Abstract

O DNA humano polimerase iota (ι pol) possui elevados recursos de replicação de DNA propensas a erros e executa DNA translesão síntese. Pode ser especializado e estritamente regulado em células de mamífero normais. A desregulação da ι POL podem contribuir para a aquisição de um fenótipo mutante. No entanto, existem poucos relatos que descrevem o mecanismo de regulação da transcrição de ι pol, e há controvérsia sobre seu papel na carcinogênese. Neste estudo, foi realizado o experimento exclusão e ponto de mutação, a EMSA, Chip, a interferência de RNA e ensaio Western blot para provar que c-Jun ativado por cinase c-Jun N-terminal (JNK) regula a transcrição de ι pol em condições normais e células cancerosas. proteína grupo xeroderma pigmentoso C (XPC) e ataxia-telangiectasia mutada proteína relacionada (ATR) promover a activação da JNK precoce em resposta a danos no ADN e, consequentemente, aumentar a expressão de ι Pol, indicando que o novo papel de via de sinal JNK está envolvida em danos no ADN resposta. Além disso, associada com elevada actividade de c-Jun, a sobre-expressão de ι Pol é positivamente correlacionada com o grau do tumor em 97 amostras clínicas de cancro da bexiga, e pode contribuir para o hypermutagenesis. A pol mutagênese envolveu-ι overexpressed é dependente de JNK /c-Jun via em células de câncer de bexiga identificação pelos espectros especial mutação. Os resultados suportam a conclusão de que a desregulação da ι pol por JNK /c-Jun está envolvido na carcinogênese e oferecer um novo entendimento do papel de ι pol ou c-Jun em mutagênese

Citation:. Yuan F, Xu Z, Yang H, Q Wei, Zhang Y, Yu J, et al. (2013) overexpressed DNA polimerase Iota Regulado por JNK /c-Jun Contribui para Hypermutagenesis no cancro de bexiga. PLoS ONE 8 (7): e69317. doi: 10.1371 /journal.pone.0069317

editor: Spencer B. Gibson, da Universidade de Manitoba, Canadá |

Recebido: 07 de março de 2013; Aceito: 12 de junho de 2013; Publicação: 26 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yuan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Nature Science Foundation da China (30770460) e do Exército Nature Science Foundation da China (06H026). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as células utilizam vias de reparação de DNA para corrigir eficazmente os efeitos deletérios de danos no DNA. No entanto, em alguns casos, nem todos os danos podem ser reparados prontamente e availably, que induz a paragem do ciclo celular. Para superar este bloqueio para continuar a síntese da cadeia de ADN em crescimento, as células empregar os mecanismos moleculares que permitem a síntese de ADN translesão (TLS) para ocorrer [1], [2]. TLS é realizada por polimerases especializadas de DNA, incluindo polimerases de DNA Y-familiares (pol ι, pol κ, r | pol e Rev1), que normalmente apresentam altas taxas de erro durante a síntese de DNA. Tem sido demonstrado que a pol ι tem a menor fidelidade no processo de TLS através de muitos tipos de lesões de DNA

in vitro

e pol ι também pode replicar DNA danificado com baixa fidelidade [3].

Como medida em que as características de replicação de ADN propensa a erro de ι Pol, desregulação da ι POL podem contribuir para a aquisição do fenótipo mutante que, juntamente com o controlo ou outros defeitos do ciclo celular genoma vias de estabilidade, pode facilitar a acelerar a progressão do tumor. Nós anteriormente descoberto pela primeira vez que as células de cancro da mama sobre-expressam a proteína ι Pol, o que leva a hypermutagenesis induzida por UV [4]. ι POL também está envolvido na mutagénese induzida por UV em linhas celulares de linfoma de Burkitt e XPV [5], [6]. Além disso, pol ι era prejudicial para ser encontrada sobre-expressa numa variedade de tecidos de tumor primárias, incluindo próstata, útero, estômago e cancros rectais, mas há uma falta de evidência clínica valiosa [7]. No entanto, o papel de ι pol na carcinogênese ainda é obscura e sob debatendo [8] e poucos relatos estão preocupados com o mecanismo de regulação de ι pol ou o potencial mecanismo de desregulação do ι pol no câncer. Portanto, é importante para tornar os nossos esforços para esclarecer o mecanismo de regulação e para determinar o papel carcinogênese de pol ι

in vivo

.

A via de sinalização de destaque ativados em resposta ao estresse celular é a proteína quinase activada por mitogénio (MAPK). Três principais vias de MAPK foram descritas: a extracelular quinase regulada por sinal (ERK), cinase de c-Jun N-terminal (JNK) e vias de MAPK p38. Alvos de JNK via incluem a proteína activadora 1 (AP-1) grupo de factores de transcrição, tais como o Jun e Fos membros da família ATF [9]. No entanto, c-Jun por JNK especificamente fosforilada desempenha um papel central em diversas funções de complexo AP-1 [10]. JNK pode ser activado por sinais de estresse celular resultantes de citocinas inflamatórias e agentes de dano de ADN, enquanto que o AP-1 pode ter impacto na resposta a danos no ADN celular através da regulação da expressão de vários genes relevantes para os mecanismos de resposta a danos no ADN [11], [12], [13]. Ex evidências também mostrou que c-Jun contribui para a transformação e o desenvolvimento do tumor e é classificado como um proto-oncogene [14]. activação de JNK foi demonstrada como um requisito para o desenvolvimento de vários cancros [15], [16], [17]. No entanto, nenhum estudo foi ainda relatado que elucida o papel de JNK /c-Jun em via TLS e ADN hypermutagenesis induzida por danos. Além disso, a maioria dos relatos que descrevem a sinalização de JNK ativação da via seguinte danos no DNA têm-se centrado sobre a activação JNK relacionados com o receptor de membrana. A maneira pela qual os mecanismos relacionados com o DNA danos resposta contribui para a activação de JNK no núcleo está claro.

Nossos estudos fornecem a evidência de que JNK /c-Jun via desempenha um papel regulador da transcrição crucial de ι pol. Os dados também fornecem uma visão romance que JNK /c-Jun via está envolvida em TLS e hypermutagenesis. Determinou-se que a JNK /c-Jun de vias pode ser activado por proteínas principais de danos no DNA, XPC e ATR. Além disso, foi encontrado sobre-expressão de pol ι estar relacionado com a extensão da fosforilação de c-Jun em tecidos de cancro da bexiga e ser associada com a progressão e hypermutagenesis identificados pelos espectros especial mutação cancro. Sugere-se que ι POL desregulada por JNK /c-Jun pode funcionar como um modificador. Portanto, DNA polimerase iota pode ser um indicador de potencial e alvo para tratamento antineoplásico em tumor maligno.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

A pesquisa foi aprovada pela ética bordo do Hospital Southwest na Terceira Universidade médica Militar (KY201016) e todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito.

cultura celular e tratamento

T24, RT4 células de carcinoma da bexiga e células HEK293 foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA). As células foram mantidas em meio RPMI 1640, 5A de McCoy ou meio DMEM suplementado com FBS a 10% e uma mistura de antibióticos, respectivamente. Os inibidores de JNK (SP600125), p38 (SB203580) e ERK1 /2 (PD98059) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) foram utilizados para o tratamento das células durante 2 horas. A exposição de células e plasmídeos para a luz UV (254 nm) foi obtido com um agente de reticulação ultravioleta CL-1000.

amostras clínicas e imuno-histoquímica

amostras de tecido de carcinoma urotelial foram obtidos a partir de 97 pacientes pelo transuretral ressecção do tumor da bexiga e cistectomia radical no Hospital Southwest. Todas as amostras foram coletadas entre 2008 e 2010. Estes tecidos foram atribuídos graus patológicos do carcinoma urotelial I, II ou III de acordo com a classificação da OMS (1973). As, secções de tecido embebidas em parafina fixadas com formalina foram desparafinizadas, re-hidratadas em álcoois graduados série, e processados ​​utilizando o método da imunoperoxidase estreptavidina. Um anticorpo anti-POL ι (LS-B296; Longevidade Biosciences, Seattle, WA, EUA) e um anticorpo anti-PC-Jun; foram utilizados (SC-822 Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) com diluições de 1:200 e 1:100, respectivamente. Os níveis de expressão de proteína foram quantificadas e teve avaliando a intensidade do sinal de anticorpo e calculando a percentagem de células coradas positivamente carcinoma urotelial [18]. Cinco campos aleatórios de vista foram escolhidos, e 100 células por campo foram analisados. O escore foi realizado cego sem dados clínicos. A pontuação foi catalogado como um score (percentagem de células coradas positivamente 25%), 2 pontuação (25-50%), 3 pontuação (50-75%) e 4 pontuação ( 75%), respectivamente. Enquanto isso, o sinal de mancha foi classificada como fraca (1 score), moderada (2 score) e forte (3 score), respectivamente. A pontuação percentual multiplicando a pontuação sinal foi a pontuação final. A pontuação final foi definido nível baixo ( 6 score) e nível intenso ( 8 score).

ensaio Western blot

Igualdade de proporções de cada células lisado foram analisadas por SDS-PAGE [19]. Os anticorpos foram continha antipol ι (ab1324; Abcam, Inc., Cambridge, UK), anti-XPC (ab6264; Abcam), anti-ATR (SC-1887; Santa Cruz), anti-c-Jun (SC- 44X; Santa Cruz), anti-PC-Jun (SC-822; Santa Cruz), anti-P-MKK4 (BS4168; Bioworld, St. Louis Park, MN, EUA), anti-P-MKK7 (4171; Cell Signaling tecnologia, Boston, MA, EUA), anti-p-JNK (SC-6254; Santa Cruz), anti-JNK (9252; Cell Signaling Technology), anti-MKP-1 (SC-1102; Santa Cruz), e anti -GAPDH (KC-5G4; Kangchen, Xangai, China). A expressão proteica foi avaliada utilizando o kit de SuperSignal West Pico (NCI4106; Pierce, Rockford, IL, EUA). A experiência foi repetida pelo menos três vezes. O nível de expressão da proteína foi quantificada utilizando software Scion imagem densitometria (Scion Corporation, Frederick, MD).

Construção de pGL3-

POLI

exclusão e mutagénese dirigida ao local

a -2751 /+ 63, -1832 /+ 63, -1299 /+ 63, -685 /+ 63, -275 /+ 63, -208 /+ 63, -160 /+ 63 e -126 /+ 63 de ADN fragmentos de humano

POLI

gene (relativamente ao local de início da transcrição) foram amplificados a partir de ADN genómico HEK293 por meio de PCR. iniciadores mutagénicos foram projetados para a c-Jun sítio de ligação dentro de -275 /+ 63 com uma incompatibilidade de 2 pb (em negrito e sublinhado); frente: 5′-TGAGCCGGTATTGCCACACTGTTGCCCAC-3 ‘e inverter: 5′-CTGCAACCTCTGCCTCCCGGATTCAAGC-3’. Os produtos de PCR amplificados foram, em seguida, inserido no

Kpnl e

HindIII

locais de vector pGL3-basic (Promega, Madison, WI, EUA). Todas as construções foram confirmadas por sequenciação de ADN (Invitrogen, Xangai, China).

Ensaios

transfecção transitória e luciferase

As células (1 × 10

5) ou foram transfectadas com subclonado diferente plasmídeos repórter de luciferase e pSV-β-galactosidase ou colectivamente transfectadas com pcDNA3.1-c-Jun utilizando o reagente de transfeco Lipofectamina (Invitrogen). Os vectores de pGL3-Basic e pcDNA3.1 vazio foram usadas como controlos. Às 48 horas pós-transfecção, as células foram colhidas e analisadas utilizando Luciferase Assay System (E1500; Promega). O pSV-β-gal (E2000; Promega) foi analisada como controlo. O ensaio foi realizado em triplicado e cada experiência foi repetida pelo menos três vezes.

electroforéticas ensaios de deslocamento da mobilidade

As experiências foram realizadas tal como descrito anteriormente, mas com algumas modificações [20]. Os oligonucleótidos foram marcados com a extremidade de DNA Labeling Kit uma biotina 3 ‘(89818; Pierce). Os oligos de 29 pb marcados com biotina (5’-biotina-TGAGCCGGTATTGCGTCACTGTTGCCCAC-3 ‘; AP-1-como local de ligação indicado em sublinhado) os mutantes de cadeia dupla de 29 pb oligos (5′-TGAGCCGGTATTGCCACACTGTTGCCCAC-3 e’; local de mutação em negrito e sublinhada) foram utilizados para testar a ligação específica. Não marcado oligos foram utilizados para a competição. O Kit LightShift quimioluminescente EMSA (20148; Pierce) foi utilizado para realizar as reacções. Os oligos marcados (20 fmol) foram incubados com extractos nucleares (4 ug) de células HEK293. A seguir à electroforese desnaturante em gel de poliacrilamida não-6%, o gel foi seco e submetido a quimioluminescência. ensaios supershift foram realizadas utilizando um anti-c-Jun anticorpo (sc-44X; Santa Cruz) e uma IgG mouse. (sc-2025; Santa Cruz)

cromatina ensaio de imunoprecipitação

chip foi realizados como previamente descrito [21]. Resumidamente, após a ligação cruzada com 1% de formaldeído, células HEK293 foram lisadas e sonicado. Antes da imunoprecipitação com IgG de rato ou anticorpos de c-Jun (SC-44X, Santa Cruz), uma pequena aliquota da cromatina foi recolhida e usada como um controle de entrada. O fragmento de ADN alvo específica foi medida com iniciadores específicos (directo: 5′-GCCGGTATTGCGTCACTGTT-3 ‘; reverso: 5′-CAGAGTGACACGCATGCCAAGGAATCG-3’) para amplificar a região -236 /-61 de

gene POLI

.

Bioinformatics análise

Cerca de 3.000 pb da região 5 ‘flanqueando do

POLI

sequência foi obtida usando o algoritmo BLAST, do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/e https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgc). locais de ligação do factor de transcrição putativo foram identificados com TRANSFAC 8,1 software profissional (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html). A análise de previsão promotor foi realizada utilizando um banco de dados on-line (https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)

experimentos de interferência RNA

c-Jun siRNA (sc-29223.; Santa Cruz), que é um conjunto de 4-alvo especial 19-25 nt siRNAs, ATR siRNA (SC-29763; Santa Cruz), que é um conjunto de 3-alvo especial 19-25 nt siRNAs ou ARNsi de controlo-a (SC- 37.007; Santa Cruz) diluídos em meio de transfecção (SC-36868; Santa Cruz) foi transfectado em células de reagente de transfecção (SC-29528; Santa Cruz). -específica XPC shRNA (5′-GGATGAAGCCCTCAGCGAT-3 ‘) [22] e de controlo não específico shRNA foram sintetizadas e inseridas num vector de lentivírus (Genechem, Xangai, China), em seguida, as células infectadas, respectivamente. Os experimentos foram pré-formada de forma independente, pelo menos, três vezes.

mutações Detecção de UVC mediadas em

supF

gene repórter

O pSupFG1 plasmídeo foi descrito anteriormente [23], [ ,,,0],24]. Resumidamente, o plasmídeo danificados por UV (10 ug) foi transfectado em células pré-tratadas com ou sem SP600125. O DNA de plasmídeo foi isolado após 48 horas e transformadas em uma

E. coli

SY204 (lacZ âmbar) estirpe via eletroporação a 1800 V /20 MF. A frequência de mutação no

supF

gene repórter foi determinada como o número de colónias mutantes (brancas) nas placas de agar dividindo o número de colónias totais. O espectro de mutação do

supF

gene em colônias brancas foi demonstrado por sequenciação de ADN. A experiência foi repetida, pelo menos, quatro vezes.

-PCR em tempo real

O ARN total foi isolado utilizando TRIzol e sujeitos a transcrição reversa para gerar ADNc (Invitrogen). curvas de amplificação foram gerados através da monitorização da fluorescência de SYBR Green (Invitrogen). Os iniciadores utilizados para a amplificação incluíram o seguinte: MKP-1 para frente, 5′-GTACATCAAGTCCATCTGAC-3 ‘e inverso, 5′-GGTTCTTCTAGGAGTAGACA-3′; GAPDH para a frente, 5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATT-3 ‘e inverso, 5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3’. O ensaio foi realizado em triplicado e cada experiência foi repetida pelo menos três vezes.

A análise estatística

Os dados foram recolhidos, pelo menos, em triplicado, e expressos como média ± erro padrão (SE). As diferenças entre os grupos para a densitometria de expressão molecular foram analisados ​​por teste-t de Student. A significância estatística entre a expressão pol ι e grau patológico de tecidos tumorais de bexiga foi estimada utilizando o teste do qui-quadrado. A correlação entre ι pol e expressão P-c-Jun foi analisada com um teste bivariável. SPSS13.0 software foi utilizado para conduzir a análise estatística (p 0,05 foi considerado significativo). Os dados Immunoblot, EMSA e análise ChIP eram representativas de, pelo menos, três a cinco estudos independentes com resultados reprodutíveis.

Resultados

c-Jun é um fator de transcrição crítico para

POLI

gene

Considerando as pistas experimentais mostraram que a expressão alterada de ι pol pode estar associada à hypermutagenesis e carcinogênese, nós em primeiro lugar, clarificar o seu mecanismo de regulação da transcrição. Para mapear a atividade do promotor mínimo e as sequências regulatórias, analisamos humana

gene POLI

por bioinformática e identificou o promotor básico do

gene POLI

com um putativo AP-1

cis

-element. Uma série de deleções na região 5’flanking de

gene POLI

foram subclonados no vector pGL3-basic (um vector repórter de luciferase). Os iniciadores foram listados na Tabela 1. As actividades destas construções foram avaliados com base na actividade de luciferase após transfecção transiente em células HEK293, um células vulgarmente utilizadas como linha de células de ferramentas. Os nossos resultados mostraram que a mínima

POLI

promotor está localizado na região -275 /+ 63 (Fig. 1A). Outras análises demonstraram que a região (-275 /-208) contém um putativo AP-1 semelhante a ligação

cis

-element (TGCGTCA) no local -228, que é semelhante com o AP- altamente conservado evolutivamente 1 sequência de TGAGTCA (Fig. 1B) vinculativo.

(a) a actividade da luciferase das eliminações de 5 ‘flanqueando região de

gene POLI

foi normalizado pela β-

gal

atividade. Cada barra representa a média ± DP de pelo menos três experiências independentes. (B) representações esquemáticas do

POLI e região promotora distal. (C) as atividades da transcrição do apagamento ou mutante do

promotor POLI

. * Diferença estatisticamente significativa em relação ao pGL3-275 /+ construção 63MU pGL3-275 /+ 63 e (p 0,01; teste t de Student). (D) EMSA de Ensaio. de ensaio (E) Chip. IgG de rato como um controlo negativo. O DNA de entrada ou nenhum DNA adicionado foi cada usado como controle positivo e branco, respectivamente.

Além disso, para esclarecer o papel da transcrição regulamentar desta ligação

cis

-element , foi realizada uma análise de mutagénese da região -275 /+ 63 do gene

POLI

. Um vector designado pGL3-275 /+ 63MU (um motivo de ligação a AP-1 do tipo mutado) foi construído com duas mutações pontuais (TGCcaCA). Curiosamente, a actividade da luciferase foi gravemente atenuada em pGL3-275 /+ 63MU (Fig. 1C, a coluna da esquerda). c-Jun desempenha um papel central em diversas funções do complexo AP-1, por conseguinte, que co-transfectadas transientemente células HEK293 com os constructos e pcDNA3.1-c-Jun para determinar se c-Jun pode activar o

POLI

promotor. O resultado da co-transfecção de luciferase foi revelado que o mais significativamente activado em pGL3-275 /+ 63, embora pGL3-275 /+ 63MU e foi observada pGL3-208 /+ 63 a ser também aumentou (Fig. 1C, coluna da direita) . É possível que a sequência pode conter elementos reguladores adicionais indirectamente controlados pela sobre-expresso de c-Jun que não foram identificados pelo nosso estudo. No entanto, nossos dados ainda sugerem que c-Jun pode eficientemente activar a transcrição da

POLI

gene

via in the AP-1

cis

-element no local -228.

para verificar se c-Jun liga-se diretamente ao motivo no

POLI

promotor, foi realizada EMSA usando extractos nucleares a partir de células HEK293. Uma faixa foi deslocado especialmente produzidos e análise supershift com um anticorpo anti-c-Jun demonstraram que a proteína c-Jun, na verdade, a banda contido (Fig. 1D). Para obter provas de c-Jun directamente vinculativa para a região

in vivo

, chip foi também realizada com um anticorpo anti-c-Jun para precipitar cromatina a partir de células HEK293 (Fig. 1e). Em combinação com as conclusões anteriores, c-Jun parece ligar-se diretamente para o

POLI

promotor e constitutivamente activar a expressão de ι pol nas células HEK293.

A superexpressão de ι pol é dependia activada JNK /c-Jun

está bem documentado que as polimerases de ADN, incluindo translesão ι Pol, pode desempenhar um papel importante na resposta a danos no ADN. Até à data, os certos tipos de danos no DNA que é capaz de ser contornado por ι pol ainda são obscuros e controversos. Foi examinada a expressão induzida por dano do DNA de ι pol, que não foi observado para ser induzida por alguns tipos de danos no ADN, incluindo a cisplatina, bleomicina e etoposido (dados não publicados). No entanto, muitas evidências suportam a noção de que uma das características predominantes de ι pol é a propensão para incorporar os nucleótidos incorrectamente opostas alguns tipos de lesões do ADN, que incluem dímeros de pirimidina ciclobutano e 6-4 pirimidina distorção pirimidona foto aducto seguintes danos UV [8 ], [25]. Mais importante, nós provamos que pol ι pode ser significativamente induzida a um dano UV em estudo anterior [4].

A fim de definir o papel da JNK /c-Jun no TLS pol ι-mediada, escolhemos irradiação UV (UVC a 254 nm) como o modo estudo dos danos de ADN. Para determinar se induzida por UV expressão de pol ι é controlada pela actividade de JNK /c-Jun, verificou-se que a expressão de ι pol foi rapidamente induzida pela exposição de células HEK293 à luz UVC de 30 J /m

2 (um dose apropriada secundária [26]) e permaneceu elevada durante 2-8 horas, o que era concomitante com a activação de c-Jun e JNK, a seguir à irradiação de UV (Fig. 2A). A actividade do promotor do construto pGL3-275 /+ 63 também foi aumentada cerca de 3 vezes após 2 horas de danos de UV com a mesma dose (Fig. 2B).

(A) A cinética da ι POL, P expressão -JNK e pc-jun sob danos UV em células HEK293. (B) O efeito de danos UV sobre a actividade da

POLI

região promotora. * Diferença estatisticamente significativa em relação ao pGL3-275 /+ construção 63MU pGL3-275 /+ 63 e (p 0,01; teste t de Student). ** Diferença estatisticamente significativa em comparação com as células tratadas com ou sem UV (p 0,01). (C) A expressão da ι Pol, c-Jun e P-c-Jun em RT4 e células cancerosas da bexiga T24. Observou-se a expressão de ι POL em células (D) HEK293, T24 e RT4 tratados com diferentes concentrações de SP600125 cultivadas para diferentes comprimentos de tempo adicional; células (E) HEK293 tratados com PD98059 ou SB203580; células (F) HEK293 tratadas com ou sem SP600125 e UV; células (G) HEK293 transfectadas com ARNsi-c-Jun durante 48 horas. O siARN não específica foi usada para controlo. Os valores densitométricos foram indicados abaixo de cada painel.

Em função dos resultados, buscou-se confirmar se JNK /c-Jun é o fator de regulação chave de expressão pol ι no mecanismo geral. Comparou-se a expressão diferente de ι Pol, c-Jun e P-c-Jun em RT4 (uma linha de células bem diferenciado a partir de tumor de baixo grau) e T24 (uma linha de células representado um alto grau do tumor invasoras) células cancerosas da bexiga. Como mostrado na Fig. 2C, a expressão de ι POL em células T24 foi notável mais elevada do que em RT4, ao passo que a expressão de c-Jun e a actividade de P-c-Jun foram melhorada bem. As tempo ou inibições dependentes da dose de pol ι foram observados em células cancerosas da bexiga HEK293, T24 e RT4 pré-tratadas durante 2 horas com um inibidor específico da JNK (SP600125) (Fig. 2D), embora a expressão de pol ι em células HEK293 pareceu aumentar em 48 horas. Ele pode ser a inibição de SP600125 à actividade de JNK, que dura apenas durante 48 horas, que causam a expressão de pol ι recuperado em 48 horas após o tratamento SP600125. Como um controlo, a expressão basal POL ι não foi observada alteração em células HEK293 pré-tratados com PD98059 e SB203580 (inibidor específico da ERK e p38, respectivamente) (Fig. 2E). Os resultados mostram que a activação de JNK /c-Jun via não só é responsável pela expressão de pol ι em células normais, mas também contribui para o potencial de desregulação ι POL em células cancerosas da bexiga. Demonstramos ainda que JNK /c-Jun também regulam directamente o basal e expressões induzidos por UV de ι pol. Quando as células HEK293 foram pré-tratados com SP600125 (20 uM), a expressão de ι pol foi reduzida a 4 horas após a exposição à radiação UV de 30 J /m

2 (Fig. 2F). E c-Jun knockdown reduziu acentuadamente o basal e expressão induzida por UV de pol ι (Fig. 2G). Colectivamente, estes dados sugerem que a superexpressão da ι Pol é em grande parte dependente da via JNK /c-Jun activada.

ATR e XPC promover p-JNK para regular a expressão de pol ι em resposta aos danos de UV

acima

a nossa descoberta nos levou a examinar a sinalização MAPK upstream. Um papel de ADN de sinalização de resposta danos emergiu, o que pode, para além da membrana indirecta bem conhecida ou de sinalização citoplasmática, activam a via da MAPK através de sinalização nuclear [27]. Por conseguinte, desenvolveu-se a hipótese de que a JNK /c-Jun via responsável para a expressão de pol ι induzida por UV pode também ser regulada pela resposta a danos no ADN. Nós avaliamos o efeito de proteínas DNA danos resposta XPC e ATR sobre a extensão da fosforilação de JNK e expressão pol ι com danos UV. Com as células T24-ATR ARNsi ou ARNsh-XPC, o HEK293 silenciadas e ambos expressos níveis mais baixos de ι POL seguintes danos UV, e p-JNK foi correspondentemente reduzida. Pelo contrário, na ausência de danos UV, a expressão de ι POL ou p-JNK foi não significativamente alterada pela ATR e inibição XPC, embora o p-JNK foi observado para ser ligeiramente aumentada por shRNA sistema de lentivírus (Fig. 3A, 3B, 3C e 3D). Este resultado pode ser explicado pelo potencial reacção de stress celular específica do sistema de lentivírus. Assim, ATR e XPC estão envolvidos na sinalização de JNK induzida por UV, que regulam a expressão de ι POL em células normais e células cancerosas da bexiga.

A expressão proteica foi investigada em células diferentes, com tratamento diferente. (A) As células HEK293 transfectadas com ARNsi-ATR. células (B) infectadas com HEK293 shRNA-XPC. células (C) T24 transfectadas com ARNsi-ATR. células (D) T24 infectadas com shRNA-XPC. (E) em tempo real A análise de PCR da expressão de MKP-1 em células não tratadas ou tratadas com siRNA HEK293-c-Jun, ARNsi ou ARNsh-ATR-XPC; Os níveis de ARNm de GAPDH foram determinados como um controlo interno. * Diferença estatisticamente significativa em comparação com células HEK293 com ou sem tratamento (p 0,01; teste t de Student). (F) MKP-1 a expressão da proteína em células HEK293 tratadas com siRNA ou shRNA ATR-XPC. O siARN não específica ou não específica shRNA-lentivírus foi usada para controlo. Os valores densitométricos foram indicados abaixo de cada painel.

Na rede regulamentar MAPK, JNK é fosforilada e ativada pelos MAPKKs dual-especificidade, incluindo MKK4 /SEK1 e MKK7. A actividade de JNK sustentada tem sido atribuído à desfosforilação de JNK prejudicada pela MAP-cinase da fosfatase-1 (MKP-1) [28]. Para avaliar como ATR e XPC ativam a via JNK, nós investigamos se MAPKK sinalização regulada pela ATR e XPC em resposta ao dano UV. Em primeiro lugar, determinou-se a extensão da fosforilação induzida por UV de MKK4 e MKK7. Em relação a células de tipo selvagem, nenhuma alteração foi observada clara sobre a expressão de p-MKK4 ou MKK7-p em células HEK293 e ATR- e T24 silenciados-XPC; isso pode reduzir o possível envolvimento de ATR e XPC em ativar diretamente MAPKK sinalização (Fig. 3A, 3B, 3C e 3D), enquanto que a expressão de MKP-1 foi aumentada significativamente na ATR- e XPC-silenciados células HEK293 seguintes danos UV (Fig. 3E e 3F). Colectivamente outros resultados, os nossos resultados implicam que a proteína DNA danos resposta ATR e via e JNK XPC influência regular a transcrição de ι pol, reduzindo o sinal inibitório MKP-1 em vez de ativar MKK4 e MKK7.

expressão elevada de pol ι está associada com a atividade de c-Jun e malignidade no cancro da bexiga humana

urothelial células estão continuamente expostas a muitos tipos de reagentes de danos ao DNA que estão presentes na urina de aminas aromáticas industriais, fumaça de cigarro e a absorção de produtos químicos drogas [29]. Disfunção de resposta a danos no ADN tem sido implicado como um factor fundamental subjacente ao aparecimento de instabilidade genética na carcinogénese urotelial. Além disso, pol ι que é a propensão para incorporar os nucleótidos incorrectamente oposto das lesões do ADN é a expressão anormal em muitos cancros, embora os mecanismos permanecem obscuros. Assim, fizemos um esforço para determinar se pol ι desempenha o papel potencial mutagênico no cancro da bexiga, que é elevada heterogeneidade e recorrência [29]. Nós examinamos a expressão pol ι em tecidos tumorais 97 bexiga por meio de análise imuno-histoquímica. POL ι proteína foi localizada principalmente nos núcleos, e uma pequena quantidade foi observada no citoplasma. Este resultado revelou que a expressão de pol ι foi significativamente mais elevada em tumores de bexiga de alto grau do que em tumores de baixo grau (Fig. 4a). A análise estatística indicou que existia uma forte associação entre a expressão de pol ι e o grau patológico de tecidos de tumor da bexiga (Tabela 2; p 0,01). Também foi observada a expressão de pol ι a ser elevados em tecidos de cancro da bexiga em comparação com os lados de carcinoma de tecidos por western blotting (Fig. 4B). Estes resultados sugerem que a expressão de pol ι pode servir como um indicador da malignidade e progressão do carcinoma urotelial.

(A) POL ι proteína é expressa de forma aberrante em tumores de grau diferente de acordo com a classificação da OMS. A1 é um tumor de grau I; A2 é o tumor de grau II; A3 é tumor III-grade (× 400 ampliação). (B) A expressão de ι POL em 5 pares de lados carcinoma da bexiga e tecidos de cancro. “N” foi representada lados do tecido de carcinoma, “C” foi representada tecido de cancro. Os valores densitométricos foram indicados abaixo de cada painel. (C) casos representativos da concordância de ι pol e expressão p-c-Jun no cancro da bexiga. C1 e C2 foram, respectivamente, mostraram a expressão elevada de ι pol e P-c-Jun em pares de uma simples. C3 e C4 foram a expressão baixa em mais pares (× 100 e × 400 ampliação).

Para determinar se a sobre-expressão de pol ι resultados da desregulação da JNK /c-Jun activação

in vivo

, analisamos a concordância de ι pol elevada e actividade c-Jun anormal nos tecidos de cancro da bexiga. Foram selecionados aleatoriamente 41 tecidos tumorais de bexiga embebidos em parafina a partir de um total de 97 amostras de pacientes. O nível de P-c-Jun foi principalmente de acordo com a expressão de pol ι (Fig. 4C). A expressão de p-c-Jun foi positivamente associado com expressão elevada pol ι em cancros da bexiga (Tabela 3; r = 0,662, p 0,01). O resultado reforça a conclusão de que c-Jun regula positivamente a expressão pol ι e sugere que anormal pc-jun contribuir para a expressão pol ι desregulado envolvidos na progressão do câncer de bexiga.

A superexpressão de ι pol activada por JNK /c-Jun promove hypermutagenesis induzido por UV em células T24

Para avaliar a importância da superexpressão de ι pol e pc-jun

in vivo

, examinamos o papel hypermutagenic potencial células de câncer de bexiga.