foram repetidas três vezes.

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS versão 17.0 (Chicago, IL ). Os valores representam a média ± DP. Os dados foram analisados ​​por Student não pareado

t

-teste ou one-way análise de variância (ANOVA) para comparações múltiplas. A χ

2 de teste para tabelas foi utilizado para comparar os dados categóricos. teste de coeficiente de correlação de Spearman foi utilizado para a detecção de correlação. A

P

-valor de . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

SHARP1 é regulada negativamente na CE e está correlacionada com características clínicopatológicos

Para determinar o efeito de expressão SHARP1 no desenvolvimento da CE e progressão, escolhemos 52 casos de tecido endometrial normal, 97 casos de cancro do endométrio tecido endometrioid (CEE) e 13 casos de papilar CE seroso ou tecido CE células claras como representantes de tipo I e tipo II CE, respectivamente. Tipo I CE, ocorrendo em cerca de 85% dos doentes, muitas vezes exibe ER positivo. Tumores com este tipo tendem a ser bem diferenciado, de baixo grau e bom prognóstico. Em contraste, tipo II, que consiste principalmente de carcinoma seroso e clara, normalmente surge no endométrio atrófica através de um mecanismo não relacionado com a exposição de estrogênio. Este tipo é geralmente ER negativo e pouco diferenciado, de alta qualidade e mau prognóstico. Embora tipo de conta ECs II por aproximadamente 15% dos casos, eles são responsáveis ​​por cerca de 50% de todas as recaídas [31]. coloração imuno-histoquímica revelou que SHARP1 foi fortemente expresso no citoplasma e núcleo da maioria das células no endométrio normal, mas mostraram uma redução significativa expressão na CE (

P

= 0,00046, Tabela 3; Figura 1A-C).

microfotografias representativos de SHARP1 e coloração HIF-1α em tecidos endométrio (ampliação original: 400 × para as inserções, 200 × para todos os outros; barra de escala, de 100 mm). Painéis A-C mostram coloração imuno-histoquímica para SHARP1 no endométrio normal (A), cancro do endométrio endometrioid (CEE) (B) e papilar serosa CE (C). Painéis D-F mostram coloração imuno-histoquímica para SHARP1 no histológica grau 2 (G2) CEE (D), G3 CEE (E), e células claras CE (F). Painéis G-I mostram coloração imuno-histoquímica para HIF-1α no G2 CEE (G), G3 CEE (H) e de células claras CE (I) nos correspondentes mesmas áreas mesmos casos a coloração SHARP1.

as características clinicopatológicas dos 110 pacientes da CE foram resumidos na tabela 4. em comparação com CEE, expressão SHARP1 foi significativamente diminuída ou perdida na papilar CE seroso ou de células claras CE (

P

= 0,017), o que explica os tipos mais agressivos de CE. Além disso, a expressão SHARP1 diminuiu acentuadamente no final de estágios (estágio III ou IV) ou de alto grau (G3), CE, em comparação com o início de carreira (estágio I ou II) ou de baixo grau (G1, G2), CE (

P = 0,017

e

P

= 0,001, respectivamente). Além disso, também encontramos uma forte correlação negativa entre a expressão SHARP1 ea invasão do miométrio (

P

= 0,002), metástases em linfonodos (

P

= 0,005), e permeação vaso sanguíneo no miométrio (

P

= 0,021). Nós não, no entanto, encontrar correlações significativas entre SHARP1 e outras variáveis ​​clínico-patológicas, incluindo a idade e expressão do receptor de estrogênio, receptor de progesterona, e p53.

A expressão de SHARP1 é inversamente correlacionada com HIF-1α na CE

Para determinar se a expressão SHARP1 reduzida se correlaciona com a expressão HIF-1α em tecidos tumorais, coloração imuno-histoquímica de HIF-1α foi realizado em 104 das 110 amostras de tecido da CE (os seis espécimes de repouso foram faltando ou danificado ). Entre eles, 31 eram fortemente positivas para SHARP1 (29,8%), e 77 de 104 amostras foram positivas para a HIF-1α (74,0%). Apenas os 16 casos eram fortemente positivas para SHARP1 e positiva para o HIF-1α (15,4%). Nossos dados clínicos fornecem a primeira evidência de que existe uma forte correlação inversa entre SHARP1 e expressão HIF-1α na CE (

P

= 0,003, Tabela 5; Figura 1D-I).

SHARP1 Atenua a expressão da proteína HIF-1α e seus genes a jusante na célula Lines CE

Com base nos nossos achados clínicos, propusemos uma potencial relação entre SHARP1 e HIF-1α. Usando qPCR e Western blotting, verificou-se que o

SHARP1

nível foi elevada dupla na linha celular CE RL95-2 em comparação com a linha celular Ishikawa, ambos os quais se originou a partir de adenocarcinoma do endométrio (Figura 2A) . Para investigar mais a função SHARP1 e sua correlação com HIF-1α, nós regulada SHARP1 usando plasmídeos de expressão SHARP1 em células de Ishikawa e derrubou SHARP1 usando siRNA em células RL95-2. A eficiência de transfecção foi confirmado às 48 h e 72 h pós-transfecção para o ARNm e proteína níveis, respectivamente (Figura S1).

(A) Expressão de SHARP1 em células de Ishikawa e RL95-2 como determinado por qPCR (esquerda ) e western blot (direita). (B) Análise de Western blot de controle e SHARP1-superexpressão células Ishikawa cultivadas nos níveis de oxigênio indicado para 24 h. (C) Análise de Western blot dos efeitos de depleção de células em SHARP1 RL95-2 Após 24 h a níveis de oxigénio indicados. (D) a análise qPCR de

HIF-1α

mRNA em células de Ishikawa-superexpressão SHARP1 (à esquerda) e em células RL95-2 controle e que tinham sido transfectadas com controlo ou SHARP1 siRNAs (à direita) incubada no indicaram os níveis de oxigênio durante 24 h. (E) Co-imunoprecipitação (IP-Co) de endógena HIF-1α com SHARP1 endógena a partir de extractos de células de Ishikawa. O asterisco indica uma banda de fundo resultante da reacção cruzada de imunoglobulinas (IgG). (F) qPCR (esquerda) e absorvente análise ocidental (direita) de

SHARP1

em células Ishikawa incubadas nos níveis de oxigênio indicado para 24 h. análise (G) qPCR de

VEGFA

,

ANGPTL4

, e

CA9

no controle e SHARP1-superexpressão células Ishikawa incubadas nos níveis de oxigênio indicado para 24 h. (H) qPCR análises de

VEGFA

,

ANGPTL4

, e

CA9

em células RL95-2 que tinham sido transfectadas com o controle ou siRNAs SHARP1 e incubadas no oxigênio indicado níveis durante 24 h. Para transfecções transitórias, foram usadas plasmídeo (1,6 ug /ml) e siRNA (40 pmol /ml). Os dados representam a média ± DP a partir de uma experiência representativa de três experiências independentes, cada uma realizada em triplicado (*

P

0,05, **

P

0,01, ***

P Art 0,001; NS, não significativo). Para todas as análises qPCR, os níveis de expressão foram comparados com p-actina, e os dados foram normalizados para a expressão mostrado na primeira coluna.

SHARP1 superexpressão diminuiu significativamente o nível de proteína HIF-1α em células de Ishikawa sob hipóxia (Figura 2B). Nós, então, examinou se SHARP1 endógena foi um inibidor relevante dos níveis de proteína HIF-1α. depleção SHARP1 utilizando siRNA aumento do nível de proteína HIF-1α em células RL95-2 em condições de hipoxia (Figura 2C). No entanto, a proteína HIF-1α foi dificilmente detectada em ambas as linhas de células cultivadas sob condições de normóxia. Entretanto, nenhuma mudança significativa na

HIF-1α

nível de ARNm foi observada em células de Ishikawa SHARP1 ou células RL95-2 sobre-expressos com depleção de SHARP1 (Figura 2D). Nós também detectada uma associação física entre o HIF-1α e SHARP1 em níveis endógenos em células de Ishikawa em condições de hipoxia usando um ensaio de co-imunoprecipitação (Figura 2E). Curiosamente,

SHARP1

expressão foi elevada em células de Ishikawa, após terem sido cultivadas em condições de hipoxia durante 24 h (Figura 2F). Além disso, o HIF-1α knockdown utilizando siRNA diminuição da expressão SHARP1 em condições de hipoxia (Figura S2A).

Para testar se SHARP1 funcionalmente afecta a actividade de HIF-1α, qPCR foi usada para detectar diferenças nos níveis de alvo de HIF-1α seleccionado transcritos de genes. Foram avaliados os genes que codificam o factor de crescimento endotelial vascular A (

VEGFA

, uma isoforma de VEGF que é crucial para a angiogénese tumoral e desempenha um papel fundamental na proliferação de células endoteliais, a sobrevivência, e permeabilidade [7], [10 ], [12], [16], [32]), angiopoietin-like 4 (

ANGPTL4

) e anidrase carbônica 9 (

CA9

). Notavelmente, estes genes foram transcricionalmente regulada sob hipóxia em células de Ishikawa, enquanto a expressão SHARP1 umedecido estas induções (Figura 2G). Por outro lado, SHARP1 knockdown estimulou a transcrição destes genes em células RL95-2 em condições de hipoxia (Figura 2H). A expressão destes genes foi, no entanto, não é significativamente afectada pela regulação positiva ou a regulação negativa SHARP1 sob condições de normóxia. Além disso, a regulação negativa de HIF-1α usando siRNA atenuou a expressão de mRNA de

VEGFA

,

ANGPTL4

e

CA9

em células Ishikawa sob hipóxia (Figura S2B).

SHARP1 inibe a angiogênese

HIF-1α é um regulador mestre da angiogênese do tumor [33], e SHARP1 inibida (painel Figura 2G, esquerda)

VEGFA

expressão de mRNA em nosso estudo. Além disso, foi realizada ELISA para detectar a secreção de VEGF em meio condicionado (CM) de células de Ishikawa. SHARP1 superexpressão diminuiu parcialmente a secreção de VEGF induzida por hipoxia em células de Ishikawa (Figura 3A). Assim, considerou-se o choque do SHARP1 em HIF-1α expressão /VEGF afeta a angiogénese desencadeada por hipóxia na CE. Utilizou-se várias abordagens para investigar se e como SHARP1 poderia regular o comportamento de células endoteliais. CM foi recolhido a partir de células de Ishikawa transfectadas com plasmídeo vazio ou SHARP1 plasmídeo de comprimento completo sob a normoxia ou hipoxia durante 24 h. Notavelmente, a capacidade viabilidade e a migração de células HUVEC foram estimuladas por CM de células hipóxicas Ishikawa, enquanto CM a partir de células de Ishikawa hipóxicas que sobre-expressos SHARP1 inibida estes efeitos (Figura 3B e C). Como não há efeitos óbvios de SHARP1 sobre a secreção de VEGF, HUVEC viabilidade e migração foram observados sob normoxia, usamos CM a partir de células de Ishikawa transfectadas com SHARP1 ou vazios plasmídeos sob hipóxia por seguir as experiências, e CM de Ishikawa células transfectadas com plasmídeos vazias cultivadas sob normoxia como um controlo negativo. Para determinar se SHARP1 alterou o comportamento funcional de células endoteliais, células HUVEC foram colocadas numa matriz de membrana basal para induzir formação do tubo capilar semelhante na presença do SCC mencionado acima. formação do tubo foi quantificada calculando a média da comprimento total de tubos com três campos escolhidos aleatoriamente. Da mesma forma, a partir de CM-SHARP1 células que sobre-expressam Ishikawa formação de tubo estimulada por hipoxia e inibiu significativamente a ramificação (Figura 3D).