Abstract

Apresentamos um

in silico-to-in-vitro

abordagem para desenvolver bem definido, auto-montado, polimérica rígida tubulares (Polybee) nano-arquitetura para entrega controlada de um componente-chave de veneno de abelha, melitina. Uma formulação competitivo com (Lipobee) micelas cored rígida encapsulada-lipídico também é sintetizada. Em uma série de experimentos sequenciais, mostramos como a química nanoescala influencia a entrega de toxinas de veneno para a regressão do câncer e ajudar a fugir disintegrity sistêmica e nocividade celular. Uma associação relativamente mais fraco de melitina no caso de nanopartículas à base de lípidos é comparada com as partículas poliméricas reveladas por minimização de energia e de encaixe estudos, os quais são suportados por estudos biofísicos. Pela primeira vez, os resultados da experiência dos autores indicam que a melitina pode desempenhar um papel significativo no ADN processos de associação-de dissociação, o que pode ser uma via possível para a sua actividade anti-cancerígena

citação:. Misra SK, Ye M, Kim S, D Pan (2015) Definido Nanoscale Química Influencia Entrega de peptido-toxinas para terapia do câncer. PLoS ONE 10 (6): e0125908. doi: 10.1371 /journal.pone.0125908

Editor do Academic: Mandé Holford, The City University of New York-Graduate Center, United States |

Recebido: 22 Outubro, 2014; Aceito: 23 de março de 2015; Publicação: 01 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Misra et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Illinois. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

peptídeos de defesa do hospedeiro (HDPS) são uma classe de substâncias evolutivamente conservadas da resposta imune inata que são reconhecidos como os jogadores principais no sistema de defesa encontrado entre todas as classes de vida. Eles são geralmente anfipática, têm uma carga positiva líquida (geralmente 2-9) e são curtos em sequência (10-100 aa); Além disso, HDPS foram recentemente explorado para as suas propriedades anti-cancro [1-4]. Esta classe de peptídeos apresenta muitas características ideais para aplicações de tratamento anticancerígeno, como i) alta solubilidade em água, ii) um amplo espectro de citotoxicidade, e iii) a capacidade de superar a resistência a múltiplas drogas, que se desenvolveu em células cancerosas tratadas com medicamentos quimioterápicos convencionais [5]. Vários estudos biofísicos mostraram que pequenas proteínas ou péptidos (20-40 resíduos de aminoácidos) podem penetrar as membranas celulares dos microorganismos. Melitina, um péptido anfipático catiónico constituído por 26 aminoácidos (AA) resíduos, tem sido encontrado para ser um componente potente de veneno de abelha

Apis mellifera

[6]. Tem sido provado ter um efeito citotóxico direto sobre uma ampla gama de linhas celulares de cancro

in vitro

. Tem sido relatado que a melitina inibiu o crescimento celular em duas células de cancro do ovário através da indução de receptores de morte e a regulação por diminuição de JAK2 /STAT3 [7, 8]. Exerce a sua actividade tóxica por perturbar as membranas plasmáticas após a formação de poros. aa catiônica resíduos de melitina interagir diretamente com membranas celulares aniônicos através de interações eletrostáticas e regiões hidrofóbicas; esta interacção é responsável por permeação de membrana e ruptura [6]. Uma proteína comparativamente curto, com uma distância de ponta a ponta de ~ 3,5 nM, a dimensão serve perfeitamente, como uma única hélice-alfa-medindo transmembranar. Numerosos estudos demonstraram que computacionais poros melitina formas transmembranares da sua interacção com membranas de lecitina (PC 2 ~ 3 nm de diâmetro). Sua potente atividade tem atraído pesquisadores para utilizar melitina para a próxima geração de agente terapêutico anticancerígeno. No entanto, o potencial terapêutico não foi totalmente conseguida na clínica devido à sua toxicidade off-alvo, rápida degradação e depuração

in vivo

. Melitina foi incorporada em partículas revestidas de lípidos de perfluorocarbono a acumular-se em múltiplos alvos de tumor, reduzindo drasticamente o crescimento de tumores [7].

Embora algumas destas abordagens prometer claramente sucesso em estudos pré-clínicos iminente, o seu potencial de translação não foi plenamente realizados. Nenhum ou muito pouca informação pode ser encontrada na literatura quanto à sua utilização translacional em estudos humanos. Para melhorar a selectividade e reduzir a toxicidade, a implementação veículo de entrega em seres humanos vai exigir muito cuidado. É, portanto, imperativo que enfatizam a estratégia química fundamental e racionalmente aproximar o desenho do veículo adequado para utilização translacional. Uma melhor compreensão da interação de toxinas de veneno em nanoescala é crítica, o que pode ditar a sua estabilidade global, a integridade sistêmica e nocividade celular. Um estudo cuidadosamente estruturado para compreender as interações de melitina com os componentes funcionais do shell e shell de superfície irá conduzir o projeto de veículos de entrega de próxima geração. Para este fim, adotamos uma abordagem in silico-to-in-vitro e desenvolveu um sistema de nanopartículas bem definida para a entrega controlada de melitina. O objetivo deste trabalho foi o de fornecer um desenho racional baseada em nanopartículas para entrega veneno através de estudos computacionais e apoiar nossas conclusões teóricas com estudos biológicos físico-química e. Assim, seguindo o sínteses e físico-químicos de caracterização, uma série de experimentos seqüenciais foram realizados para estudar como a química nanoescala influencia a entrega de toxinas de veneno para a regressão do câncer e ajudar a fugir disintegrity sistêmica e nocividade celular (Fig 1).

(a) esquemática do protocolo administrativo para Lipobee e Polybee; (B) de ancoragem imagens iniciais do PS

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27 e sistemas de melitina que mostram como estruturas de melitina são ligados a polímeros anfifílicos simples e (c) que mostram a estrutura de encaixe de melitina e PC lecitina. PS

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27 e lecitina são representadas por linhas brancas com átomos de oxigênio explícitas mostrado em vermelho. O peptídeo melitina é mostrado em um estilo elo da cadeia verde com átomos de oxigênio descritos como vermelho e nitrogênio descrito como azul.

In silico

estudos revelaram a resposta maior estabilidade da melitina direção anfifílico polímeros de bloco, em comparação com as moléculas de lípidos. Estudo experimental confirmou a melhor estabilidade do sistema polimérico sobre o conjunto lipídica. Para introduzir estabilidade micelar, foi introduzido um conceito de núcleo rígido [9]. Estudos que explorem mudança no tamanho hidratado e inércia contra proteínas séricas revelou a maior estabilidade das partículas de núcleo rígido. As experiências de lixiviação de melitina na presença da concentração de soro revelou a mais elevada estabilidade de um sistema de melitina-polímero (Polybee) em comparação com um sistema de melitina-lípido (Lipobee). Um estudo em silício na interacção ADN-melitina foi realizada e verificou através de dados experimentais. Verificou-se que a melitina livre poderia trazer mudança significativa na ligação de hidrogénio inter-hélice para influenciar potencialmente mecanismos de crescimento celular. Melitina na sua forma protegida como Polybee e Lipobee estavam inativos. mudanças significativas no tamanho hidratado de Polybee e Lipobee mediante incubação com dodecil sulfato de sódio foi observada, mas não um pH mais baixo. Isto aponta para a interacção membrana aniónica como o factor responsável dentro do citoplasma como um mecanismo de libertação melitina plausível. cancro da mama células de um status do receptor de estrogênio diferentes foram usados ​​como modelo

in vitro

cânceres para estudos de inibição de crescimento. Independentemente da linha celular, Polybees foram encontrados para ser melhor formulações anti-câncer em comparação com Lipobee e controle melitina livre.

Resultados e Discussão

Para projetar um mais seguro, bem como sistema de entrega eficaz, que seguiu uma nanosystem núcleo rígido que podem potencialmente manter a sua integridade na circulação sanguínea após a administração sistémica [10a-c]. Ao nível da nanoescala, rígida núcleo micelar (RCM) sistemas podem ser estabilizados por anfifílico PS

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27 (ácido-poliestireno-b poliacrílico) (PRCM) ou por fosfolipídeos (lecitina PC) (LRCM) encapsulamento (Fig 1A). Prevemos que este sistema irá fornecer arquiteturas de modelo, uma vez que a maioria das plataformas nanomedicina são dominados por sistemas poliméricos lipídico e. Além disso, esta estratégia também pode ser estendido a uma série de peptídeos-toxinas de diferentes fontes naturais, químicas e tamanhos.

Para investigar as interações fundamentais no melittin- PS

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27 de polímero e melitina-lecitina, simulações de docking molecular foram realizados e analisados ​​(Fig 1B e 1C). Todas as moléculas foram minimizados (Sybyl-X 2.0) [11] antes de atracar com MOE 2.013,08. Para investigar as interações fundamentais no melittin- PS

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27 sistema de lípidos PC polímero e melitina-lecitina PAA, MOE-Dock [12] foi utilizado para encaixar a melitina minimizado tanto PS

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27 sistemas PC lípidos poliméricos e lecitina PAA. Os cinco melhores de ancoragem posa com maiores pontuações S (menor energia de ancoragem) foram retidos e listadas em forma de tabela. Sobreposições das cinco melhores de ancoragem coloca em ambos os sistemas são mostrados na figura 2. Figura 2, ele pode ser encontrado em que melittin- PS

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PAA estrutura de encaixe

27 polímero , os cinco poses de ancoragem estão em grande diversidade, o que resulta no grande diferença na pontuação de encaixe entre pose de 1 e representam 5 (14,5 kcal /mol). No entanto, em melitina-lecitina estrutura de encaixe PC lipídico, cinco poses de encaixe pode sobrepor muito melhor, o que resultou em uma pequena diferença de pontuação de encaixe entre pose1 e representam 5 (1 kcal /mol). As diferenças de conformação de poses de encaixe de melitina para PS

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27 polímero e PC lecitina lipídico foi causado pelas diferentes campos elétricos e campos estéricos para estes dois sistemas.

Super-imposição dos cinco melhores poses de encaixe de melitina com PC lecitina e PS

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27 polímero de: (a) poses de ancoragem de melitina para PS

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27 polímero; (B) de ancoragem coloca de melitina à lecitina PC. A melhor pose marcou está nos verdes ligadas cadeias com os seguintes anexos menores listados em ordem de acordo com sua pontuação, como indicado pela sua cor: Magenta, 2º; amarelo, 3; branco, 4, e ciano, 5ª.

Figura 1A mostra as estruturas de atracação de melhores poses de melitina para PS

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27 polímero (Figura 1B) e sistema lipidico lecitina PC (Fig 1C). Na Fig 1B, pode ver-se que o péptido melitina e permanece perto paralelos bem com a extremidade hidrófila e uma parte de secção hidrófoba do polímero. Os resíduos de ácidos acrílicos hidrofílicos do polímero formado interacções críticas de ligações de hidrogénio com os grupos amino e hidroxilo de resíduos de AA. Hidrofóbica porção fenilo perto do terminal hidrófilo do polímero formado interacções hidrofóbicas com cadeias laterais de resíduos de aa melitina. Gly1 para Ile17 encontram-se na extremidade hidrofílica ao passo que a Ser18 Gln26 encontram-se na extremidade hidrofóbica do polímero. Em pormenor, os grupos amino do esqueleto de Gly1, Gly3, Ala4, Val5, Leu6, Gly12, Ala15 e Ile17, o oxigénio tanto na cadeia lateral e de cadeia principal Thr11 formado interacções de ligações de hidrogénio com o oxigénio de ácido carboxílico do polímero. As cadeias laterais de Leu17, Trp19, Lys21, Gln26 Arg24 e formar interacções hidrofóbicas com fenilo e átomos de carbono da espinha dorsal do polímero. Para comparar as interacções-chave do encaixe posa com lecitina modelo PC-peptídeo, nós ancorado o peptídeo melitina ao PC lecitina lipídico (Fig 1C). Embora melitina foi encontrado para ser bem entrelaçada com o lípido, esta estrutura de acoplamento de péptido-lípido era muito desprendido. A distância entre as duas moléculas não estava perto o suficiente; portanto, não muitas interações de ligação de hidrogênio e interações hidrofóbicas existir como observado para o complexo peptídeo-polímero. As únicas interações identificados foram os grupos amino em Arg22 e Arg24 formando interações de ligação de hidrogênio com o oxigênio ceto e fosfono grupos na lecitina PC lipídico. As cadeias laterais de Ala4, Leu13 e Ile17 formado interações hidrofóbicas com o grupo alquilo na lipídico.

Para explorar ainda mais a sequência e tamanho dependência de peptídeos para portadores Polybee e Lipobee, que escolhemos vários fragmentos peptídicos melitina para computacional estudos de modelagem (S1 FIG). Foram selecionados (1) peptídeo direito de 17 resíduos, (2) deixou o péptido 9-resíduos, e (3) média de 16 resíduos de peptídeo para atracar ao PS

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27 polímero e sistema de lecitina de lípidos PC, respectivamente. Na estrutura de acoplamento de péptido de 17-resíduos de direita com PS

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27 polímero, os grupos amino do esqueleto de THR1, a cadeia lateral de Lys12, Arg13 e Arg15 , o grupo de oxigénio do carbonilo Lys12, Gln17 e a cadeia lateral do grupo hidroxilo de THR1, Thr2 e Ser10 formado interacções da ligação de hidrogénio com o oxigénio de ácido carboxílico do polímero. Na estrutura de ancoragem lípido lecitina PC, os grupos amino do esqueleto de Lys14 e cadeia lateral de Arg13, e a cadeia lateral do grupo hidroxilo de THR1 formado interacções de ligações de hidrogénio com o oxigénio em grupos fosfono em lecitina PC lípido. Na estrutura de encaixe de 9-resíduos deixados péptido com PS

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27 polímero, os grupos amino do esqueleto de Gly1, lie2, Ala4 e Leu9, o oxigénio de grupo carbonilo de Val8 formado interacções de ligações de hidrogénio com o oxigénio de ácido carboxílico do polímero. Na estrutura de ancoragem lípido lecitina PC, os grupos amino do esqueleto de Gly1, lie2 e o oxigénio do grupo carbonilo de lie2 formado interacções de ligações de hidrogénio com o oxigénio em grupos fosfono em lecitina PC lípido. Na estrutura de ancoragem do péptido de 16 resíduos de meio com PS

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27 polímero, os grupos amino do esqueleto de Thr5, Gly7, Lys16, a cadeia lateral de Trp14, o oxigénio do grupo carbonilo da cadeia lateral Gly7 e do grupo hidroxilo da Ser13 formado interacções de ligações de hidrogénio com o oxigénio de ácido carboxílico do polímero. Na estrutura de ancoragem lípido lecitina PC, os grupos amino do esqueleto de Leu1, Lys2, val3, Thr5 e a cadeia lateral do grupo hidroxilo de Thr5 formado interacções de ligações de hidrogénio com o oxigénio em grupos fosfono em lecitina PC lípido.

a análise de posturas de encaixe pode explicar claramente porque a estrutura do péptido-polímero é mais estável do que a estrutura do péptido-lípido (Tabela 1). Notamos que, pelo contrário, a análise poses de atracação e interações, a energia de acoplamento no sistema de PC lipídico lecitina é inferior PS

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27 sistema de polímero. Isso pode ser causado por diferenças na média entropia perda /ganho devido à flexibilidade e dessolvatação de energia conformacional de cada átomo, em vez do que a energia máxima de-bond H entre PS

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27 polímero e lecitina PC lípidos cujos tamanhos são muito diferentes. No PS

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27 sistema de polímero PAA, o ácido acrílico hidrofílico e relação de unidade de estireno hidrofóbica irá afectar a ligação de hidrogênio e interações hidrofóbicas entre os sistemas de melitina e polímero, enquanto a unidade comprimento não alterar essas interações muito. S2 A tabela mostra a pontuação dos resultados de encaixe de três fragmentos melitina para polybee e lipobee. Como é evidente, quanto mais as sequências de péptidos, o melhor Obtiveram-se as contagens de encaixe. pontuações de ancoragem foram melhores para peptídeo com PS

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27 polímero que com lethicin PC lipídico porque as interações dos títulos mais hidrogênio estão envolvidos em um PS

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27 sistema de polímero.

um método de inserção de um pote de pós-preparativa foi usado para aprisionamento estável de melitina e uma geração de lipidada melitina micelar núcleo rígido (Lipobees) a partir de micelas de núcleo rígido (LRCMs lipidadas). Da mesma forma, polimerizado rígida melitina núcleo micelar (Polybees) foram preparados a partir de micelas polimerizadas núcleo rígido (PRCMs). Uma preparação típica de LRCMs e PRCMs envolveu uma preparação de “núcleo rígido ‘de éter cetílico polyoxyethylene20 (PECE) seguido por revestimento estável com PC ou PS lecitina

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27 [ ,,,0],13]. A estabilidade das micelas foi obtida por cura do núcleo, a 4 ° C (PECE pf: 32 ° C). MCR, em seguida, foram submetidas a incubação pós-preparativa da melitina na suspensão aquosa durante 30 min à temperatura ambiente com agitação em vórtex suave. O diâmetro hidrodinâmico, morfologia, arranjos em camadas; topografia, potencial electroforético, e a estabilidade das partículas foram estabelecidas utilizando vários ensaios físico-químicos. Para descobrir o carregamento de melitina em LRCM e PRCM, foi realizada espectroscopia UV-absorção. Foi visto que a absorção de assinatura para melitina a 290 nm caiu no caso de Lipobee e Polybee, provavelmente devido à internalização superfície da melitina em LRCM e PRCM com a metodologia pós-interação.

O LRCM teve um tamanho médio de partícula de hidrodinâmico 23 ± 2 nm, que cresceu a 83 ± 3 nm de Lipobee principalmente devido à interacção com a superfície de melitina RCM (Figura 3). Da mesma forma, PRCM mostrou um diâmetro hidrodinâmico médio de 25 ± 5, que aumentou para 40 ± 8 nm de Polybee (Figura 3). Estabilidade destas partículas PRCM em vários pontos de tempo à temperatura ambiente e pH 7,4 foi medida usando medidas de DLS, que mostraram uma variação nominal no tamanho de PRCM e Polybee de menos do que 10%. Da mesma forma, o tamanho LRCM não mudar a qualquer nível significativo enquanto Lipobee mostrou alterações de tamanho de ~ 40%, enfatizando a instabilidade significativa de Lipobees comparar com a alta estabilidade da Polybee. Estabilidade de veículos transportadores sempre foi preocupação importante no sucesso de protocolos de nano-entrega. Assim, Polybee promete o provável melhor resposta de entrega melitina comparar com partículas Lipobee durante

in vitro

e

in vivo

usa. A densidade de carga de superfície para PRCMs era -12 ± 1 mV, que caiu para -6 ± 1 mV em Polybee após incubação com as toxinas de abelha

síntese e caracterização de micelas núcleo rígido e partículas melitina carregado:. ( a) Síntese de PRCM e nanopartículas Polybee; (B) imagens de TEM representativas de Polybee; (C) imagens de AFM representativas de Polybee; (D) Síntese de LRCM e Lipobee nanopartículas; (E) MET representativas de Lipobee; (C) imagens de AFM representativas de Lipobee; (F) A espectroscopia UV-vis de melitina, LRCM, PRCM, Lipobee e Polybee; (G) distribuição de diâmetro hidrodinâmico (número médio, nm). TEM amostras (20 ul) foram preparadas em grelhas de carbono revestidas com Formvar e coradas negativamente com acetato de uranilo e seco sob vácuo, antes de realizar a microscopia. Amostras (20 ul) foram gota fundido em folhas de mica clivada de fresco e seco ao ar durante 24 horas antes de realizar o modo de AFM tocando

Por outro lado, o potencial zeta de LRCMs mostrou uma variação nominal. potencial zeta, quando convertido para Lipobee. Isto significa a eficiência de Coulomb as interacções do peptídeo com a coroa exterior de polímeros em bloco compostos por resíduos (ácido acrílico) de poli. morfologia estado anidro das partículas Lipobee e Polybee foi obtido no tamanho 25 ± 5 nm em comparação com 22 ± 6 nm para LRCM e PRCM como estudado por microscopia eletrônica de transmissão (TEM, Fig 3F). As imagens representativas microscopia de força atômica (AFM) foram adquiridos a partir de amostras fundidas gota em folhas de mica para estudar o padrão de morfologia destas partículas RCM. valores de altura média (H

AV) de uma amostra representativa foram 25 ± 5 nm (Fig 3G). caracterizações físico-químicas do Polybees e Lipobees sugerem um potencial over-ponta para Polybees mais Lipobees em estabilidade da formulação e outros pré-requisitos para torná-los melhores agentes para aplicação sistémica (Tabela 2).

Para verificar o câncer afinidade de regressão de células destas formulações, foram realizados ensaios de citotoxicidade. Como um sistema modelo para

in vitro

positiva cultura câncer, escolhemos estrogênio (MCF-7) e de estrógeno negativo células de cancro da mama (MD-MB231) para avaliar o potencial terapêutico funcional do Polybees e Lipobees. linhas de células MCF-7 e MD-MB231 representam fase inicial e em linhas celulares de cancro da mama humano invasivos, respectivamente. Independentemente da linha de células, Polybee mostraram significativamente maior eficácia em comparação com Lipobee melitina e, como é evidente a partir dos ensaios de MTT (Fig 4). No ponto 48 h de incubação, em células MD-MB231, o valor de IC50 para Polybee foi encontrada em cerca de 40 ± 4 nM em comparação com ca. 70 ± 7 Nm em caso de Lipobee e ca. 110 ± 10 M para a melitina livre; Além disso, em células MCF-7, o valor de IC50 para Polybee foi encontrado para ser ca. 80 ± 8 nM, em comparação com ca. 100 ± 10 nM no caso de Lipobee e 105 ± 10 nM para melitina livre. Enquanto isso, LRCM e PRCM mostrou CI50 1000 nM, independentemente da linha de células, (figura 4G). Para as células tratadas com melitina livre (100 nM), a densidade do crescimento de células e alterações morfológicas eram indicativos de morte celular, enquanto que LRCM PRCM e não alterou a qualquer nível significativo (Figura 4).

imagens de campo claro representativos da densidade de crescimento celular e da variação da morfologia celular de cancro de células MCF-7 (AC) e MD-MB231 (DF), após 48 h de incubação tratados com a melitina, LRCM Lipobee e, (g) Os valores de IC50 para diversas formulações em forma tabular; análise bioestatística em valores de IC50 para Polybee relação a melitina representando *** de p valor 0,001 ** para p valor 0,005 após um way ANOVA com pós-teste de Bonferroni e (oi) variações de viabilidade celular% de formulação diferente no MD-MB231 e (jk) MCF 7-células para (hj) polimérico e (ik) formulações lipídicas.

os valores de CH50 para todas as formulações usadas foram encontradas para ser de 6 ± 1, para PRCM, LRCM, Polybee, Lipobee e a melitina e 8 ± 1 e 3 ± 1 para 1 de Referência e de referência 2, respectivamente (Fig 5A). Embora,

in vitro

experimentos estabelecidos Polybee e Lipobee como formulações anti-câncer potentes, o seu comportamento presumido para

in vivo para aplicativos ainda permanece incerto.

In vivo

sucesso de tais formulações dependem muito dois fatores principais i) neutralidade em direção complemento sangue e ii) Passaging sustentável da carga útil através da circulação sistêmica. Os nossos estudos computacionais são indicativos de mais forte, mais apertado interacção de melitina com as cadeias de polímeros anfifílicos em comparação directa com o lípido, tornando Polybees; portanto, melitina com o seu núcleo rígido e invólucro polimérico é um candidato melhor para

in vivo

aplicação. Para confirmar esta observação, experimentalmente, que exploraram a capacidade de sustentação activação do complemento e a melitina destas formulações no soro sanguíneo. Complementando este sistema, um grupo de proteínas irá activar para levar a lise de células alvo e facilitam a fagocitose por meio de opsonização sobre a exposição a materiais estranhos sólidos no líquido sistémica circulatório. O ensaio de CH50, que filtra a activação das vias complementares clássicos mostrou sensível à redução, ausência e /ou inactividade de qualquer componente da via. O ensaio CH50 complementar é baseado na lise de eritrócitos de ovelha sensibilizados na presença de Ca

2+ e Mg

2+. Quando eritrócitos de ovelha sensibilizados são incubadas com o soro de teste de diferentes tratamentos, os diferentes níveis de hemólise são alcançados. CH50 complementar ensaio de activação foi realizada para todas as formulações utilizadas aqui e verificou-se ser muito inerte na activação de proteínas complementares, sem alteração significativa nos valores de CH50 comparar a nível plasmático de complementar o normal (Referência 1, ou seja, 8 ± 1).

(a) Complementando ativação e (b) o comportamento melitina lixiviação de Lipobee e Polybees. melitina livre, LRCM e PRCM foram utilizados como controle; (C) As imagens de microscopia óptica de esfregaço de sangue não tratado (I) e tratou-se com melitina (01:10) (ii), LRCM (01:10) (iii), Lipobee (01:10) (IV), PRCM (1: 10) (v) e polybee (01:10) (VI), respectivamente, (com ampliação de 20x). Melittin- e Lipobee tratados sangue de porco no estado severamente agregada, morfologicamente distorcida são mostrados em (ii) e (iv). As inserções em (ii) e (iv) mostram a morfologia das células de sangue vermelho para enfatizar outros padrões morfológicos semelhantes em toda a amostra.

Os valores de CH50 para todas as formulações usadas foram encontradas para ser de 6 ± 1, para PRCM , LRCM, Polybee, Lipobee e a melitina e 8 ± 1 e 3 ± 1 para Referência 1 e 2 de referência, respectivamente. Ele indica que a formulação PRCM, LRCM, Polybee, Lipobee e melitina não induziu qualquer complemento para qualquer nível significativo. Ele suporta a viabilidade do uso destas formulações

in vivo

sem risco de induzir resposta imune.

Para avaliar ainda mais os benefícios do uso de Polybee sobre Lipobee para entrega sistémica, melitina lixiviação característica destas formulações foram avaliada e estimada através da realização de um ensaio MTT em células MD-MB231. melitina lixiviado obtido após incubação Polybee Lipobee e com soro fetal bovino a 10% (FBS) em tampão de DMEM foi utilizado nas diluições 1, 2, 4, 8 e 16 para ensaios MTT. Uma concentração conhecida melitina foi usada como um controlo positivo que varia 20-1,25 uM. ensaios MTT exibia uma elevada quantidade de lixiviação melitina de Lipobee causando uma elevada percentagem de mortes de células em cada uma das diluições em comparação com as células tratadas com lixiviação melitina de Polybee que dá um significado bio-estatística altamente significativa (p 0,001) com um factor de diluição 1. por outro lado, para a mesma diluição, melitina lixiviado para fora a partir Polybee, resultando num declínio significativo na morte população de células, sem qualquer alteração significativa da viabilidade celular (Fig 5B). Estes resultados indicaram que, durante a administração sistémica de Lipobee, uma quantidade elevada de melitina pode lixiviar no fluido circulatório antes de atingir as células cancerosas, causando assim uma perda significativa na eficiência anti-cancro.

Nanopartículas

Polybee também exibiram notáveis vigor quando misturado com sangue de porco. A preparação “esfregaço de sangue ‘foi feita para identificar eventuais variações morfológicas nos linfócitos e aglutinação do sangue monitorado por um (microscopia de luz convencional) técnica de microscopia óptica clínica sob um campo de alta potência (Fig 5C). Não se arrastando ou morfológicas vicissitudes superficiais em células do sangue foram observados no sangue de porco fresca tratada com PRCM, LRCM e Polybee (sangue: NP = 10: 1). No entanto, sangue de porco tratado com melitina gratuito e Lipobee exibiu aglomeração significativa e alterações morfológicas (Fig 5c, II e IV). Para entender o mecanismo plausível de liberação melitina de Lipobee e Polybee

in vitro

, foram realizados mais estudos. A libertação de agentes terapêuticos a partir das nanopartículas tem sido relatada como pH sensível e /ou interacção com a camada aniónico do compartimento endossomal em sistemas celulares. Estes factores podem investigar a capacidade de resposta das nanopartículas utilizadas para se chegar a um mecanismo de libertação provável. Nós usamos esta estratégia para diminuir a nossa selecção de vias preferenciais para liberação melitina de Lipobee e Polybee nanoformulações. Lipobee e Polybee foram preparados como discutido anteriormente, seguida por incubação a pH 4,6 e na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS, 1 mM) durante 2 h. No final do período de incubação, um diâmetro hidrodinâmico foi obtida para formulações diferentes, através da utilização de espalhamento de luz dinâmica. Tamanhos em 0 h foram consideradas como o controlo para as experiências (S2) Fig.

DLS resultados mostram claramente a variação no tamanho de Lipobee e Polybee apenas na presença de SDS (5 mM) sem qualquer efeito significativo a uma menor pH (Fig S2). Ele suporta a ocorrência plausível da interação aniônicos em um compartimento endossomal responsável pela libertação melitina de Polybee e Lipobee. Além disso, uma mudança maior em tamanho do Lipobee ocorreu após a incubação com SDS significando uma maior interação lipídio-surfactante.

interações Peptide-polinucleotídicas sempre atraíram o interesse de medicamentos químicos. É de especial interesse para decifrar as interações DNA melitina e compreender o seu papel na dissociação da estrutura secundária DNA. A electroforese em gel foi realizada para permitir a observação das mudanças nos padrões de mobilidade electroforética de pBR322 incubadas com várias formulações na presença (melitina, Polybee e Lipobee) e na ausência de melitina (LRCM e PRCM), bem como várias concentrações de melitina livre ( 50-,0005 uM).

Verificou-se que apenas melitina livre foi capaz de dissociar o DNA de plasmídeo. Por sua vez, a perda da banda de electroforese foi realizada quer por retardar a migração de DNA ou por expulsão do EtBr intercalada (brometo de etídio) devido ao sulco maior de ligação de melitina no duplex de ADN. Formulações com melitina protegidos em qualquer dos casos, Lipobee e Polybee, não influenciaram as bandas de DNA de forma significativa (S3A Fig).

A investigação adicional eletroforese em gel mostrou que ~ 0,05 mM melitina livre foi suficiente para iniciar a dissociação de uma estrutura secundária do ADN (Fig S3B). As interacções de melitina com ADN na forma livre significa que uma libertação de Lipobee Polybee e pode ter como alvo o ADN genómico, o que pode estender-se ao nível de dificultar o processo de transcrição. No entanto, nenhuma interação pode ocorrer se melitina é incorporado de forma estável. Aqui nenhum efeito significativo a partir LRCM e PRCM sobre a mobilidade DNA mostrou que essas partículas não têm um papel activo a desempenhar na interação DNA e melitina é o único componente em Polybee e Lipobee para participar de interação com duplex DNA.

as proteínas são os principais constituintes do soro sanguíneo e contra o veículo de carga e agentes pharmacoactive ao entregar através de circulações sistêmica. Qualquer obstrução no comportamento normal dessas proteínas do soro do sangue pode levar a consequências nocivas para o assunto. Como um sistema modelo de estudo, optou soro fetal bovino para estabelecer efeitos da melitina livre e seus nanoformulações, Lipobee e Polybees sobre propriedades normais espectroscópicas. estudo de absorção de UV foi realizada em melitina 50 mM incubadas (forma livre ou nanoformulation) solução FBS 10%. Nenhuma mudança hypso- ou batocrômico no padrão de absorção de UV foi observado a partir de solução FBS, mas absorção foi aumentado após a incubação com melitina livre. Uma diminuição na absorvância foi visto, no caso de Lipobee, que atingiu um nível semelhante ao de FBS não tratado quando comparado com Polybee (Fig S3C). Esta observação pode ser explicada devido à absorção adicional a partir de formulações adicionadas, significando nenhuma interação específica de melitina na forma livre ou nanoformulation com proteínas do soro.

O destino da melitina liberado pode ser racionalizado em relação à sua interação com genômico