Abstract

Fundo

Sirtuin 1 (SIRT1) atua como um regulador chave da homeostase vascular endotelial, angiogênese e disfunção endotelial. No entanto, o mecanismo subjacente para a angiogénese carcinoma pulmonar mediada por SIRT1 permanece desconhecida. Relata-se que a nicotinamida adenina 1 (NAD1) dependente deacetilase SIRT1 pode funcionar como um modulador negativo intrínseco da Delta-like ligante 4 (DLL4) /sinalização Notch no carcinoma de pulmão Lewis (LLC), as células endoteliais vasculares derivadas de xenoenxerto ( câncer de pulmão derivado de ECs).

principais conclusões

SIRT1 regula negativamente Notch1 domínio intracelular (N1IC) e genes alvo Notch1 HEY1 e HEY2 em resposta ao ligando (estimulação Delta-like 4 DLL4). Além disso, a SIRT1 desacetilado e reprimido expressão N1IC. ensaio e análise quantitativa do gene repórter da cromatina imunoprecipitação (qChIP) demonstraram que SIRT1 ligado a uma região altamente conservada, que estava localizado a aproximadamente -500 pb a montante do local de início da transcrição de Notch1, e reprimidos transcrição de Notch1. A inibição do crescimento das células endoteliais e brotando angiogénese por DLL4 de sinalização /Notch foi reforçada no CE silenciou-SIRT1 câncer de pulmão derivado e resgatado por DAPT inibidor Notch. In vivo, a um aumento na actividade pró-angiogénico foi observada em Matrigel conecta de SIRT1 específico do endotélio ratinhos knock-in. SIRT1 também melhorou a neovascularização do tumor e o crescimento do tumor de xenoenxertos LLC.

Conclusões

Nossos resultados mostram que SIRT1 facilita células endoteliais ramificação e proliferação de aumentar a densidade de vasos e promover o crescimento do tumor de pulmão através de down-regulação da DLL4 de sinalização /Notch e desacetilação da N1IC. Assim, tendo como alvo a atividade SIRT1 e /ou expressão do gene pode representar um novo mecanismo para o tratamento de câncer de pulmão

Citation:. Xie M, Liu M, ele C-S (2012) SIRT1 Regula endotelial sinalização Notch no câncer pulmonar. PLoS ONE 7 (9): e45331. doi: 10.1371 /journal.pone.0045331

editor: Neil A. Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido

Recebido: 24 de agosto de 2011; Aceito: 21 de agosto de 2012; Publicação: 18 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Xie et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Ciência e Tecnologia Projeto de Planejamento da província de Guangdong, China (número 83050) e da Fundação de Pesquisa médica científica da província de Guangdong, China (número A2009265). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a nicotinamida adenina (NAD) deacetilase dependente Sir2 regula tempo de vida em vários organismos em resposta à restrição calórica [1]. homólogos de mamífero Sir2 compreendem uma família de sete proteínas, que são referidos como SIRTUINAS (a classe III histona desacetilases (HDAC) SIRT1-SIRT7), e foram caracterizados como reguladores-chave de muitos processos fisiológicos importantes associados com o metabolismo e de resistência ao estresse [ ,,,0],2].

estudos recentes têm sugerido que SIRT1 é um importante mediador da homeostase vascular endotelial, especificamente contribuindo para a angiogénese, o tónus vascular, e as funções endoteliais [3]. Notavelmente, SIRT1 é altamente expresso na vasculatura durante o crescimento do vaso sanguíneo, onde se controla a actividade angiogénica de células endoteliais. Além disso, a perda de resultados SIRT1 na sub-regulação de genes relacionados com o desenvolvimento de vasos sanguíneos e remodelação vascular, o que conduz à inibição da germinação angiogénese e a ramificação morfogénese de células endoteliais [4].

A via de Notch regula inúmeras decisões destino celular /linhagem em organismos multicelulares durante a embriogênese normal e desenvolvimento pós-natal [5]. Após a ligação do ligando de Notch ao seu receptor cognato, uma cascata de clivagem proteolítica é iniciada no domínio intramembranar do receptor. O passo de clivagem final é catalisada pelo complexo proteína γ-secretase e conduz à libertação do domínio intracelular de Notch activo. Este fragmento de proteína, em seguida, transloca-se para o núcleo e funciona como um co-factor para regular a transcrição de genes alvo Notch [6]. Para além dos receptores de Notch1 e Notch4, células endoteliais vasculares expressam também uma irregular, semelhante a delta ligando 1 (DLL1), e o Dll4 endotelial específico de células [7]. Zhang et al. relataram que a inactivação de um único alelo do Dll4 levou a letalidade embrionária, sugerindo que a sinalização Dll4 /Notch é essencial para o desenvolvimento vascular. Dll4 expressão é grandemente restringida ao endotélio de vasos em desenvolvimento e as células da ponta de desenvolvimento de artérias, onde funciona para regular o número de células de ponta para controlar o surgimento navio e ramificação [8].

Numerosos estudos têm sugerido que alterações na actividade Notch pode ter efeitos profundos sobre o comportamento endoteliais e formação de vasos sanguíneos. No entanto, pouco se sabe sobre a regulação e adaptação das respostas Notch endoteliais na angiogénese câncer de pulmão. No presente estudo, foram isoladas células endoteliais vasculares de carcinoma de pulmão de Lewis (LLC) xenoenxertos subcutâneos em SIRT1 específico de células endoteliais knock-in C57BL /6J. Os nossos resultados mostram que as células endoteliais que faltam actividade SIRT1 são sensibilizados para Notch, resultando na expressão do gene alvo Notch melhorada e alongamento Sprout diminuída em resposta à estimulação Dll4. Os nossos dados suportam a hipótese de que a sinalização Notch é regulado de forma dinâmica por acetilação e sugerem que SIRT1 atua como um reostato para ajustar as respostas endotelial Notch.

Resultados

Isolation of Vascular Lung Cancer xenoenxerto derivado células endoteliais (Lung Câncer-Derived ECs)

pulmonar ECs derivada-cancerosas foram isolados a partir de xenoenxertos subcutâneos em LLC SIRT1 específico de células endoteliais knock-in C57BL /6J [9] (Fig. 1A). Como mostrado na Fig. 1B, o ECs câncer de pulmão derivado demonstrou a morfologia de paralelepípedos típico e expressa CD31, fabricante de células endoteliais maduras. Além disso, esses ECs expressa níveis elevados de sintetase endotelial específico CE-óxido nítrico (eNOS), mas não de E-caderina (Fig. 1C). Estes dados sugerem que a LLC xenogaft foi eficientemente enriquecido em câncer de pulmão derivado de ECs. Estas células foram então usadas para o subsequente experiências in vitro.

LLC xenoenxertos foram ressecados a partir de ratinhos injectados subcutaneamente no flanco dorsal com células LLC (3 × 10

6 suspenso em 50 ul de PBS) durante 30 dias . Após remoção dos tecidos necróticos óbvias ou composições gordos adicionais, os tecidos picados foram trituradas em gelo usando um moinho de vidro e foram então filtradas através de filtros de células para eliminar os restos de tecido. (A) As células endoteliais derivadas de cancro do pulmão que expressam CD31 foram isoladas a partir da suspensão de célula única por triagem imunomagnética, como evidenciado por microscopia de varrimento, e cultivadas in vitro. (B) CD31 foi detectado nas células endoteliais derivado de isolado de cancro de pulmão através de imunofluorescência. CD31 coloração de anticorpos das membranas CE derivadas de câncer de pulmão é mostrado em vermelho, e coloração DAPI nuclear é mostrado em azul. (C) proteína total foi isolado a partir de células endoteliais de pulmão enriquecido cancro derivado, células bEnd.3 (controlo positivo), e MLE-12 células (controlo negativo). A análise Western blot foi efectuada utilizando anticorpos contra eNOS e E-caderina, e β-actina foi utilizada como controlo interno.

Efeito de hipoxia na SIRT1 expressão em cancro de pulmão derivado ECs

expressão SIRT1 foi avaliada no ECs câncer de pulmão derivado, e como mostrado na Fig. S2A, SIRT1 foi altamente expressa nestas células. Uma vez que a hipoxia é uma característica da maior parte dos tumores, examinámos a expressão SIRT1 sob diferentes condições hipóxicas nestas células utilizando análise de Western blot. Os nossos resultados indicaram que os níveis de proteína SIRT1 foram aumentadas de um modo dependente do tempo e atingiram o máximo às 8 h após a exposição a células endoteliais de pulmão de cancro derivado de hipóxia (Fig. 2A). Para determinar se essas mudanças nos níveis de proteína SIRT1 durante a hipóxia foram devido a alterações na transcrição do gene SIRT1, medimos níveis de mRNA SIRT1 usando em tempo real RT-PCR. Os dados revelaram os resultados semelhantes, como observado na expressão da proteína SIRT1 (Fig. 2B). Estes resultados demonstram o efeito da hipóxia na expressão de SIRT1 em ECs câncer de pulmão derivado.

(A) Análise de Western blot de SIRT1 em ECs derivadas de cancro do pulmão expostos à hipoxia (2% O

2) para o tempo indicado utilizando um anticorpo contra SIRT1. (B) os níveis de ARNm SIRT1, tal como medido pelo tempo real de RT-PCR, de ARN total obtido a partir de células endoteliais derivadas de cancro do pulmão expostas a hipoxia (2% O

2) para o período de tempo indicado. Os dados representam a média de três experiências independentes a partir de cada ponto de tempo realizadas em triplicado. * P . 0,05, em comparação com o controle

SIRT1 Negativamente Regula N1IC por desacetilação e controla os genes Notch alvo em Lung Cancer derivado ECs

Após a translocação para o núcleo, o intracelular domínio de Notch1 (N1IC) interage com a proteína de ligação de ADN CSL (nomeado para CBF1 em mamíferos, Su (H) em Drosophila, e Lag-1 em Caenorhabditis elegans), que resulta na activação da transcrição de genes alvos de Notch1. Porque N1IC sofre rápida degradação mediada por ubiquitina e acetilação pode prejudicar a ubiquitinação [10], examinámos o efeito de SIRT1 na expressão N1IC e descobriu que a inactivação de SIRT1 levou a um aumento da expressão da proteína N1IC em resposta à estimulação Dll4 (Fig. 3A). Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que regula negativamente a SIRT1 Notch sinalização em células endoteliais quando os sinais Dll4 /Notch1 são activados.

(A) derivado de ECs cancro do pulmão foram transfectadas com ARNsi de controlo ou SIRT1 durante 48 horas e cultivadas em a ausência ou presença de Dll4 por um adicional de 6 h. Em seguida, a expressão da proteína N1IC foi detectada utilizando análise de Western blot. bloqueio mediada por siARN da actividade SIRT1 em células endoteliais aumentou os níveis de proteína N1IC endógenos. (B) Pulmão ECs derivada-cancerosas foram transfectadas com HA-N1IC, pcDNA-SIRT1, H363Y pcDNA-SIRT1, ou pcDNA3 (4 ug /mL de cada) durante 48 h e foram depois tratadas com ou sem 5 NAM nM durante mais 12 h. Depois, os extractos celulares foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-HA e sujeitas a análise de Western blot com um anti-lisina de acetilo (painel superior) ou anticorpo anti-HA (painel inferior). (C) Pulmão ECs derivada-cancerosas foram transfectadas com triplo N1IC, o p300 acetiltransferase, e quantidades crescentes de SIRT1, e as células foram lisadas 48 h mais tarde. níveis comparáveis ​​de N1IC foram imunoprecipitadas e apagou de resíduos acetilados de lisina (IP: HA e IB: anti-acetil; painel superior). A mancha foi sondado para HA, que demonstraram níveis aproximadamente iguais de HA-N1IC (IP: HA e IB: HA; painel inferior). ECS (D) Pulmão cancro derivadas foram transfectadas com N1IC, o p300 acetiltransferase, e quantidades crescentes de SIRT1 em conjunto com o repórter de luciferase de Renilla e o plasmídeo pGL3-CBF contendo um gene repórter de luciferase de pirilampo, durante 24 h. Em seguida, a actividade de luciferase foi medida utilizando um ensaio de repórter de luciferase dupla. Os dados foram normalizados para a actividade da luciferase de Renilla (média ± SD; n = 3). análise (E) qChIP de ocupação SIRT1 na região promotora proximal do Notch1 em ECs câncer de pulmão derivado. SIRT1 ocupava uma região específica de -500 pb do locus Notch1. SIRT1 foi imunoprecipitada (IP) com soros anti-SIRT1 (SIRT1 IgG) ou soro pré-imune (IgG normal, utilizada como controlo) (média ± SEM; n = 3). * P 0,05 como comparado com o controlo. (F) de luciferase repórter resultados do ensaio do gene. pGL3, pGL3-Notch1 -500 a 400 (N + 400), ou pGL3-Notch1 + 400-1750 (N + 1750) foram transfectados em células HEK293 com ou sem SIRT1. * P 0,05. As barras de erro representam o SEM. (G) A expressão dos genes alvo Notch HEY1 HEY2 e foram avaliados no controle siRNA- e cancro do pulmão derivado SIRT1 siRNA-transfectadas células endoteliais, os quais foram subsequentemente transfectadas com vector vazio ou N1IC durante até 48 h. células endoteliais SIRT1 deficiente exibida HEY1 marcadamente melhorada e actividade HEY2 em resposta a N1IC superexpressão. * P 0,05 como comparado com o controlo. (H) Pulmão ECs derivada-cancerosas foram transfectadas com ARNsi de controlo ou SIRT1 e tratadas com DMSO ou NAM 20 mM durante 24 h, seguido de incubação com Matrigel por um adicional de 5 h. Em seguida, a formação do tubo foi avaliada utilizando um microscópio de fase invertida. Os gráficos de barras representam os resultados de densitometria. * P 0,05 como comparado com o controlo

A seguir foi testado se SIRT1 regula negativamente N1IC através de desacetilação.. Resumidamente, diferentes versões do N1IC marcada com HA (HA-N1IC) foram expressos em ECs derivadas de câncer de pulmão com vectores que codificam SIRT1 ou um mutante SIRT1 falta de atividade deacetilase (SIRT1 H363Y). Os extractos celulares foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-HA e detectado com uma imunotransferência, utilizando um anticorpo contra a acetil-lisina. Os nossos resultados demonstraram que a expressão de HA-acetilado N1IC foi significativamente reduzida em células que expressam SIRT1 cheio, em comparação com os níveis de proteína em células que expressam SIRT1 H363Y (Fig. 3B). No entanto, quando as células foram tratadas com NAM 5 nm, a inibição mediada por SIRT1 N1IC de acetilação foi aliviada. Além disso, a transfecção de câncer de pulmão derivado de ECs com N1IC, o p300 acetiltransferase, e quantidades crescentes de SIRT1 revelou que p300 foi capaz de acetilação N1IC (Fig. 3C) e aumentando a atividade transcricional N1IC (Fig. 3D). No entanto, a adição de SIRT1 aboliu a forma acetilada de N1IC e actividade N1IC significativamente diminuída induzida por P300. Estes resultados sugerem que a actividade de desacetilases SIRT1 reduziu a abundância de N1IC acetilado. Além disso, a ativação de SIRT1 por srt1720 ou SRT2183 (activadores da NAD

+ – deacetilase dependente) reduziu os níveis de proteína N1IC endógenos (Fig. S1A) e bloquear a atividade desacetilase de SIRT1 com a nicotinamida inibidor da sirtuína (NAM) aumentou endógena N1IC níveis em células endoteliais (Fig. S1B).

para definir o mecanismo pelo qual reprime a expressão SIRT1 N1IC, examinámos o recrutamento de SIRT1 para o locus de Notch1 em resposta à estimulação Dll4 usando análise qChIP. Digno de nota, o locus de Notch1 é pensado para conter mais de 20 regiões altamente conservadas [11]. Os nossos dados indicam que SIRT1 ligado a uma região altamente conservada, que estava localizado a aproximadamente -500 pb a montante do local de início da transcrição de Notch1 (Fig. 3E). Esta descoberta sugere que SIRT1 pode controlar diretamente a expressão de Notch1 através da ligação com a região promotora proximal de Notch1. Para determinar a consequência funcional da ligação SIRT1 ao locus de Notch1, as construções repórter da luciferase contendo o gene repórter de Notch1 foram transfectados em células HEK293. Estes resultados demonstraram que a SIRT1 inibiu significativamente a actividade do repórter de Notch1 quando o local de ligação SIRT1 estava presente (Fig. 3F, N + 400), que não foi observada quando o local de ligação SIRT1 estava ausente (Fig. 3F, N + 1750). Isto confirmou ainda mais a nossa observação de que SirT1 reprimido Notch1 transcrição através da ligação ao promotor de Notch1.

e HEY1 HEY2 genes alvo são directos da via de sinalização Notch durante o desenvolvimento vascular [12]. Para investigar o efeito da SIRT1 no HEY expressão, expressão SIRT1 foi silenciado em ECs derivadas de câncer de pulmão por siRNA, ea expressão de HEY1 e HEY2 foi determinada. Notavelmente, pulmão SIRT1 deficiente câncer derivadas de ECs superexpressão N1IC exibido um nível marcadamente melhorada do HEY1 ea atividade HEY2 (Fig. 3G). Da mesma forma, o silenciamento de SIRT1 significativamente reforçada HEY1 e expressão HEY2 em câncer de pulmão derivado de ECs em resposta à estimulação DLL4, enquanto nenhuma alteração foi observada em ECs unstimulated câncer de pulmão derivado (Fig. S1C). Este resultado indicou que a regulamentação SIRT1 de genes alvo Notch era dependente de estimulação DLL4. Além disso, a capacidade de resposta aumentada a Notch Dll4 de ECs SIRT1 deficiente cancro do pulmão derivado foi anulada pela adição do inibidor de DAPT γ-secretase (Fig. S1C). Em contraste, a activação de SIRT1 sinalização através do uso da pequena srt1720 moléculas ou SRT2183 inibiu a indução Dll4-mediada de HEY1 e expressão HEY2, indicando que SIRT1 moduladas negativamente Dll4 /Notch1 sinalização em células endoteliais de pulmão de cancro derivado (Fig. S1D).

SIRT1 regula a atividade angiogênico do Lung Cancer derivado ECs

a inibição do crescimento de células endoteliais por DLL4 de sinalização /Notch foi reforçada em ECs derivadas de cancro do pulmão silenciou-SIRT1 e foi resgatado por inibidor Notch DAPT (Fig. S2A). Na fase tardia de angiogénese, as células endoteliais auto-montar em tubos para formar novos vasos sanguíneos [13]. Em seguida, investigaram os efeitos da SIRT1 na neovascularização, examinando a formação do tubo. Como mostrado na Fig. 3H, formação tubular foi significativamente inibida em ECs silenciou-SIRT1 câncer de pulmão derivado. Da mesma forma, a formação do tubo em ECs câncer de pulmão derivado também foi reprimida quando as células foram tratadas com o inibidor NAM SIRT1 deacetilase. Para confirmar esta regulação mediada por SIRT da função celular endotelial, tridimensionais in vitro Os ensaios de angiogénese foram realizadas utilizando colagénio esferóides endoteliais incorporado-gel que tinha sido transfectadas com ARNsi de controlo ou SIRT1. Como mostrado na Fig. S2B, os comprimentos cumulativos broto de esferóides em ECs derivadas de cancro do pulmão transfectadas com ARNsi SIRT1 foram significativamente mais curtos do que nas células transf ectadas com o controlo. Além disso, o tratamento com DAPT revogada a inibição da resposta angiogénica para ECs derivadas de cancro do pulmão induzidas por meio de silenciamento SIRT1, sugerindo que SIRT1 é um importante modulador da função endotelial angiogénico.

Efeito do SIRT1 sobre a neovascularização do tumor LLC em xenoenxertos

Para investigar o papel da SIRT1 na vascularização in vivo, foi realizado um ensaio de tampão de Matrigel. Em contraste com as fichas em controle de camundongos C57BL /6J, as fichas em SIRT1 knock-em ratinhos transgénicos apresentaram uma coloração vermelha brilhante, que indicou que SIRT1 induziram a formação de novos vasos sanguíneos. O nível de hemoglobina, o que é indicativa do grau de angiogénese, foi maior no Matrigel conecta a partir de ratinhos transgénicos SIRT1 do que os de controlo de murganhos C57BL /6J (Fig. 4A). Para investigar o efeito do gene SIRT1 na vascularização do tumor e o crescimento do tumor, as células LLC foram injectados subcutaneamente em SIRT1, SIRT1 H363Y, e do tipo selvagem da estirpe C57BL /6J. Estes resultados indicaram que o volume do tumor LLC nos SIRT1 knock-in ratinhos transgénicos foi de 115% do que o observado nos ratinhos de controlo 30 dias após a implantação de células de tumor. Em contraste, o crescimento do tumor nos ratinhos transgénicos SIRT1 H363Y foi reduzida e foi semelhante ao observado nos ratos de tipo selvagem. Além disso, nos ratinhos transgénicos SIRT1, o crescimento do tumor foi diminuído quando a actividade de desacetilase de SIRT1 foi bloqueada com a administração da classe III nicotinamida inibidor de HDAC (Fig. 4B). Após a avaliação do índice de densidade de microvasos por coloração com anticorpo CD31, o aumento do crescimento do tumor observada no SIRT1 knock-em ratinhos transgénicos estava associado com um aumento na vascularização do tumor. Além disso, o tratamento anti-Dll4 revelou que o crescimento do tumor reduzido foi associada com uma diminuição aparente na densidade vascular do tumor (Fig. 4C).

(A) SIRT1 promove a angiogénese in vivo. tampões de Matrigel foram injectadas subcutaneamente para os abdómens dos ratos de controlo ou SIRT1 transgénica, e os tampões foram extraídos 7 dias mais tarde para determinar a extensão da vascularização. A quantidade de hemoglobina presente nas fichas foi quantificada como um indicador da formação de vasos sanguíneos funcionais (média ± SD; n = 10 para cada grupo). * P 0,05 como comparado com o controlo. (B) Mudanças nos volumes tumorais médios medidos em murganhos de tipo natural (controle) C57BL /6J, SIRT1, ou SIRT1 (H363Y) seguintes inoculação com células LLC para o período de tempo indicado. * P 0,05, em comparação com os ratinhos SIRT1. (C) As fotomicrografias de coloração IHC CD31 nas secções de xenoenxertos LLC (ampliação, × 200) a partir de tipo selvagem, ou SIRT1 ratos H363Y (SIRT1). Quando os volumes dos tumores de xenoenxerto atingiu cerca de 100 milímetros

3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente para o grupo de controlo (n = 8) ou o braço experimental (anticorpo monoclonal Dll4; n = 10). Os campos de grande aumento (400 ×) foram analisadas para contagem de densidade de microvasos utilizando o software ImageJ (média ± SD; n = 10 para cada grupo). * P 0,05, em comparação com os ratinhos SIRT1. Os volumes médios de tumor do tipo selvagem, e SIRT1 SIRT1 ratinhos (H363Y) foram medidas às 4 semanas após o tratamento. * P . 0,05 como comparado com o controlo

Discussão

Este estudo expande o papel de SIRT1 para incluir a modulação específica da actividade angiogénica em células endoteliais. Para examinar o efeito de SIRT1 na angiogénese cancro do pulmão, estabelecemos LLC modelos de xenoenxerto com SIRT1 específico da célula endotelial e a expressão H363Y SIRT1 em ratinhos transgénicos. As células endoteliais foram isolados com sucesso a partir de xenoenxertos de ratinhos transgénicos LLC SIRT1 utilizando pérolas magnéticas CD31 conjugado, bem como uma série de passos de remover todas as células tumorais que contaminam e leucócitos. O bloqueio da função SIRT1 aboliu a formação do tubo endotelial e formação de broto in vitro, que foi anulada pela inibidor Notch. Estes resultados sugerem que a regulação mediada por SIRT1 da via Notch nas células endoteliais pode ser modulada.

Em nossos estudos, SIRT1 foi altamente expressa em ECs câncer de pulmão derivado. Além disso, a hipoxia foi mostrado ser uma das causas mais importantes para o crescimento de novos vasos sanguíneos em tumores malignos [14]. Zhang et al. demonstrado que, devido HIC1 (hipermetilado em Câncer 1) ligado ao promotor SIRT1, a consequente redução de recrutamento CtBP diminuiu repressão da transcrição e expressão SIRT1 induzida em células de cancro do pulmão [15]. Nossa hipótese é que regulação SIRT1 durante a hipóxia pode ser conferida através de mudanças na expressão gênica SIRT1 em ECs câncer de pulmão derivado. Para o nosso conhecimento, este foi o primeiro estudo a demonstrar que a expressão SIRT1 é aumentada de um modo dependente do tempo durante a hipóxia em células endoteliais do tumor.

A seguir, perguntou se SIRT1 interagiu com determinados parceiros de transcrição em células endoteliais vasculares para mediar os seus efeitos específicos. Guarani et ai. [16] anteriormente mostraram que a acetilação da N1IC em lisinas conservadas controlada a amplitude ea duração das respostas Notch através retorno da proteína N1IC alterada. SIRT1 associados com N1IC e funciona como uma desacetilase N1IC para inibir induzida por acetilação estabilização N1IC. Consistentemente, os nossos resultados também indicaram que SIRT1 desacetilado e reprimiu a expressão N1IC, o que levou à germinação angiogênico reforçada e tubulogenesis regulada pela via de sinalização angiogénico-dependente SIRT1. Mais importante ainda, mostrámos pela primeira vez que a SIRT1 foi recrutado para uma região altamente conservada situada em -500 pb a montante do local de Notch1 transcricional de iniciar, o que sugeriu que SIRT1 pode ligar directamente ao promotor de Notch1, inibindo assim a expressão do gene. De notas, SIRT1 regulada negativamente Notch1 via desacetilação, portanto, alterações ao nível da transcrição do Notch também podem desempenhar um papel na redução da atividade Notch afetados por SIRT1. Isso precisa ser ainda mais determinada.

HEY é hélice-alça-hélice (bHLH) repressor da transcrição. HEY membros da família são considerados genes alvo de Notch1 de sinalização no endotélio porque a sua expressão pode ser induzida por Notch1 [12]. Neste estudo, foi examinada a capacidade de SIRT1 para regular a expressão dos genes controlados pelo N1IC, tais como HEY1 e HEY2. De acordo com relatos de Mulligan et al. [17], nossos resultados revelaram que SIRT1 regular negativamente a expressão de HEY1 e HEY2 em ECs câncer de pulmão derivado. Além disso, Takara et ai. demonstraram que SIRT1 funcionalmente interage com os repressores bHLH Cabeludo e intensificador-de-dividida [18]. Para investigar ainda mais os efeitos de SIRT1 sobre a resposta celular mediada por Notch e o crescimento do tumor, foi investigada a formação de rebento em ECs derivadas de cancro do pulmão e descobriram que a inactivação de SIRT1 auditivos formação de rebento e alongamento. Estes efeitos foram revertidos pela adição oo DAPT inibidor Notch1, o que sugere que SIRT1 modula funções angiogénicos endoteliais, regulando a sinalização Notch. No entanto, a inativação de SIRT1 não impediu completamente a formação de broto. Assim, a hipótese de que, além de Notch1, novos factores de transcrição regulados por SIRT1 também podem estar envolvidos no desenvolvimento vascular, embora estudos futuros são necessários para abordar o papel destes reguladores desconhecidos no câncer de pulmão.

Guarani et ai. relataram que se podia ligar a p300 N1IC e funcionar como um co-activador de promotores regulados com entalhe [16]. Além disso, nosso estudo mostrou que a p300 não só era capaz de acetilação N1IC mas também poderia ativar a sua transcrição. Mais importante ainda, a SIRT1 inibiu a forma acetilada de N1IC e diminuiu significativamente a actividade N1IC na presença de p300. Por outro lado, o tratamento com o inibidor da desacetilase de NAM conduziu a um aumento significativo na expressão de ARNm N1IC. Assim, concluímos que a atividade desacetilase SIRT1 alterou a Notch endotelial cascata de sinalização por desacetilação N1IC e antagonizar p300. Hansson, et al. mostrou que MAML1 (Notch coativador) podem potenciar autoacetylation p300 e ativação p300 transcrição [19]. No entanto, nossos resultados sugerem que SIRT1 interage fisicamente com e reprime p300 transativação de uma forma dependente de NAD. SIRT1 repressão de p300 foi demonstrado que ocorrem através de desacetilação de dois resíduos de lisina (1020 e 1024), no domínio rico em cisteína p300 (CRD1) [20]. Porque p300 é uma gating cofactor de transcrição, desacetilação e repressão do p300 por SIRT1 pode servir como um importante ponto de integração durante o metabolismo e diferenciação celular.

Após a ligação de um ligando transmembrana da Delta /famílias irregulares, transmembrana Notch receptores geralmente fornecem sinais que guiam o destino celular. Em particular, Dll4 é necessário para o desenvolvimento vascular e é fortemente expressa em vasos tumorais [21]. Além disso, o estudo de SIRT1 knock-em ratinhos indicaram que SIRT1 funcionou para manter a capacidade de neovascularização em resposta à estimulação Dll4 no endotélio vascular tumoral. Para determinar a função de Dll4 durante a angiogénese de tumores nos ratinhos transgénicos SIRT1, que diminuiu o nível Dll4 presente em um modelo de tumor de murino, utilizando um anticorpo monoclonal anti-Dll4. Os nossos resultados sugerem que a inibição da sinalização Dll4-Notch resultou num aumento da densidade de tumor vascular. Surpreendentemente, este fenótipo de crescimento excessivo vascular resultou na inibição do crescimento do tumor. Uma explicação plausível poderia ser que os resultados de ramificação excessivos em uma rede vascular altamente caótica falta o essencial hierarquia para o fluxo sanguíneo direccional eficiente. Os estudos de perfusão demonstrou que a vasculatura tumoral hypersprouting não era funcional [6], o que sugere que o bloqueio da sinalização de Dll4-Notch pode levar a embarcação de tumor “abnormalization” e inibiu o crescimento tumoral. Em células endoteliais, SIRT1 modula a actividade transcricional de p53 e FoxO1, e activa a actividade enzimática da sintase do óxido nítrico endotelial (eNOS). Dada a multiplicidade de factores a jusante segmentados por SIRT1 por desacetilação, SIRT1 foi levantada a hipótese de actuar como um regulador chave das várias vias envolvidas no crescimento do tumor e vascularização [22]. Nossos resultados sugerem que o bloqueio pharmacological- ou molecular baseados em atividade SIRT1 pode representar uma abordagem promissora e inovadora para bloquear a progressão do tumor.

Em conjunto, nosso estudo demonstram um novo papel para a SIRT1, em que SIRT1 atua como um cell- modulador negativo autónoma de sinalização de Notch, e estes resultados identificam a acetilação reversível de N1IC como um mecanismo chave molecular pelo qual as respostas de Notch pode ser modulada de forma dinâmica. SIRT1 inibe a forma acetilada de N1IC e diminui significativamente a actividade N1IC induzida pela P300, limitando, assim, a resposta de sinalização Dll4 /Notch e inibição da angiogénese do tumor (Fig. 5). Nossos resultados sugerem que o bloqueio da atividade SIRT1 e /ou expressão de genes pode fornecer novas oportunidades para o tratamento anti-cancro.

O nosso estudo mostram que a Delta-like ligante 4 (DLL4), que é altamente expressa em células vasculares durante a angiogénese de tumores, se liga ao receptor de Notch1 e inicia clivagens proteolíticas. A clivagem intramembranar final, catalisada pela γ-secretase leva à liberação do ativo Notch1 domínio intracelular (N1IC), que transloca para o núcleo e recruta o MAML1 proteína e histona acetiltransferase (chapéus, tais como p300) ao complexo CSL. Este recrutamento conduz à activação de genes alvo de Notch1 HEY1 e HEY2. Por outro lado, p300 acetila N1IC e aumenta a sua actividade de transcrição enquanto que SIRT1 inibe a forma acetilada de N1IC e diminui significativamente a actividade N1IC induzida pela P300, limitando, assim, a resposta de sinalização Dll4 /Notch e a inibição da angiogénese tumoral.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todo o trabalho animal foi conduzido sob as diretrizes institucionais da província de Guangdong e aprovado pelo Comitê de Uso para o cuidado de animais. Aprovação também foi obtido a partir da comissão de ética de Guangzhou Instituto de Doenças Respiratórias Investigação (ID. 2009-2130).

Reagentes e

in vitro

Os tratamentos com células

A nicotinamida e N – [N- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-alanil] -S- fenilglicina t-butil éster (DAPT) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (EUA). SRT2183 SRT1720 e foram adquiridos a partir de Sirtris Pharmaceuticals (USA). Dll4 foi adquirido a R D Systems (EUA). Os grupos de controlo foram tratados com os respectivos veículos. O anticorpo monoclonal anti-DLL4 (a isótipo IgG1 humana que reage de forma cruzada com as duas DLL4 humano e do rato, 1 mg /mL) foi um presente da MedImmune, LLC (EUA).

modelos de xenotransplante

C57BL /6J (fêmeas, 6-8 semanas de idade, pesando 15-22 g) foram adquiridos a partir de Xangai SLAC Laboratório animal Co., Ltd. (China). -transgenic C57BL /6J endoteliais específicos de células SIRT1-knock-in ou SIRT1 (H363Y) foram fornecidos pela Academia Chinesa de Ciências Médicas. Para gerar SIRT1 específico do endotélio ou SIRT1 (H363Y) ratinhos -transgenic, ADNc SIRT1 humano (NCBI Ref: NM_012238.4) ou SIRT1 (H363Y) de cDNA foi ligado com o rato VE-caderina promotor, e os clones resultantes foram referidos como VE-S.