Sumário

4 proteína (hPEBP4) é uma molécula anti-apoptose novo relacionado com a resistência de tumores a agentes apoptóticos de ligação fosfatidiletanolamina humano. Aqui nós procuramos investigar o papel da hPEBP4 na radiorresistência de câncer retal. A análise imuno-histoquímica mostrou hPEBP4 foi expressa em 27/33 de espécimes de cancro rectal, mas apenas em 2/33 de mucosa normal vizinho. Silenciar a expressão de hPEBP4 com siRNA reduziu significativamente a sobrevivência clonogénica e reforçada a apoptose de células de cancro rectal em irradiação. Em vez disso, a sobre-expressão forçada de hPEBP4 promoveu a sua sobrevivência e diminuiu a apoptose. Western blot mostrou hPEBP4 poderia aumentar a ativação da Akt induzida por radiação, para a qual foi requerido espécime reativas de oxigênio (ROS). O efeito radiorresistência de hPEBP4 foi revertida após dado LY-294002 para inibir a ativação da Akt ou antioxidante para abolir a produção de ROS. Nós também confirmou que efeito da hPEBP4 in vivo com camundongos nus. Assim, concluímos que hPEBP4, especificamente expressos em células do cancro retal, está associada com radiorresistência do câncer de reto, o que implica que a modulação da hPEBP4 pode ter implicações terapêuticas importantes na radioterapia do câncer de reto

Citation:. Qiu J, Yang G , Lin a, Shen Z, Wang D, Ding L (2014)-fosfatidiletanolamina Binding Protein 4 Promovido a radiorresistência do cancro retal humano através da activação da Akt de forma ROS-Dependent Humano. PLoS ONE 9 (3): e90062. doi: 10.1371 /journal.pone.0090062

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de agosto de 2013; Aceito: 28 de janeiro de 2014; Publicação: 03 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Qiu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Fundo Nacional de Ciência Natural da China (número do projeto 81.101.876), o Fundo de investigação médica de Zhejiang Departamento Provincial de Saúde (número do projeto 2011RCA035), e do Fundo de Ciência Natural da província de Zhejiang (número do projeto Y2110782) e ao Fundo de investigação médica do departamento de tecnologia da ciência da província de Zhejiang (número do projeto 2012C33SA100045). Os financiadores acima não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

o câncer colorretal é um dos mais cancros prevalentes em todo o mundo. Estima-se que existem cerca de 1,2 milhões de homens e mulheres que vivem nos Estados Unidos com um diagnóstico prévio de câncer colorretal, e um adicional de 143.460 serão diagnosticados em 2013 [1]. Entre os pacientes, contas retais avançados locais de câncer para uma grande parte deles. Hoje em dia quimioradioterápico pré-operatória tornou-se um componente integral no tratamento para o cancro rectal avançado local, o que acredita-se ser capaz de reduzir o risco de recorrência local e aumentar a probabilidade de cirurgia do esfíncter de preservação [2]. Infelizmente, nem todos os cancros rectais são sensíveis à radioterapia. Por exemplo, estima-se que apenas cerca de 20% dos pacientes alcançar respostas patológicas completa à terapia pré-operatória radiação [3]. Assim, aprofundar a compreensão da radioresistace pode nos ajudar a selecionar pacientes com câncer retal radiossensíveis para receber radioterapia pré-operatória, evitar o atraso da cirurgia para pacientes radiorresistência e até mesmo superar radiorresistência com novas estratégias radiossensíveis.

hPEBP4 é um novo membro da família PEBP [4]. Sobre-expressam em uma ampla gama de tumores sólidos, incluindo o cancro da mama, cancro do ovário e cancro da próstata, hPEBP4 foi demonstrada para inibir a apoptose de células cancerosas através da regulação da degradação de moléculas apoptóticas, tais como Bcl-2 /Bcl-X e caspase-3 [ ,,,0],5] – [8]. Considerando que a evasão da apoptose é uma das marcas de cancros humanos [9] e a citotoxicidade induzida por radioterapia é mediada, em grande medida, pela indução de apoptose em células cancerosas [10], [11], especula-se que hPEBP4 pode participar na resistência de cancro rectal para radioterapia pré-operatória. Na verdade, o nosso estudo recente mostra hPEBP4 era um biomarcador preditivo independente para a resposta de cancro rectal para radioterapia pré-operatório, o que sugere que se regularizador hPEBP4 pode ser um mecanismo potencial pelo qual as células cancerosas rectais evitar os efeitos destrutivos da radiação [12]. No entanto, ainda não existe uma prova experimental direta sobre o papel da hPEBP4 na redioresistance de cancro rectal até agora.

No presente estudo, examinamos o estado de expressão de hPEBP4 em amostras de câncer retal e da mucosa normal adjacente bem como por imuno-histoquímica e explorou se hPEBP4 tem um papel na radiorresistência de células cancerosas rectais humanos. Nossos dados indicam hPEBP4 foi relativamente expressa em tecidos de câncer retal e participou do radioresisitance de câncer retal, que foi Akt e ROS dependente. Nosso estudo sugere que a modulação farmacológica ou genética de hPEBP4 pode ter importantes implicações terapêuticas para melhorar o efeito curativo da radioterapia pré-operatória para câncer retal.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os animais foram criados usando protocolos que tinham sido aprovados pela Comissão Cuidado e Uso animal do Hospital do Terceiro Pessoas de Hangzhou, China de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais relevantes e da Comissão de Cuidado e Uso do animal também aprovou este estudo a realizar. consentimento informado por escrito do doador foi obtido pelo uso de tecidos humanos nesta pesquisa, que também foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital do Terceiro Pessoas de Hangzhou.

Reagentes e Cultura de Células

Lipofectamine reagente e DCF-dA eram de Invitrogen (Carlsbad, CA). Os anticorpos específicos para fosfo-Akt (Ser473) e Akt total foram de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Os inibidores da PI 3-quinase, LY-294002 foi obtido da Calbiochem. N-acetil-Lcysteine ​​(NAC) antioxidante (Sigma) foi utilizado para inibir a produção de ROS. Todas as células de cancro colo-rectais humanos foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e mantidas em meio DMEM (Gibco, EUA) suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de vitelo, 4,5 g /litro de D-glucose, não essencial ácidos aminados (100 pM cada), 100 unidades /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, e glutamina 2 mM a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%.

Análise imuno-histoquímica de hPEBP4 Expressão in Human Câncer retal

Todos os cancerosas e cancerosas adjacentes tecidos rectais humanos patologicamente confirmados foram obtidos a partir de amostras de tumores ressecados radicalmente com o consentimento informado de cada paciente no Departamento de colorectal Cirurgia, Hospital do Terceiro Pessoas de Hangzhou, China. As amostras foram fixadas com formalina, embebidos em parafina, e histoquímica com anti-hPEBP4 anticorpo [4] com peroxidase método complexo avidina-biotina (Cybrdi, Xi’an, Shanxi, China). A imunorreactividade foi avaliada com base na percentagem de células positivas coradas. A intensidade é designado como 0 quando não mancha as células tumorais (negativa), 1, quando 10-20% das células mancha (coloração fraca), 2 quando 20-50% das células mancha (coloração moderada), e 3, quando mais de 50% de mancha de células (coloração forte). Para as análises estatísticas, tecidos marcando 2 e 3 foram combinados como definida positiva e tecidos marcando 0 e 1 foram designados como negativo.

transfecção celular

O vector de expressão de hPEBP4 construído como descrito anteriormente [4] foi transfectado em células SW480, utilizando o reagente Lipofectamina com pcDNA3.1 Myc-His /(-) B como um controlo simulado. 48 h após a transfecção, as células foram rastreadas sob 0,8 mg /ml de G418 (Merck, Darmstadt, Alemanha) durante três semanas.

colónias resistentes G418 individuais foram subclonados como SW480 /hPEBP4 e SW480 /Mock. A expressão hPEBP4 foi determinada por RT-PCR e análise de Western blot.

hPEBP4 ARN interferência no ensaio

Para silenciamento de expressão estável hPEBP4 em HRT-18 de células humanas de cancro rectal, as células foram transfectadas com o plasmídeo neo-hPEBP4 siRNA ou utilizando o reagente de Lipofectamine, como descrito anteriormente [5]. 48 h após a transfecção, as células foram rastreadas sob 0,6 mg /ml de G418 durante 25 dias. Colónias individuais resistentes a G418 foram subclonados como HRT-18 /Mock e HRT-18 /hPEBP4 siRNA, e silenciamento resultado de hPEBP4 foi determinada por RT-PCR e análise de Western blot.

RT-PCR para hPEBP4

O ARN foi recolhido com Trizol (Invitrogen) e o ADNc foi sintetizado com 1 ug de ARN total utilizando primeira síntese cadeia de cDNA kit-ReverTra Ace-α (Toyobo) a 42 e 99 ° C durante 20 e 5 minutos, respectivamente. reacção de PCR foi realizada num volume de reacção de 10 ul, que consistiu de um passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 30 segundos e seguindo-se 30 ciclos de amplificação a 95 ° C durante 5 seg, 56 ° C durante 30 seg. Os iniciadores específicos para hPEBP4 foram 5′-GGGTTGGACAATGAGGCTG-3 ‘(sentido) e 5′-TGTGCTTGGGCTCGCTGGC-3’ (anti-sentido).

Ensaio de Apoptose

As células foram lavadas, ressuspensas em tampão de coloração , e coradas com anexina V /PI apoptose (Invitrogen) ou R123 (R-302, Molecular Probes) de acordo com as instruções do fabricante. As células coradas foram analisadas por células activadas por fluorescência (FACScalibur, Becton Dickinson, Mountain View, CA) .Experiments foram repetidas por três vezes.

Análise Western Blot

BCA Protein Assay Kit Reagente ( Pierce) foi utilizado para medir a concentração de proteína. As amostras que contêm quantidades iguais de proteína foram separadas por 12% SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose Protran. As manchas foram sondados com os anticorpos indicados com anticorpos conjugados com peroxidase de rábano apropriado como anticorpos secundários (Cell Signaling Technology). SuperSignal Oeste Femto sensibilidade máxima de substrato (Pierce) foi utilizado para a visualização de proteínas quimioluminescente [5].

Ensaio de sobrevivência clonogénica

de crescimento exponencial células de cancro rectal em cultura em monocamada foram irradiadas em 100 mm placas de Petri usando um raio X-250 kVp (0,61 Gy /min) por exposição à radiação única. Após a exposição à irradiação ionizante, as células foram colhidas para análise de sobrevivência clonogénica. A sobrevivência após exposição a radiação foi definida como a capacidade das células para manter a sua capacidade clonogénico e para formar colónias. Resumidamente, após a exposição à radiação, as células foram tripsinizadas, contadas e semeadas para formação de colónias em 100 mm de placas de Petri de 500-1000 células /prato. Após intervalos de incubação de 21 dias, as colónias foram coradas com violeta de cristal e contadas manualmente. As colónias constituídas por mais do que 50 células foram contadas, e três pratos replicados foram contadas para cada tratamento. As experiências foram realizadas pelo menos 3 vezes para todos os pontos de dados. Os resultados experimentais foram corrigidos para os efeitos induzidos pelo controlo não irradiado. As experiências foram repetidas três vezes.

Activação de Caspase Ensaio

TRH /Mock e TRH /células de siRNA foram plaqueadas em placas de 96 poços (10.000 células por poço) e irradiadas (8Gy). Após 24 horas de incubação, a activação de caspases 3/7 celulares foi medida por um ensaio de fluorescencebased (Apo-ONE Homogéneo A caspase-3/7 Ensaio; Promega). Seis poços por condição de tratamento foram utilizados para obter um sinal médio de fluorescência e normalizadas para o logro-tratados células HRT controle.

Medição da ROS

Para a análise de conteúdo ROS, não tratados e tratados com IR (8Gy ) as células cancerosas rectais aderentes foram primeiro ensaiados quanto a viabilidade por exclusão do corante azul de tripano e incubados com 4 uM DCF-DA durante 45 min a 37 ° C.Then as células foram analisadas por citometria de fluxo como descrito anteriormente [13]. Os experimentos foram realizados pelo menos 3 vezes para todos os pontos de dados.

Estudos in vivo de radiação

nu camundongos masculino atímicos /nu (4 semanas de idade) foram adquiridos a partir do Centro Experimental animal de Xangai e foram levantados por meio de protocolos que tinham sido aprovados pela Comissão Cuidado e Uso Institucional animal. 48 ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos. Os ratinhos foram injectados subcutaneamente com 2 x 10

6 HRT-18 /Mock e HRT-18 /siRNA células na almofada da pata direita, respectivamente. Quando os tumores eram de aproximadamente 0,5-0,8 cm de diâmetro maior, os ratinhos foram irradiados com 2 Gy fonte Cs-radiação de três em três dias por três vezes, como descrito anteriormente [14]. Os tumores foram medidos e monitorizados com a fórmula V = (A x b

2) /2 de três em três dias. Observação foi fechada uma vez que o volume médio de tumor de qualquer grupo atingiu cerca de 2,0 cm

3. Todos os ratinhos foram excisadas de 33 dias após a exposição a radiação do tumor e curva-tempo de tamanho, assim como a apoptose de tecidos de tumor foi analisada.

Ensaio TUNEL

Tumores obtidos foram fixados em 10% formalina e embebidos em parafina depois de murganhos foram excisados. Após desparafinização, as amostras de tumor foram despojados de proteína por incubação com 20 mg /ml de proteinase K (Sigma Chemical) durante 15 min à temperatura ambiente. TUNEL coloração foi realizada utilizando um kit de detecção de apoptose in situ em (Roche) de acordo com os protocolos do fabricante. Os núcleos foram corados com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; fluorescência azul), e células positivas TUNEL foram visualizados por fluorescência verde. Mais do que 200 células DAPI-positivas foram examinados em 5 campos aleatórios de cada grupo, e as células positivas TUNEL foram contadas para calcular o na apoptose in situ.

Análise estatística

Os dados são expressos como média valores ± SD. A significância estatística das diferenças entre grupos foi testada pelo teste t de Student ou ANOVA de uma via. Diferença da intensidade de expressão hPEBP4 entre tecidos de câncer retal e tecidos humanos rectais normais adjacentes foi analisada por meio do teste do qui-quadrado de Pearson. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

A expressão de hPEBP4 Aumento no cancro retal Humano

Para elucidar o padrão de hPEBP4 expressão, examinamos primeiro a expressão de hPEBP4 tanto em tecidos de câncer retal e tecidos humanos retais adjacentes normais com amostras ressecados após a cirurgia radical utilizando análise imunohistoquímica. hPEBP4 expressão estava presente em uma percentagem muito elevada de tecido de cancro rectal (78,8%, 26/33), em comparação com as percentagens muito baixas nos tecidos rectais normais correspondentes (6,1%, 2/33; p 0,001, Tabela 1, Fig 1A , B). Os dados demonstram o padrão de expressão preferencial de hPEBP4 em tecidos de câncer de reto humanos. Para estudar a função de hPEBP4 em resposta à radiação de cancro rectal humano, a expressão de hPEBP4 em dois modelos celulares de cancro colorrectal foram examinados, mostrando hPEBP4 foi fortemente expressa em HRT-18 células, mas muito moderadamente expressos em células SW480 (Fig 1C) .

a, B

expressão de hPEBP4 no cancro rectal humana e tecidos adjacentes normais retal com imuno-histoquímica (× 200);

expressão de hPEBP4 de linhas celulares de cancro rectal humanos C

medida com western blot.

hPEBP4 Promovido clonogênica sobrevivência de células cancerosas no reto em resposta à radiação

Para examinar o papel do hPEBP4 na radiorresistência de câncer retal, que primeiro estabeleceu transfectantes estáveis ​​derrubando expressão hPEBP4 e com superexpressão hPEBP4 em células HRT-18 e SW480, respectivamente. A eficiência de sobre-expressão ou silêncio de hPEBP4 foi confirmada por RT-PCR (Fig 2A). Em seguida, foi realizada ensaios de formação de colónias em duas linhas de células para avaliar o efeito de hPEBP4 sobre a sobrevivência das células após a radiação. Descobrimos que a sobrevivência clonogénica das células HRT-18 em resposta de radiação foi significativamente comprometido após hPEBP4 foi silenciada, enquanto que a sobre-expressão de hPEBP4 melhorada que, como mostrado na SW480 células (Fig 2B, C). Para confirmar o efeito radiorresistência de hPEBP4, repetimos acima experimentos com HT-29 e células Lovo como silenciamento de genes e modelos superexpressão respectivamente (Fig 2D). Descobrimos que a sobrevivência clonogênica de células HT-29 foi significativamente comprometida após hPEBP4 foi silenciado, enquanto a superexpressão de hPEBP4 aumentou a sobrevivência das células Lovo após a irradiação (Fig 2E).

A,

RT-PCR para confirmar a superexpressão estável de hPEBP4 em células SW480 e silêncio da hPEBP4 em HRT-18 células;

B, C,

efeito de hPEBP4 na sobrevivência clogenical de células HRT-18 e SW480;

D

, Western Blot para confirmar o silêncio estável de hPEBP4 em células HT-29 e superexpressão de hPEBP4 em células Lovo;

E

, efeito da hPEBP4 na sobrevivência de células clogenical Lovo HT-29 e por hPEBP4 silêncio e superexpressão respectivamente. *, P . 0,05

hPEBP4 estava envolvido na resistência da apoptose induzida por radiação de cancro retal Cells

Como mostrado na Fig. 3

A

, as células SW480 /simulados foram sensíveis à apoptose induzida por radiação. No entanto, as células SW480 /hPEBP4 sobreexpressam hPEBP4 eram relativamente refractários à apoptose induzida por radiação, indicando que hPEBP4 confere a resistência à radiação de cancro rectal. Assim, após hPEBP4 foi silenciado, HRT-18 células tornou-se mais sensível à apoptose induzida por radiação em comparação com as células HRT-18 /simulados (Fig. 3

B

). O efeito acima de hPEBP4 também foi repetido numa outra experiência knockdown e a sobre-expressão com células HT-29 e Lovo como modelos (Fig. 3C), o que confirma ainda mais o efeito de hPEBP4 na resistência à radiação em células de cancro rectal. hPEBP4 pode inibir a apoptose induzida por radiação, restringindo a activação de caspase3 e 7 (Fig. 3D). Considerando que, após a activação da cascata de caspases, clivagem proteolítica específica da proteína PARP é um acontecimento importante para a ocorrência da apoptose, o efeito de hPEBP4 em PARP foi examinada após a irradiação. Com hPEBP4 silenciamentos combinada com a radiação, foi observada uma degradação óbvia de 116 kDa de PARP em uma proteína de fragmentação de 85 kDa em comparação com a radiação somente (Figura 3E), confirmando que hPEBP4 inibe a apoptose induzida por radiação de células de cancro rectal, representado pela activação de caspase-3 e PARP de clivagem proteolítica

a,

resultado representativo de FCM para mostrar o efeito de hPEBP4 na apoptose induzida por irradiação de células SW480.;

B,

resultado representativo de FCM para mostrar o efeito de hPEBP4 na apoptose induzida por irradiação de células HRT-18; C, histograma para resumir o efeito de hPEBP4 na apoptose induzida por irradiação de HRT-18 (hPEBP4-siRNA), HT-29 (hPEBP4-siRNA), SW480 (hPEBP4 superexpressão) e as células Lovo (hPEBP4 superexpressão);

D,

efeito da hPEBP4 na capase3 /7 ativação induzida por irradiação de câncer retal HRT-18 células;

E,

efeito da hPEBP4 na cleavge PARP induzida por irradiação de câncer retal células HRT-18. *, P 0,05; **, P . 0,01

hPEBP4 mediada por radiação resistência das células cancerosas rectal foi Akt e ROS Dependente

ativação da Akt tem sido demonstrado ser envolvido em radiorresistência de inúmeros tumores [15] – [17]. Então, nós exploramos o papel da Akt na resistência hPEBP4 mediada à apoptose induzida por radiação. Em primeiro lugar, examinamos a activação de Akt após a radiação. Encontramos Akt foi dramaticamente activado após a radiação em células de câncer retal, que foi promovido pela hPEBP4 (Fig 4A). Para determinar se a radiorresistência hPEBP4 mediada requer a activação de Akt, que, em seguida, pré-incubadas com as células cancerosas rectais 20 uM LY-294002 durante 1 h, e tratou-se as células com radiação. Descobrimos que LY-294002 quase inverteu o efeito inibitório de hPEBP4 na apoptose induzida por radiação tanto em células SW480 (Fig. 4B) e HRT-18. À medida que a geração de espécies de oxigénio reactivas (ROS) foi relatado a desempenhar um papel importante na apoptose induzida por radiação de células cancerosas [18], foi também avaliado o efeito do hPEBP4 sobre o estado redox intracelular. Tal como mostrado na análise de citometria de fluxo com a DCFH-DA, hPEBP4 sozinha não teve nenhum efeito sobre o estado redox intracelular. No entanto, a exposição a radiação causou um aumento significativo na acumulação de peróxidos intracelular em células de cancro rectal. Mas não houve mudança significativa para o nível de peróxidos intracelulares em células de câncer retal após hPEBP4 foi silenciado ou sobre-expressos (Fig4 C, D). Mesmo assim, a utilização concomitante de antioxidante NAC (pré-tratamento durante 4 h, na concentração de 5 mM) com radiação quase inverteu o efeito de hPEBP4 na apoptose induzida por radiação de células de cancro rectal (Figura 4E). Curiosamente, a utilização concomitante de NAC e radiação também inibiu a regulação da Akt por hPEBP4 (figura 4F), o que sugeriu que as ROS é necessária por hPEBP4 para modular Akt no contexto de eventos apoptóticos induzidos por radiação. Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que hPEBP4 promoveu a radiorresistência de células de câncer retal, agindo no meio do caminho do sinal ROS e Akt, que pode ativar ainda mais caspases para acionar apoptose.

A,

western blot que mostra o efeito de hPEBP4 sobre a activação de Akt após a irradiação com células de cancro rectal SW480 HRT-18 e;

B,

coloração anexina V /PI para mostrar ativação da Akt foi exigido no efeito radiorresistência de hPEBP4 no HTR-18 e SW480 células por hPEBP4 silêncio e superexpressão respectivamente;

C

, Representante ROS resultado coloração para mostrar hPEBP4 não teve efeito sobre o nível intracelular de ROS em HRT-18 células de câncer retal;

D

, Histograma para mostrar hPEBP4 não teve efeito sobre o nível intracelular de ROS em células HRT-18 e câncer retal SW480 por hPEBP4 silêncio e superexpressão respectivamente;

E

, foi necessária Resultado da anexina V coloração /PI para mostrar ROS no efeito radiorresistência de hPEBP4; .

F

, foi exigido resultado Representante do western blot para mostrar ROS na ativação da Akt por hPEBP4 após a irradiação com HRT-18 como modelo de estudo *, P . 0,05

hPEBP4 Participa do radiorresistência dos cancros rectais na vivo

Para determinar se hPEBP4 também pode mediar a radiorresistência de câncer colorretal in vivo, nós examinamos o efeito da radiação sozinho, hPEBP4 silenciados por si só, ou em combinação sobre o crescimento de subcutânea HRT-18 xenotransplante tumores do reto em ratos sem pêlo (Fig 5A). A partir do décimo quinto dia, o volume do tumor no grupo de tratamento combinado foi significativamente mais baixa do que na radiação único grupo. O atraso no crescimento depois do tratamento combinado foi mais do que a provocada por qualquer dos outros tratamentos (Fig 5B). imagens representativas do volume do tumor no dia quinze são ilustrados na Fig 5C. Observamos também a apoptose de células tumorais in situ, o que indica que houve uma dramática maior índice de apoptose em HRT grupo /hPEBP4-RNAi que no HRT /grupo Mock (Fig 5D, E).

Um, fluxograma

dos experimentos in vivo;

B,

curva de crescimento para o efeito de hPEBP4 no tumor rectal humano transplantados in vivo após irradiação;

C,

imagem representativa do tumor rectal transplantado na pata de camundongos nua para cada grupo de 15 dias após a irradiação;

D,

imagem representativa de TUNEL para mostrar o in situ apopatosis dos tumores rectais transplantados para cada grupo após os ratinhos foram sacrificados;

E

, In vivo resumo apoptose depois da irradiação para cada ratos gourp.

Discussão

O objetivo do presente estudo foi determinar o efeito de hPEBP4 na radiossensibilidade de câncer colorretal. Nossos resultados sugerem que hPEBP4 aumenta a radiorresistência de células de câncer colorretal tanto in vitro como in vivo, mediado por promover a ativação ROS-dependente de Akt.

radioterapia pré-operatória tornou-se uma parte padrão do tratamento abrangente de localmente avançado câncer retal. No entanto, muitos pacientes de cancro rectal são realmente resistentes à radioterapia devido à heterogeneidade de câncer retal para resposta a irradiação. Para os pacientes, a radioterapia pré-operatória não só atrasa a intervenção imediata de cirurgia, mas também pode causar efeitos tóxicos graves, como deiscência de anastomose, infecção da ferida perineal, e afetar adversamente a função do esfíncter anal após a cirurgia de preservação do esfíncter [19], [20]. Assim, a exploração do mecanismo de radiorresistência do cancro rectal é muito importante para melhorar a eficiência do tratamento. Foi demonstrado que a apoptose induzida por radiação é um importante mecanismo de radiossensibilidade de um painel de células de cancro, incluindo o cancro colorrectal [21], [22]. Assim, um agente que é capaz de aumentar a apoptose induzida por radiação de células tumorais podem ter o potencial para se tornar um radiossensibilizador. hPEBP4 é um novo membro da família de proteínas phosphatidylethanolaminebinding, identificadas a partir de células do estroma da medula óssea humana [4]. A sobre-expressão de hPEBP4 nos cancros da mama, da próstata e do ovário cancros tem sido mostrado para inibir a apoptose de células cancerosas [4] – [8]. Assim, foi perguntado se hPEBP4 desempenhar um papel na resposta de cancro rectal para radioterapia. Na verdade, em um trabalho recente, demonstraram que a expressão hPEBP4 em uma amostra de pré-tratamento de biópsia como um preditor independente de resposta à radioterapia pré-operatória em pacientes com câncer retal e encontramos uma regulação positiva dramática da expressão hPEBP4 em tecidos de câncer retal após a radioterapia pré-operatória comprared com o biópsia durante o exame de colonoscopia, sugerindo que hPEBP4 pode desempenhar um papel na radiorresistência de câncer retal, embora uma ligação directa entre hPEBP4 e radiorresistência não foi fornecido naquela época [12]. Agora, com o presente trabalho, caracterizado a expressão relativamente específico de hPEBP4 em cancros rectais em comparação com os tecidos rectais normais adjacentes e desde que a prova experimental direta sobre o efeito radiorresistência de hPEBP4 no cancro rectal. Nós também delineou o mecanismo subjacente desse efeito, que devem convergir para a via de sinalização ROS-Akt. No entanto, não sabíamos o evento de sinal exata em baixa das ROS, através do qual hPEBP4 activado Akt para promover a radiorresistência de cance rectal. Para a radiação de transferência de energia linear baixa, mais frequentemente utilizado na radioterapia do câncer de reto hoje em dia, oxigênio e seus derivados, tais como radicais livres e espécies reactivas de oxigénio (ROS) são muito importante na morte de células tumorais em vez de um ataque direto ao DNA de raios radioativos [23]. Mas o papel de ROS na radioterapia do tumor é um pouco complicado. Por um lado ROS é mediadores críticos de destruição celular induzida por radiação ionizante, e em outra mão ROS pode fornecer células tumorais com vantagem de sobrevivência sobre contrapartes normais e sob condição estressado. Na verdade ROS são importantes moléculas de sinalização intracelular que regulam o equilíbrio entre sobrevivência e morte celular [18], [24] – [26]. AKT parecia ser um factor crítico na radiorresistência por regulação da apoptose, o crescimento celular, a absorção de glucose e de utilização, e a síntese de proteínas, tais como Bcl-2 membros da família, da Caspase-3/9, FKHRL1, a libertação do citocromo c das mitocôndrias [27 ] – [30]. A diafonia entre via de sinal de ROS e Akt foi demonstrada a existência de muitas células tumorais. A radiação ionizante na gama de dosagem terapêutica podem induzir uma transição de permeabilidade mitocondrial reversível e estimular uma geração transitória celular de ROS, que pode então actuar como segundos mensageiros na transdução de sinal [31] – [32]. O nosso estudo mostraram que a activação de Akt por hPEBP4 em células de cancro rectal em irradiação foi abolida após antioxidante foi determinada para inibir a produção de ROS, mas hPEBP4 teve nenhum efeito sobre o nível intracelular de ROS, o que sugere que hPEBP4 promove especificamente a activação de Akt por ROS depois da irradiação em células de câncer retal. Na verdade, tanto um efeito de sobrevivência e de apoptose, também podem existir para o sinal de Akt após activado por ROS [33] – [36]. Com base nos dados que temos a partir deste estudo, acreditamos que hPEBP4 pode representar uma molécula sinal de sobrevivência, ativando sinal via ROS-Akt no contexto da radioterapia do cancro rectal. Especificamente sobre-expressos em células cancerosas, hPEBP4 ajuda as células cancerosas desequilibrada para resistir a morte induzida por radiação através do reforço selectivamente o sinal de sobrevivência a jusante da ROS depois da radioterapia. Podemos até fazer uma especulação ousada que Src quinase pode ser o andaime intermediário para a interação entre hPEBP4, ROS e Akt, uma vez que já forneceu a evidência direta de associação entre hPEBP4 e Src em outro trabalho com células de cancro da mama e Src tinha sido demonstrada a ser exigido na ativação da Akt por ROS anteriormente [32], [37].

em resumo, é o primeiro relatório que sugere um papel de hPEBP4 na radiorresistência de câncer retal e nós também preliminarmente rastreada o mecanismo molecular desse efeito. Além disso, o valor preditivo da hPEBP4 na radiorresistência de câncer retal com amostras de tumores clínicos em nosso relatório recente [12], acreditamos hPEBP4 pode ser um alvo potencial para aumentar a sensibilidade da radioterapia para o cancro rectal. É necessário mais trabalho para demonstrar a eficácia da terapia hPEBP4-alvo na promoção da radioterapia em modelos animais de câncer retal e divulgar a caixa preta do evento de sinal entre ROS e Akt, em que hPEBP4 integra a desempenhar o seu papel.

Agradecimentos

Agradecemos à professora Wang Fan para sua discussão útil e Miss Yu por seu apoio no horário de trabalho.