Sumário

carcinomas provenientes de um microambiente complexo que consiste em múltiplas linhagens epiteliais distintas rodeado por uma variedade de tipos de células do estroma. Compreender etiologias câncer requer avaliar a relação entre os tipos de células durante o início da doença e através de progressão. camundongo geneticamente modificado (GEM) modelos de facilitar o exame prospectivo de eventos oncogênicos cedo, o que não é possível em seres humanos. Como a maioria dos tumores sólidos abrigar aberrações na rede RB, desenvolvemos uma abordagem GEM inducible para o estabelecimento e avaliação de iniciação carcinoma em uma variada gama de tecidos epiteliais e subtipos sobre inativação de supressão do tumor RB-mediada (RB-TS). O sistema permite a avaliação independente de subtipos epiteliais que expressam quer citoqueratinas (K) 18 ou 19. Com a expressão de Cre-dependente de uma proteína que dominantemente inactiva RB e proteínas p107 funcionalmente redundantes e p130, neoplasia poderia ser iniciada em qualquer K18 ou K19 células que expressam de numerosos tecidos. Pelo projeto, porque apenas uma única aberração via foi projetada, carcinomas desenvolvido estocasticamente somente após longa latência. Assim, este sistema, que permite a iniciação carcinoma de tipo específico de célula dirigida, facilita ainda mais a definição de eventos que pode progredir neoplasias para cânceres agressivos através de engenharia, evolução induzida por substância cancerígena e /ou espontânea

Citation:. Canção Y , Gilbert D, O’Sullivan TN, Yang C, Pan W, Fathalizadeh A, et al. (2013) Carcinoma Iniciação via Rb supressor de tumor Inactivação: Uma Abordagem versátil para epitelial subtipo-Dependent Cancer Iniciação em tecidos diversos. PLoS ONE 8 (12): e80459. doi: 10.1371 /journal.pone.0080459

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de julho de 2013; Aceito: 03 de outubro de 2013; Publicação: 02 de dezembro de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Cancer Institute, National Institutes of Health, nos termos do Contrato nº HHSN261200800001E, e em parte por doações RO1-CA046283 do NCI e PC040619 do Departamento de Defesa, e Fundação do cancro da próstata para TVD. YS foi suportado pela concessão formação de pós-doutorado (PC050306) do Departamento de Defesa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. O conteúdo desta publicação não reflecte necessariamente a posição nem as políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem a menção de nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implica o endosso pelo governo dos EUA

Competir interesses.: os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

cancros malignos evoluir através de mecanismos de crescimento selectivo, sobrevivência e propriedades invasivas em um microambiente diversificada. Assim, os cancros são heterogêneos, com um eleitorado complexa de vários tipos de células. camundongo geneticamente modificado (GEM) modelos oferecem uma abordagem poderosa para avaliar ambos os /as relações causa e efeito e tipo de célula susceptibilidade. Ao longo das últimas décadas, o progresso tem sido feito na identificação de aberrações moleculares que podem contribuir para tumorigênese, assim, oferecendo insights sobre os mecanismos causais potenciais e alvos terapêuticos. No entanto, uma vez que muitos eventos foram projetados juntos e muitas vezes não iniciar a doença, relativamente poucos estudos exploraram a etiologia da evolução do tumor desde o início até a progressão para doença avançada. Aqui, procurou-se desenvolver modelos “GEM câncer iniciador” que poderiam ser induzidas para iniciar tumorigênese em uma ampla variedade de tecidos epiteliais e em compartimentos subtipo distinto para posterior utilização na definição de mecanismos de tecidos e células específicas para a progressão do carcinoma.

subtipos de células de epitélio pode ser caracterizada por os perfis de expressão de citoqueratina especificamente emparelhado (k) [1] – [3]. As citoqueratinas são filamentos intermediários do citoesqueleto de proteínas reunidos a partir de subunidades heterodiméricas de tipo ácido I (K9-K28) e proteínas básicas do tipo II (K1-K8 e K71-K80) [4]. K18, geralmente emparelhados com K8, é o primeiro queratina expresso no estádio de oito células de desenvolvimento do rato [5], [6], seguido por K19 e K7 [7]. No entanto, K19, a menor queratina ácido conhecido, não tem qualquer tipo II parceiro queratina de base conhecida. Embora ambos K18 e K19 são expressos em epitélios simples, que são diferencialmente expressos em subtipos de alguns epitélios (por exemplo, em células K18 K19 guarda-chuva e em células basais e intermediários de urotélio [2], [3], [8]). Portanto, os padrões de expressão de queratina distintas pode ser utilizada como a base para a segmentação eventos de iniciação do tumor para os subtipos específicos epiteliais.

1 retinoblastoma (RB) é um regulador negativo de proliferação do ciclo de célula eucariótica, particularmente durante a diferenciação celular [ ,,,0],9], e a via de RB desempenha um papel crucial na tumorigénese. actividade da via de RB aberrantes, resultante de defeitos em si RB, CDKN2A, CCND1, ou CDK4, é observada em cancros humanos mais sólidos [10]. Nos poucos tipos de cancro, em que o tecido humano precoce é rotineiramente acessíveis, tais aberrações estão frequentemente presentes, sugerindo um papel na iniciação [11] – [15]. No entanto, em alguns casos, a primeira associação de aberração via RB é aparente no cancro mais avançado, argumentando um papel na progressão [16]. De fato, causa e efeito relacionamentos provável depender de múltiplas variáveis, incluindo a células e tecidos de origem eo fim estocástica de eventos causais, enfatizando a necessidade de sistemas de modelo para determinar papéis plausíveis em etiologia da doença. Por causa da redundância funcional entre RB e seus membros p107 familiares e p130 na maioria dos tipos de células de murino [17] – [20], usamos uma proteína de inactivação dominante, T

121, para inactivar supressão do tumor RB (RB-TS) no rato [21] – [25]. T

121 é derivado a partir do N-terminal de 121 aminoácidos de Vírus Símio 40 (SV40) antigénio T grande, que evoluíram para inactivar o travão do ciclo celular mediada por RB. Quando dirigida por promotores específicos de tecidos em ratinhos transgénicos, t

121 é suficiente para iniciar a tumorigénese na próstata [26], mamaria [27], do ovário [28] e do plexo coróide [29] células epiteliais, bem como no sistema nervoso central astrócitos do sistema [30], [31]. O fenótipo de iniciação é dependente do t

121 RB /p107 /p130 local de ligação, como demonstrado por mutagénese pontual [32]. Em cada caso examinado, até agora, a iniciação está associada à proliferação aberrante acompanhado por apoptose e progressão do tumor tem sido impulsionada pela engenharia e /ou aberração estocástica de redes moleculares associados ao câncer específicos [28], [31], [33].

Aqui, descrevemos linhagens de camundongos transgênicos em que RB-TS inativação pode ser induzida em qualquer K19 ou K18-expressam subtipos epiteliais de uma forma dependente da recombinase Cre. linhagens transgênicas foram estabelecidos em que a expressão Cre-condicional de T

121 foi conduzido sob cytokeratin18 ou 19 controlo da transcrição utilizando transgenes bacterianas cromossomo artificial (BAC) que mantêm os padrões de expressão endógenos em diversos tecidos. Assim, uma única estirpe para cada subtipo pode ser utilizado para dirigir a iniciação do cancro tecido, especificamente através de expressão de Cre específica de órgão após introdução da linha germinal ou somáticas de um

Cre

transgene. Por inactivação selectiva de RB-TS em K18- K19 ou células que expressam, que demonstram a ampla utilidade destes “cancro”-iniciador ratinhos em estudos sobre os mecanismos de desenvolvimento do cancro e para mostrar papéis RB-TS inactivação e especificidade de subtipo epitelial na iniciação neoplásica dentro de vários órgãos epiteliais.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi aprovado pelo Animal Care e Use Committee (ACUC) da UNC-Chapel Hill (Permit Number: 04-232,0), e do Instituto Nacional do Câncer (número de autorização: 11-030) (NCI) -Frederick. Todos os animais do estudo foram submetidos à eutanásia por as “Diretrizes para a eutanásia de camundongo e rato feto e no neonato”, conforme definido pelo ACUC da UNC-Chapel Hill e NCI-Frederick para minimizar a dor e sofrimento.

Geração de específicos do subtipo Mice queratina-dirigida BAC transgênicas

a floxed eGFP parar T

121 cassete (cassette transgene, Figura 1A) foi derivado da MFT

121 construção [34]. T

121 é composta por os primeiros 121 aminoácidos (aa), do antigénio T grande de SV40, seguido por 11 aminoácidos missense resultantes de uma eliminação de 31 bp. O transgene pode não expressar antigénio T pequeno devido a uma segunda deleção que elimina o local de splice aceitador [35]. T

121 inactiva RB e familiares p107 e p130 e não contém o domínio p53 e p300 inativação [36]. A biblioteca de DNA genómico RPCI-22 de ratinho foi pesquisada utilizando sondas específicas concebidas para K18 (Krt1-18 no cromossoma 15) e K19 (Krt1-19 no cromossoma 11), através do serviço de rastreio BAC RPCI (Roswell Park Cancer Institute, Nova Iorque). Os clones positivos foram utilizados para a inserção dirigida-recombineering [37], [38] de floxed eGFP-stop-T

121 cassetes no exão 1 códons de iniciação de K18 e K19. DNA de BAC foi purificado (MTR Scientific, Ijamsville, MD) e injectado em ovos fertilizados colhidas a partir de um cruzamento B6D2F1 (JAX Laboratory, Bar Harbor, Maine) a uma concentração de 4 ng /ul sem linearização como descrito [39]. Resultante e gerações subsequentes de ratinhos transgénicos foram identificados por amplificação por PCR de um fragmento de 215 pb utilizando os iniciadores 5 ‘GAATCTTTGCAGCTAATGGACC 3’ e 5 ‘GCATCCCAGAAGCTCCAAAG 3’ e do ADN genómico digit- ou derivados de orelha como molde. O perfil de ciclos foi: 94 ° C, 2 minutos; seguido por 35 ciclos de 94 ° C, 20 segundos; 62 ° C, 45 segundos; 72 ° C, 45 segundos; e uma incubação final de 72 ° C, 2 minutos. mouse linhas foram mantidas por meio de cruzamentos com ratos B6D2F1 tipo selvagem e, portanto, são designados como

B6; D2-Tg (K18GT

121) Tvd

(

TgK18GT

121

) e

B6; D2-Tg (K19GT

121) Tvd

(

TgK19GT

121

)

A.. cassete Transgene: Uma cassete parada eGFP foi flanqueada por locais loxP e a T

121 gene foi colocado a jusante. B. queratina bacteriana cromossoma artificial (BAC) construções de transgenes: uma cassete de transgene (A) foi inserido a montante do codão de iniciação ATG do exão 1 de K18 (. Derivado do cromossoma de rato (RHC) 15) e de K19 (derivada de rato Chr 11) em BACs usando recombineering. O local de inserção para o loxP-eGFP-stop-loxP-t

121 cassete é indicado por um tracejado “V”. genes representativos jusante dos genes de queratina são indicados em caixas. barras pretas a cheio indicam exões (E). C. Transgene número de cópias por genoma diplóide foi determinada por qPCR.

estratégias de melhoramento transgênicas

TgK18GT

121 Comprar e

TgK19GT

121

ratos foram cruzados com

β-actina Cre

ratos (FVB ou C57BL6 /fundo NCr), e

TgK19GT

121

a

K19CreER

ratos ( C57BL /6 fundo, fornecido pelo Dr. Guoqiang Gu na Universidade de Vanderbilt) [40] para determinar a capacidade de iniciação tumor em cima RB-TS inativação em K19 e K18 subtipos.

Transgene Copiar Número Determinação

ADN da cauda genómico foi extraído utilizando Qiagen DNeasy Blood and Tissue kit, e em tempo real quantitativo PCR foi utilizado para detectar números de cópias de transgene. As amplificações de PCR foram realizadas em placas de 96 poços no detector de sequências ABI 7500. 30 ul de amostras incluiu 10 ul (50 ng) da amostra de ADN genómico e 20 ul mistura de reacção de PCR. A amplificação foi de 10 minutos a 94 ° C, seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 94 ° C e 1 minuto a 60 ° C. Primers e sequências de sonda para T

121 genes foram: para a frente: 5 ‘CTT TGC AGC TAA TGG ACC TTC 3’, inverter: 5 ‘TGC CTT TCT CAT CAG AGG AAT 3’, e sonda: 5 ‘Fam TC CCC CAG GCA CTC CTT TCA AGA C Tamra 3 ‘. Os iniciadores de controlo gene beta-actina endógenos foram: para a frente: 5 ‘CTG CCT GAC GGC CAG GTC 3’, inverter: 5 ‘CAA GAA GGA AGG CTG GAA AAG A 3’, e sonda: 5 ‘Fam CA CTA TTG GCA ACG AGC GGT TCC G Tamra 3 ‘. diferenças relativas de números de cópias do transgene foram calculados usando um método dCt padrão com uma quantidade conhecida de plasmídeo controle.

Histopatologia e imunodetecção

tecidos transgénicos foram dissecados em idades indicadas e fixo durante a noite em 10% neutra formalina tamponada, transferidos para etanol a 70%, rotineiramente processadas e embebidas em parafina. Os tecidos foram seccionados por 10 camadas sucessivas a 5 uM, excepto intervalos tecidos linfóides (4 uM) e corados com hematoxilina e eosina (H E) para exame histopatológico. A imuno-histoquímica (IHQ) e imunofluorescência (IF) As análises foram realizadas em secções embebidas em parafina fixadas com formalina, como anteriormente descrito [26]. Os anticorpos incluíram: anti-K8 /18 (1:500, policlonal de porquinho da índia, GP11, Progen Biotechnik, GmbH, Heidelberg, Alemanha), anti-K19 (1:200, monoclonal de coelho, Epitomics, CA), anti-K14 (1 :1000, policlonal de coelho, pRB-155P, Covance), anti-GFP (1:500, b-2, monoclonais de rato, Santa Cruz), antigénio T de SV40 anti-(1:100, monoclonal de ratinho, DP02-200UG, Calbiochem ), e anti-Ki-67 (1:500, policlonal de coelho, 06-570, BD Pharmingen, San Diego, CA). Para se a coloração dupla, o primeiro anticorpo primário (anti-EGFP ou antigénio T anti-SV40) foi incubada durante a noite seguido pelo segundo anticorpo primário (anti-K19, anti-K14, ou anti-K18) incubação durante 2 horas à temperatura ambiente . Mixed Alexa Fluor 488 e 594 (1:200 diluição, Life Technologies) serviu como anticorpos secundários. As imagens foram capturadas usando microscópios de luz, de imunofluorescência, ou Zeiss confocal. níveis de apoptose foram detectados nas secções utilizando o ensaio de dUTP-biotina mediada por desoxinucleotidiltransferase terminal de rotulagem final Nick (TUNEL) (ApopTag peroxidase

In Situ

Apoptosis Detection Kit, S7100 Millipore), seguindo as instruções do fabricante [26]. Para quantificar as células positivas Ki-67, 5-10 campos aleatórios Ki-67-positivas com a mesma ampliação foram adquiridos utilizando um microscópio Zeiss e Ki-67 de células positivas e negativas foram contadas manualmente. Positividade foi calculado como o percentual médio do total de células.

Análises Estatísticas

testes de Mann-Whitney t de Student ou foram realizados para avaliar a significância estatística entre os genótipos e tecidos. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Transgene Expression reflete com precisão epitelial subtipo Especificidade

Para direcionar RB-TS inativação aos subtipos epiteliais, foram empregados regulação queratina dentro de BACs. para dirigir a expressão do transgene condicional. Um Cre-condicional loxP-eGFP-stop-loxP (LSV) t

121 cassete (Figura 1A) foi introduzida no primeiro exão de tanto o K18 ou o gene K19 dentro das respectivas BACs para gerar

TgK18GT

121 Comprar e

TgK19GT

121

ratinhos transgénicos (Figura 1B). Assim, eGFP foi expresso sob K18 ou K19 regulação até a expressão /ativação de Cre, que mediada

eGFP

exclusão e induzida T

121 expressão. Duas linhas fundadoras de transmissão para cada construção foram gerados e caracterizados. Como avaliado pela quantitativa PCR em tempo real, os ratos abrigava uma cópia do transgene em linhas

TgK19GT

121-34

e

-43,

e

TgK18GT

121-36

, e 3 cópias do transgene em linha

TgK18GT

121-34

(Figura 1C).

para detectar K19 endógena e expressão K18, e, portanto, os padrões de regulação transgene preciso, tecidos epiteliais tipo selvagem foram examinadas por IHC ou IF. Consistente com os resultados descritos [2], [3], [8], ambos K19 e K18 foram amplamente expresso numa variedade de tecidos epiteliais do rato (Figura S1 e S1 Tabela).

TgK18GT

121

e

121

eGFP expressão do transgene

TgK19GT foi visualizado em tecidos inteiros, utilizando um microscópio de fluorescência estéreo (Discovery.V20 SteREO, Carl Zeiss Meditec, Inc). fluorescência verde forte foi observada em alguns tecidos de ambas as linhas de

TgK19GT

121

ratos (por exemplo, intestino, estômago, bexiga urinária, e da vesícula biliar), mas fraca ou nenhuma fluorescência verde em outros (por exemplo, glândula mamária, ovário e pâncreas, figura S2). Muitos tecidos mostraram forte fluorescência verde em ambas as linhas de

TgK18GT

121

ratos (por exemplo, intestino, estômago, timo, glândula mamária, ovário, glândula salivar, bexiga urinária e canais deferentes, epidídimo, e da vesícula biliar), mas não no pâncreas, pulmão, fígado e (Figura S3). Em

TgK19GT

121

ratos, imunocoramento secções de tecido mostraram consistentemente forte expressão e generalizada eGFP no intestino, estômago, bexiga, vesícula biliar, e da pelve renal epitélio. Prontamente coloração detectável foi limitada a uma percentagem menor de células no pulmão, glândula mamária e próstata (Figura S4 e Tabela S1). Outros tecidos tinha muito fraca ou nenhuma expressão eGFP detectável (Tabela S1). Em

TgK18GT

121

camundongos, a expressão eGFP foi generalizada na maioria dos tecidos epiteliais K18-positivos (Figura S5 e Tabela S1). Importante, baseado em dupla IF, eGFP foi co-expressa com respectivos queratinas endógenos em

TgK19GT

121

(Figura S4) e

TgK18GT

121

ratinhos (Figura S5), mas excluídas K14 células (Figura S6). No entanto, nem todas as células K19 ou K18 positivos expressos eGFP. Ambas as linhas de

TgK19GT

121

ratos mostraram expressão eGFP similar. Os tecidos de

TgK18GT

121-34

ratos mostraram coloração eGFP mais intensa em comparação com aqueles de

TgK18GT

121-36

ratos (dados não mostrados), possivelmente devido à maior número de cópias do transgene na linha 34 (Figura 1C).

RB-TS inactivação é induzido em subtipos específicos do epitélio

Para determinar se T

121 expressão pode ser induzida em uma ampla gama de tecidos epiteliais com especificidade subtipo e para avaliar o efeito do RB-TS inativação, atravessamos camundongos transgênicos hemizygous de todas as linhas para transgénicas

β-actina Cre

camundongos homozigotos. Provavelmente devido à ampla inactivação RB-TS em K19 expressando células embrionárias (veja abaixo), foi observada alguma letalidade embrionária em

TgK19GT

121; β-actina Cre

ratinhos. ratinhos bi-transgénicos nascidos vivos eram relativamente aos controlos da mesma ninhada (34% vs. 66% sub-representados para

TgK19GT

121-34

, 45% vs. 55% para

TgK19GT

121-43

, respectivamente; Tabela S2), o que sugere que a função de RB em células K19 podem ser críticos para o desenvolvimento. Nos ratinhos que sobreviveram, consistente com a amplitude da expressão K19 endógena (Figura S1), T

121 expressão foi prontamente observada numa variedade de tecidos avaliada em primeiro lugar com 2 meses de idade (Figura 2), embora a expressão eGFP tinha sido baixa ou abaixo do nível de detecção de IHC em alguns destes tecidos (por exemplo, ovário, glândula mamaria e do pâncreas, Figuras S2 e S4, e Tabela S1). É importante notar, como EGFP foi expresso fielmente em células K19, t

121 foi também expresso em células K19-positiva (não mostrados), mas excluído a partir de células K14 (Figura S6). T

121 níveis de expressão foram comparáveis ​​entre

TgK19GT

121-34; β-actina Cre

e

TgK19GT

121-43; β-actina Cre

ratos (não mostrados).

coloração marrom forte indica positiva

121 expressão T.

Ao contrário do

TgK19GT

121 ; β-actina Cre

ratos, ambas as linhas de

TgK18GT

121; β-actina Cre

ratinhos desenvolveram com frequências mendelianas normais (não mostrado). T

121 foi amplamente expressa em K18 expressar epitélio de alguns tecidos de 2 meses de idade

TgK18GT

121; β-actina Cre

ratinhos (por exemplo, timo, glândula mamaria, e ovário), mas não mostrou indução limitada em outras, ainda que nas células apropriadas (por exemplo, do intestino, da próstata e o pâncreas; Figura 3), apesar de expressão eGFP estiveram mais generalizada em alguns casos (Figuras S3 e S5, e Tabela S1). Importante, t

121 foi expressa em células positivas K18 (Figura 3B), mas excluído a partir de células K14 (Figura S6). A intensidade da T

121 expressão foi comparável entre

TgK18GT

121-34; β-actina Cre

e

TgK18GT

121-36; β-actina Cre

linhas (não mostradas) apesar de expressão EGFP foi maior em

TgK18GT

121-34

que

TgK18GT

121-36

ratinhos (não mostrado) . Esta observação pode refletir somática redução do número de cópias Cre-mediada de um conjunto de genes de tandem.

A. T

121 expressão de IHC. Setas pretas indicam

121 células T positivas. Barra de escala = 50 uM. B. Duplo imunofluorescência coloração de T

121 como K18 verde e endógena como o vermelho em tecidos mostrados como imagens confocal mescladas. setas brancas indicam células epiteliais do intestino positivos tanto para K18 endógeno e T

121. . Barra de escala = 25 mM

RB-TS Inactivação Causas Neoplasia

Em comparação com ratinhos de tipo selvagem (Figura S7A), todos os

TgK19GT

121-43; β-actina Cre

ratinhos desenvolveram lesões hiperplásicas multifocais na maioria dos tecidos epiteliais positivas K19 [por exemplo, pâncreas (epitélio pancreático ductal), glândula mamária, (células epiteliais da superfície do ovário, OSECs) ovário, bronquíolos do pulmão, dúctulo bílis do fígado, da vesícula biliar, do rim (pelve renal células epiteliais), bexiga urinária, próstata, intestino delgado, cólon, estômago foveolar glandular células; A Figura 4 e a Tabela 1]. Este fenótipo foi concomitante com altas taxas de proliferação nas células afetadas (Figuras 5 e 6) em comparação com os tecidos de tipo selvagem (Figuras 6 e S8). Tal como em relatórios anteriores de tecidos limitados [26], [27], [30], o aumento da proliferação em tecidos de

TgK19GT

121; β-actina Cre

ratinhos foi acompanhado por um aumento significativo da apoptose (Figura S9) em comparação com ratinhos de tipo selvagem que de (Figura S10). Estes resultados indicam que RB é importante para a supressão de hiperplasia de células positivas K19. Alguns

TgK19GT

121; β-actina Cre

ratos desenvolvidos hidronefrose bilateral ou unilateral com risco de vida começando tão cedo quanto 2 meses de idade (Figura S11A). A hidronefrose foi interpretada como secundária à hiperplasia marcada do epitélio de células de transição na junção da pelve renal e ureter, resultando em obstrução da saída de urina do rim (Figura S11A). Outros ratos de linha 34 tinha que ser sacrificados devido à timos aumentados, o que levou a risco de vida pressão torácica, aos 7 meses de idade (Figura S11B)

A hiperplasia foi observada na maioria dos tecidos (pulmão e cólon.: indicado pelas setas pretas). hiperplasia ductal multifocal foi observada no pâncreas, bem como neoplasia intra-epitelial da próstata do rato (mPIN) na próstata, e hidronefrose como indicado pelas setas brancas no rim. Todas as amostras foram coradas com H . E

A proliferação foi avaliada por Ki-67 IHC (marrom) em tecidos de ratos de 2 meses de idade. As setas indicam células epiteliais da superfície do ovário (OSECs) positivos para Ki-67. Barra de escala = 50? M.

taxas de proliferação de pâncreas, glândula mamária, ovário, próstata (lobo dorsolateral), e da bexiga foram quantificados em cortes de tecidos corados com Ki-67. * Significativamente diferente do controlo WT (p 0,001); #significantly diferentes entre

TgK19GT

121; β-actina Cre e TgK18GT

121; β-actina Cre

(p = 0,007); @ Significativamente diferente entre

TgK18GT

121; β-actina Cre Comprar e WT (p = 0,043)

Similar ao

TgK19GT

121.; β-actina Cre

ratinhos, inactivação de RB-TS em células K18-positivos predominantemente levaram a hiperplasia (Figura 7 e Tabela 1), que se correlaciona com a t

121 expressão nestes tecidos (Figura 3). Com ampla indução pela

β-actina Cre

alelo, tanto

TgK18GT

121-34

e

TgK18GT

121-36

ratinhos desenvolveram epiteliais do timo grave hiperplasia e subsequente hiperplasia linfóide (Tabela 1 e Figura 7). Imunocoloração indicaram alta

121 expressão T em K18 cortical epitélio do timo (Figura S12B) associada à alta proliferação (baseado no Ki-67 IHC) e as taxas de apoptose (TUNEL) (Figura S12C). Porque estes ratos foram comprometidas devido à pressão torácica risco de vida a partir timos ampliada (Figura S12A) e requereu eutanásia por 6 meses de idade,

TgK18GT

121; β-actina Cre

fenótipos em outros tecidos não poderia ser examinado por esta idade. Em 1-6 meses de idade, hiperplasia focal ligeira foi observado na glândula mamaria, o epitélio de superfície do ovário, intestino, e da próstata (Figura 7 e Tabela 1), o que se correlacionou com a taxa de proliferação e aumento da apoptose elevadas (Figuras 6, 8 e S13 ). Para a maior parte, quando comparado com o

TgK19GT

121; β-actina Cre

ratos, o grau de hiperplasia foi menos generalizada no

TgK18GT

121; β-actina Cre

ratos, que se correlacionou com a extensão limitada de T

121 expressão nestes tecidos. Elevadas taxas de proliferação foram observadas em ambos K19 e K18 positivo epitélio mamário e epitélios superfície do ovário (38,6% vs 49,2% em mamaria, e 51,2% vs 34,2% em células de ovário, respectivamente, Figura 6), o que pode ser explicado pela co- expressão de K19 e K18 nestes tecidos (Figura S1). No entanto, este não é o caso para outros sítios de co-expressão (por exemplo, da próstata, a Figura 6), sugerindo que o tecido-especificidade pode desempenhar um papel na eficiência de recombinação Cre.

A hiperplasia foi observada em alguns tecidos (ovário e próstata: indicados por setas). Todos os ratos foram sacrificados aos 1-7 meses de idade, devido à pressão torácica risco de vida causado por timos alargada. Todas as amostras foram coradas com H . E

A proliferação foi avaliada como na Figura 5 em ratos 2 meses de idade. Foram observados níveis semelhantes de proliferação no intestino delgado, cólon, estômago e ovário folículo como a de ratinhos de tipo selvagem mostrada na Figura S8. Setas pretas indicam Ki-67 células positivas. Barra de escala = 50? M.

Inactivação de RB-TS em Adulto restritas K19 + células é suficiente para Tumor Initiation

Para contornar os defeitos de desenvolvimento observados em

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121; β-actina Cre

ratos e demonstrar a utilidade destes modelos para o estudo do desenvolvimento de câncer em órgãos adultos, atravessamos

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121-34

ao tamoxifeno induzível

K19CreER

ratos [40]. Em contraste com a

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121; β-actina Cre

ratos,

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121; K19CreER

camundongos nasceram com frequências mendeliana esperados (não mostrado), apoiando ainda mais o papel crítico da RB-TS em células positivas K19 durante o desenvolvimento do mouse . Os ratinhos foram induzidas com tamoxifeno em 6-8 semanas de idade, e T

121 expressão foi avaliada por IHC. T

121 foi primeiro prontamente detectável na vesícula biliar em 2 semanas após a indução (não representado) e foi generalizada em vários tecidos por 4-6 semanas após a indução (Figura S14A). Além disso, T

121 foi co-expressa com K19 (Figura S14B). Consistente com a expressão de GFP antes da expressão de Cre, e, típico da expressão do transgene, t

121 foi expressa num subconjunto de células positivas K19 dentro de um determinado tecido.

Para determinar se RB-TS inactivação predisposto adulto K19-expressando células epiteliais para tumorigênese, induzida pelo tamoxifeno

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121; K19CreER

ratos eram idosos. Consistente com o fenótipo hiperplásico geral observada em

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121; β-actina Cre

ratos, foi observada uma alta freqüência de hiperplasia atípica na maioria dos tecidos epiteliais (por exemplo, estômago epitélio glandular 85,7% nos homens e 90% nas mulheres, e bronquíolos do pulmão epitélio 92,9% nos homens e 90% nas mulheres; tabela 2), consistente com o aumento das taxas de proliferação (não mostrado). Enquanto uma baixa frequência de neoplasia maligna que ocorre em alguns tecidos (por exemplo, adenocarcinoma do estômago 13,3% em homens e 14,3% nas mulheres; Tabela 3 e Figura 9), lesões de baixo grau presente na maioria dos órgãos indicou que RB-TS inactivação foi suficiente para iniciar mas não para o progresso da doença. Isto é consistente com os nossos resultados anteriores em mamaria [27], da próstata [26], plexo coróide [29] e do epitélio do ovário [28], e astrócitos cerebrais [30], [31]. Similar ao

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121; β-actina Cre

ratos, hidronefrose renal também foi observada em 75% dos homens e 40% das fêmeas de induzida

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121; K19CreER

ratinhos com 9-16 meses após a indução (Tabela 2 ). No entanto, ao contrário de

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121; β-actina Cre

ratinhos, a causa de morte foi a obstrução da bexiga devido à elevada expressão de K19 nas células intermédias e basal do epitélio da bexiga (Figura S7B) e uma elevada frequência de desenvolvimento de adenomas na bexiga (Tabela 3 e Figura 9 ). Curiosamente, foi observada início mais precoce do adenoma da bexiga urinária em machos comparado com fêmeas (9 meses versus 14 meses após a indução; Tabela 3). O mecanismo subjacente é desconhecida.

adenoma Bexiga urinária, adenoma de pulmão, adenocarcinoma do estômago, carcinoma renal, e gut neoplasia intra-epitelial (GIN), e lesões mPIN na próstata são mostrados em ampliações baixas e altas. Suave hiperplasia do ducto pancreático foi observada no pâncreas como indicado pelas setas. Todas as amostras foram coradas com H . E

Discussão

Estudos utilizando gene específico do tecido alvo em modelos de ratos geneticamente modificados contribuíram amplamente para a nossa compreensão complexidade câncer e a base molecular e celular da tumorigênese. Aqui nós descrevemos a geração de modelos de ratos transgénicos (

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121 Comprar e

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121

) usando genes de queratina reguladores de transcrição para conduzir a inactivação específica do subtipo epitelial condicional de RB- TS. Alta fidelidade de seus respectivos padrões de expressão específicos de queratina foi conseguida utilizando transgenes BAC, que também foram projetados para avaliar os tecidos de interesse através de expressão repórter GFP. Nós demonstramos que estes modelos podem ser utilizados em combinação com controladores de Cre específicos para iniciar a tumorigénese em uma ampla gama de tecidos epiteliais em qualquer K19 ou K18 que expressam subtipos. Demonstramos ainda que a inactivação RB-TS pode realmente provocar celular lesões pré-cancerígenas de forma autónoma em todos os tecidos epiteliais testados, incluindo após indução estritamente de órgãos adultos, e que neoplasia precoce é uniformemente associado à proliferação aberrante e apoptose.

usando direccionamento específicos de subtipo, uma ampla gama de K18 ou K19 subtipos positivas dentro dos tecidos epiteliais foram susceptíveis à indução neoplásica por RB-TS inactivação. Nem

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121; β-actina Cre

ratos (até 6 meses), nem

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121; β-actina Cre

ratos (até 8 meses) desenvolvidos adenomas ou carcinomas. Estes resultados confirmam que a RB-TS inactivação em epitélios afectados só inicia um fenótipo neoplásico. Com base em estudos anteriores de progressão do tumor em T

células 121-iniciadas, esperamos que as lesões adicionais em genes de câncer específicos será necessária para conduzir este fenótipo neoplásico precoce para os respectivos tipos de câncer.