Abstract

Cancro-testículo (CT) antígenos são predominantemente expresso no testículo ou placenta , mas ausente na maioria dos tecidos adultos. Durante a transformação maligna genes CT são frequentemente activado. antígeno CT 16 (CT16, PAGE5) é frequentemente expressa em melanoma avançado, mas sua função biológica tem sido desconhecido. Para examinar o papel do CT16 na sobrevivência de células que batido na mesma tecla em células de melanoma A2058 usando siRNAs específicos e expuseram as células a cisplatina cancro droga conhecida por induzir apoptose. Como resultado, a sobrevivência celular foi significativamente diminuída. Para estudar os efeitos de CT16 sobre a sobrevivência das células em mais detalhe, os perfis de expressão de genes celulares foram investigados após CT16 silenciamento em células A2058 de melanoma positiva CT16, bem como após CT16 sobre-expressão em células de melanoma negativas CT16 WM-266-4. Entre os 11 genes tanto regulada por CT16 silenciamento e reprimidos por CT16 superexpressão ou vice-versa, 4 genes eram genes potencialmente apoptóticos ou anti-apoptóticos. CT16 foi reconhecido como um regulador positivo da metalotioneína 2A anti-apoptótico e a interleucina 8 genes, enquanto que inibiram a expressão de induzir apoptose Dickkopf um gene (DKK1). Além disso CT16 aumentou a expressão de proteína 7 ácido gordo, um promotor conhecido da progressão do melanoma de ligação. O efeito sobre a expressão de CT16 DKK1 foi independente de p53. Além disso, CT16 não regulam genes apoptóticos via metilação do DNA. Em vinte amostras de tecido de melanoma metástases foi mostrado nível médio de DKK1 mRNA a ser significativamente (p 0,05) mais baixo em alta CT16 que expressam tumores (n = 3) quando comparados com os tumores com expressão baixa CT16 (n = 17). Assim, nossos resultados indicam que CT16 promove a sobrevivência de células de melanoma e é, portanto, um alvo potencial para o desenvolvimento de drogas futuro

Citation:. Nylund C, Rappu P, Pakula E, Heino A, Laato L, Elo LL, et ai. (2012) Melanoma-Associated Câncer-Testículo Antigen 16 (CT16) regula a expressão de apoptóticos e anti-apoptóticos Genes e promove a célula de sobrevivência. PLoS ONE 7 (9): e45382. doi: 10.1371 /journal.pone.0045382

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de maio de 2012; Aceito: 17 de agosto de 2012; Publicado: 21 de Setembro 2012 |

Direitos de autor: © Nylund et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Universidade de Turku Hospital EVO concessão (projeta 13040 e 13041, https://www.tyks.fi), Fundos sudoeste da Cancer Research Foundation finlandesa (https://www.cancer.fi), Academia da Finlândia (http : //www.aka.fi), a Fundação Sigrid Juselius (https://www.sigridjuselius.fi), ea Sociedade do Câncer da Finlândia (https://www.cancer.fi). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

antígenos Cancer-testículo (CTAs) formam um grupo heterólogo de proteínas que são expressas em gametas e trofoblastos [1]. CTdatabase do Instituto Ludwig de Pesquisa do Câncer (https://www.cta.lncc.br/index.php) [2], enumera mais de 140 CTAs. O CTA pode ser dividida a-X-chromosome codificado (X-CTA) e não-cromossoma X-CTA codificado (não-X-CTA). O mecanismo mais comum de activação de genes é CTA promotor desmetilação [1]. Gametogênese e tumorigênese tem muitos eventos correspondentes e partilhados, incluindo hipometilação global e expressão CTA [3]. No entanto, não é claro, se a expressão de CTAs é apenas uma consequência de acontecimentos desmetilação comuns na tumorigênese ou se o CTA tem um papel activo na promoção da progressão do câncer.

De acordo com o CTdatabase, muitos não-X- CTAs parecem ter um papel na função espermatogênese e do esperma no testículo normal. Em contraste, o papel biológico de X-CTA é praticamente desconhecido. A função de produtos de genes codificados por duas famílias X-CTA, mago e SSX, foi previamente estudado. antigénios MAGE-A têm sido relatados para interagir directamente com p53 e reprimir a sua função [4], [5]. Além disso, as proteínas MAGE foram mostrados para formar um complexo com uma proteína de andaimes, proteína associada a uma KRAB (KAP1) e para suprimir a apoptose dependente de p53 [6]. MAGE também foi demonstrada para interagir com ubiquitina ligases E3 ANEL e para aumentar a actividade de ubiquitinação de proteínas de domínio RING para os seus alvos, tais como p53 [7]. Os membros da família SSX que podem fundir-se com SS18, como resultado da translocação cromossómica de um específico no sarcoma sinovial humano [8], tem sido sugerido que actuam como reguladores de transcrição [9]. A levedura de dois híbridos de rastreio e ensaios de pull-down glutationa-S-transferase têm mostrado que a proteína se liga a RAB3IP SSX2 e proteínas SSX2IP [10]. Por outro lado, as proteínas SSX foram relatados para colocalize com os membros do complexo grupo Polycomb [11], e em estudos evidência depois de o papel de proteínas SSX em modificação das histonas e metilação do DNA ter sido encontrado [12], [13] .

CT16 (também conhecido como PAGE5, GAGEE1, CT16.1) é um X-CTA e os seus parentes mais próximos pertencem à família associada ao antígeno prostático (genes PRINCIPAL), que por sua vez está relacionada com Xage e famílias de genes GAGE ​​[14]. CT16 foi relatada pela primeira vez em um estudo onde o banco de dados Unigene foi procurado agrupamentos de genes contendo seqüências expressas originado exclusivamente a partir de ambos os testículos e cDNA tumor bibliotecas humanos normais. A expressão de CT16 em melanomas bem como em cancros do pulmão e renal foi demonstrada ao nível do ARNm [15]. Mais recentemente, relatou a expressão de ARNm de CT16 em 11 de 22 metástases de melanoma da pele. Além disso, mostrámos que, apesar da homologia com antigénios associados a próstata conhecido CT16 não é expresso no cancro da próstata primário [16]. Também desenvolvemos um ensaio sensível para medir CT16 diretamente do soro do paciente e mostrou que 14 dos 23 (61%) dos pacientes com melanoma metastático tinham níveis detectáveis ​​CT16 [16].

O papel biológico de CT16 foi desconhecida , mas existem alguns relatos sobre as funções putativas dos homólogos CT16. Um membro da família GAGE ​​tendo 30% de identidade com CT16 foi relatado para inibir a apoptose e de interagir com nucleofosmina /B23 e factor regulador de interferão 1 [17]. Da mesma forma, recentemente, tem sido mostrado que o cancro da próstata antigénio associado 4 (Page4), que tem 43% de identidade com CT16, é uma proteína anti-apoptótica [18]. No mesmo estudo, os autores também relataram que Page4 é uma proteína intrinsecamente desordenados (IDP) que se liga a sequências ricas em GC no DNA de cadeia dupla [18]. A análise de RMN de CT16 também indicou que é um IDP [19]. De facto, a análise da sequência com o algoritmo IUPred (https://iupred.enzim.hu) [20] prevê que todas as proteínas relacionadas com CT16 são intrinsecamente desordenados. Deslocados são proteínas que não formam uma estrutura 3-D rígida em condições fisiológicas [21]. Além disso, uma recente

in silico

análise sugere que a maioria dos CTAs são deslocados internos [22]. Aproximadamente 25% das proteínas de mamífero são previstos para ser deslocados, e cerca de 75% das proteínas de sinalização de mamífero são previsto para ter regiões desordenadas longos [23]. Tem sido sugerido que os deslocados internos, muitas vezes têm múltiplas funções, uma propriedade denominada como clandestino [24]. Assim, também CT16 eo CTA relacionadas com o CT16 pode ter funções diferentes, dependendo do contexto biológico e localização celular.

Neste artigo estudamos o papel de CT16 em melanoma. Mostramos que o silenciamento de CT16 com siRNAs aumenta a morte celular induzida por cisplatina. análise de transcriptoma utilizando CT16 superexpressão e knockdown revelou que CT16 regula negativamente, provavelmente, indiretamente, expressão de uma proteína anti-apoptótica DKK1. Nós demonstramos que este regulamento é p53 independente e CT16 não tem efeito sobre a metilação dos genes de sobrevivência regulação. Sugerimos também que as amostras de metástase de pele melanoma humanos com alto nível mRNA CT16 pode ter menos mRNA DKK1 do que aqueles com baixo nível mRNA CT16.

Resultados

CT16 é expressa na metástase do melanoma e linhas de células de melanoma ao nível da proteína

Descrevemos previamente a produção de anticorpo policlonal específico contra CT16 humano recombinante [16]. Aqui, utilizou-se o anticorpo para verificar a expressão a nível CT16 proteína na metástase do melanoma da pele. As amostras de tecidos congelados foram estudados usando imuno-histoquímica. CT16 expressão era visível somente em tecidos de metástases de melanoma que expressam ARNm CT16 (Figura 1A, B). Além disso, a quantidade de coloração específica CT16-se correlacionava bem com os níveis de ARNm (Figura S1). As amostras de cancro da próstata primários utilizados como controlos negativos não mostraram qualquer coloração por CT16 (Figura 1C). Uma amostra de testículo foi usada como um controlo positivo e CT16 foi localizado no compartimento basal do epitélio espermatogênica, principalmente em espermatogônia (Figura 1D). Nas amostras de metástases de melanoma CT16 parecia ser principalmente citoplasmática, embora em algumas células núcleos foram também coradas positivamente (Figura 1A).

CT16 foi detectado nas amostras de tecido com anticorpo específico CT16-visualizadas por kit Vectastain ABC e diaminobenzidina, e as secções foram contrastadas com hematoxilina. (A, B) amostras metástase de pele melanoma de dois pacientes. (C) primária do cancro da próstata (controlo negativo). amostra (D) Testículos (controlo positivo). Ambos coloração específica-CT16 citoplasmática e nuclear é visível na área ampliada (no detalhe) da amostra melanoma da pele metástase. Na amostra testículo a ampliação mostra a coloração específica do CT16 das espermatogônias. A barra de escala na imagem testículo representa a ampliação de 150 mm para todas as imagens

A localização intracelular de CT16 foi estudada adicionalmente em células de melanoma SK-MEL-2, bem como em WM-266-. 4 células de melanoma estavelmente transfectadas com CT16 cDNA contendo ou intacto (controlar cDNA) contendo vector de expressão. A expressão das células CT16 CT16 transfectadas foram verificadas tanto ao nível do ARNm e da proteína (Figura S2). ensaio de imunof luorescência utilizando o anticorpo CT16 (Figura 2A) confirmaram a especificidade do anticorpo, uma vez que as células CT16 negativos WM 266-4-transfectadas com o plasmídeo de controlo mostrou alguma fluorescência de fundo somente (Figura 2A). Nas células positivas CT16 CT16 parece localizar tanto no núcleo (excluindo nucléolos) e no citoplasma. Para confirmar a localização no núcleo, SK-MEL-2, o extracto nuclear foi preparado e analisado por Western blotting. CT16 foi encontrado tanto na fracção nuclear e citosólica, ao passo que uma proteína citosólica controlo MEK1 /2 só estava presente na fracção citosólica (Figura 2B).

Imagens (A) de linhas de células de melanoma humano de coelho marcado com indicados anticorpo policlonal contra a proteína do antigénio testículo cancro humano CT16 seguido por anticorpo secundário Alexa Fluor anti-IgG de coelho de cabra 488 (H L). As imagens foram capturadas, em tempos de exposição igual a comparar qualitativamente a expressão do antigénio CT16 nas linhas celulares. A intensidade da fluorescência em WM-266-4 células transfectadas com ADNc de CT16 contendo plasmídeo é semelhante ao de células CT16-positivos SK-MEL-2. WM-266-4 células transfectadas com vector vazio meramente mostra a fluorescência de fundo. A barra de escala representa 20 mm para todas as imagens. (B) Western Blot de citosólica e fracções nucleares de células SK-MEL-2. Para a detecção de CT16, as amostras foram corridas num gel de poliacrilamida não desnaturante de 12%, onde CT16 geralmente migra como dois ou três bandas distintas. MEK1 /2 foi detectada nas amostras corridas num gel desnaturante de poliacrilamida a 12%.

CT16 que não afectam a proliferação celular

O efeito de CT16 sobre a proliferação foi estudada com o estavelmente CT16 transfectadas células WM-266-4. Além disso, dois ARNsi contra ARNm CT16 foram concebidos e verificada para fazer com que mais do que 80% de inibição da expressão CT16, que durou, pelo menos, 96 horas (Figura S3A-C). Os ARNsi foram considerados específicos para CT16, uma vez que eles não regulam a expressão de outros antigénios CT-, v.g. MAGE-1 ou GAGE-1 (Figura S3D). É importante salientar as linhas de células de melanoma utilizados neste estudo não expressou PAGE2B, o homólogo mais próximo de CT16 (Figura S3E). Nem a sobre-expressão de CT16 nas células WM-266-4, nem o tratamento das células com siRNAs A2058 específicos CT16 tiveram um efeito significativo na proliferação celular (Figura 3A, B).

As células A2058 (A) tratadas com CT16 siRNA específicos ou controle foram submetidos to Cell ensaio de proliferação título de 96. O produto corante de formazano solubilizado foi quantificado espectrofotometricamente a 570 nm. (B) Proliferação WM-266-4 estavelmente transfectadas com CT16 ou cDNA controle. células A2058 transfectadas (C) CT16 siRNA foram tratados com cisplatina 50 uM durante 17 horas para induzir a apoptose de células e os lisados ​​foram transferidas para a caspase-3 clivada. células (D) A2058 pré-tratadas com siRNA indicada por 48 h foram autorizados a ligar à placa xCELLigence durante 10 h. As células foram expostas às concentrações indicadas de cisplatina no tempo zero, e o Índice celular foi subsequentemente medida a intervalos de 10 min durante 30 h. As barras de erro representam desvios padrão de três experiências. O índice de células de todas as amostras foi normalizada para 1 no tempo zero. (E) As seções transversais em três momentos do experimento xCELLigence. Os asteriscos indicam diferença significativa do tratamento controle siRNA,

P

. 0,001 (HSD ANOVA, Tukey)

CT16 promove a sobrevivência de células de melanoma

Para testar ainda mais a papel biológico de CT16 expusemos células de melanoma a um cisplatina droga contra o câncer, de indução de apoptose. As células A2058 foram primeiro tratados quer com siRNAs específicos CT16 ou ARNsi de controlo durante 48 horas, e depois da adição de cisplatina as culturas de células foram monitorizados durante 30 h em 10 minutos usando a tecnologia xCELLigence intervalos. Nesta tecnologia, as células são cultivadas sobre uma superfície contendo micro-eléctrodos integrados, e a impedância eléctrica entre os eléctrodos causadas pelas células é medida. A mudança relativa na impedância eléctrica medida é expressa como índice celular (IC). Tanto o número de células e morfologia afetar a CI, e descolamento celular e morte são vistos como uma diminuição da CI.

A cisplatina diminuiu CI de CT16 siRNA células tratadas marcadamente mais do que a de células de siRNA controle tratado (Figura 3D, E ). A diferença foi mais evidente quando cisplatina concentração de 50 uM foi usada. Em contraste, CT16 não teve efeito sobre a sobrevivência na presença de estaurosporina (0 a 600 nm) (não mostrado). Assim, parece que inibe CT16 cisplatina induzida mas não estaurosporina induzida morte de células de melanoma A2058.

Na presença de cisplatina CT16 siRNAs poderia aumentar a activação de caspase-3, como mostrado por Western blotting com anticorpos que reconhecem especificamente caspase-3 (Figura 3C). Assim, CT16 poderia proteger as células de melanoma da apoptose.

CT16 regula genes associados à sobrevivência

Para examinar melhor o papel de CT16 na sobrevivência das células, foram realizados dois experimentos de perfis transcriptomic. Na primeira experiência, as células de melanoma A2058 CT16 positiva foram tratadas com siRNA CT16 específica e, em seguida, em comparação com células A2058 tratadas com ARNsi de controlo. No segundo experimento, controlar de forma estável cDNA transfectadas WM-266-4 células de melanoma foram comparados com forma estável cDNA CT16 células transfectadas. Os dados de microarranjos foram depositados, de acordo com as orientações Miame, em Gene Expression Omnibus NCBI [25], o número de acesso GSE31352 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE31352 ). O algoritmo de classificação do produto foi usado para selecionar genes diferencialmente expressos [26]. O algoritmo detecta genes que são consistentemente encontrados entre os genes mais a montante ou reprimidos através das repetições. O uso de fileiras em vez de valores de expressão aumenta a robustez contra o ruído. Os genes com patente do produto taxa de falsa descoberta (FDR) 0,05 foram submetidos à análise ontologia gênica por ferramenta GoTermMapper que mapeia os genes a componente celular selecionado e categorias ontologia gênica processo biológicos (Slims GO). A distribuição global de componente celular ou processo biológico dos genes expressos diferencialmente revelou ser semelhante em ambos CT16 superexpressão e experiências de knockdown (Figura 4). Para identificar os processos biológicos os genes expressos diferencialmente podem participar em, uma análise anotação funcional foi realizado utilizando a ferramenta DAVID. Apenas os termos com Benjamini-Hochberg FDR 0,05 foram incluídos nos resultados. Os genes que foram regulados positivamente por CT16 sobreexpressão foram significativamente enriquecida nos processos biológicos que promovem a sobrevivência ou estão relacionadas com a inflamação, homeostase química, assim como de resposta a estímulos e ferindo (Tabela 1). Os genes que foram reprimidos por CT16 sobreexpressão foram significativamente sobre-representados unicamente no processamento de antigénios e a apresentação de peptídeos ou antigénio polissacárido através de MHC de classe II processo (Tabela 1). Análise dos genes diferencialmente expressos em ensaios knockdown CT16 não revelou quaisquer processos biológicos com Benjamini-Hochberg FDR 0,05 (não mostrado)

Os genes expressos diferencialmente a partir de knockdown e CT16 superexpressão experiências foram analisadas separadamente.. O número de genes anotados para a categoria particular é entre parênteses. O mapeamento de GO ontologia fino foi feito com GoTermMapper (https://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermMapper).

Para limitar o número de genes a ser estudado, foram selecionados apenas os genes que foram reprimidos por CT16 siRNA específico e regulados positivamente devido à CT16 superexpressão ou

vice-versa

(classificação do produto FDR 0,1 em ambos os experimentos). Do total de 11 genes que cumprem estes critérios, 5 foram anteriormente referida como estando envolvida na progressão do cancro (Tabela 2). Com base nestas experiências CT16 foi reconhecido como um regulador positivo de anti-apoptótico 2A metalotioneína (MT2A) e interleucina 8 (IL8) de genes, enquanto que inibiram a expressão de gene de indução de apoptose Dickkopf 1 (DKK1). Além disso, CT16 aumentou a expressão de proteína de ligação de ácidos gordos 7 (FABP7), um promotor conhecido da progressão do melanoma. A regulação diferencial de FABP7, genes MT2A e DKK1 foi confirmada por análise em tempo real qRT-PCR de CT16 superexpressão WM-266-4 células (Figura 5A, Figura S4).

(A) Verificação de DKK1 diferencial a expressão de ARNm em células (WM 266-4-transfectado com ADNc de controlo ou de ADNc CT16. por qRT-PCR. (B) a expressão diferencial de DKK1 mRNA também foi repetido em células A2058 tratadas com ARNsi indicados durante 48 h. (C) para transferência de Western DKK1 em meio de cultura de células A2058 tratadas com ARNsi indicados durante 48 h. (D) DKK1 é regulada negativamente em amostras de melanoma com expressão elevada CT16. CT16 e ARNm DKK1 níveis de amostras de tecido de melanoma da pele de metástases foram detectados por qRT-PCR. A

P

valor foi obtido testando a diferença no nível de ARNm de DKK1 entre as amostras de melanoma, com elevado nível de ARNm CT16 ( 22% de ARNm β-actina) e aqueles com baixo nível de ARNm CT16 ( 7% da β mRNA actina) pelo teste de Tukey-Kramer.

para testar os critérios de selecção dos genes na Tabela 2, foi utilizado em tempo real qRT-PCR para analisar três genes, CTSL, DDAH1 e BIRC5 que foram reprimidos por CT16 siRNA específico e regulada devido a CT16 superexpressão ou

vice-versa

mas tinha a patente do produto FDR 0,1. Nestas medições, o efeito sobre a expressão de CT16 não pode ser confirmada (Figura S4). Assim, o produto FDR valor limite classificação selecionada de forma eficiente filtrados falsos positivos, mantendo os verdadeiros.

CT16 é um regulador negativo da DKK1 no melanoma

O extracelular antagonista Wnt DKK1 foi escolhido para estudos adicionais, uma vez que foi anteriormente mostrado activar a apoptose e para ser regulada negativamente em pacientes com melanoma e outros cancros [27], [28]. Dois ARNsi CT16 independentes aumentou os níveis de mRNA de DKK1 em células A2058 (Figura 5B). O efeito sobre a expressão de CT16 DKK1 também foi confirmada no nível de proteína no meio de cultura celular de células A2058 por Western blots. Knockdown por CT16 siRNA específico resultou em um aumento na acumulação de proteína DKK1 para o meio (Figura 5C).

para obter provas que CT16 também regula os níveis de expressão de DKK1 em tumores, metástases amostras de pele 20 de melanoma foram analisadas por em tempo real de qRT-PCR. O nível de mRNA CT16 em relação ao p-actina foi abaixo de 7% em 17 amostras que foram agrupadas como amostras de melanoma baixos CT16. nível de mRNA CT16 foi acima de 22% de β-actina em três amostras que foram agrupadas como amostras de melanoma altas CT16. Curiosamente, as amostras com elevado CT16 tinham significativamente (p 0,05, teste de Tukey-Kramer) inferior nível médio ARNm DKK1 em comparação com a de amostras de baixa CT16 (Figura 5D), o que sugere que o elevado nível CT16 pode ser uma razão para a anteriormente descrita regulação negativa de expressão DKK1 em melanoma.

CT16 regula seus genes-alvo de p53 e de metilação do DNA independente maneira

As interações moleculares de X-CTAs são conhecidos apenas em alguns casos. Desde que as proteínas MAGE são conhecidos por afetar as funções de p53 (Yang et al., 2007), que queria estudar os efeitos em diferentes linhas de células positivas CT16. Não houve alteração na expressão da proteína p53 foi detectada por imunotransferência em células CT16 siRNA knockdown SK-MEL-2 em comparação com as células de controlo tratadas siRNA (Figura S5a). Resultado semelhante também foi recebido entre o CT16 e cDNA de controlo transfectadas células WM-266-4 (Figura S5B). Também foram testados os efeitos de CT16 em células de osteossarcoma humano Saos-2 que são conhecidos por não ter expressão de p53. A expressão negativa de p53 em células Saos-2 foi confirmada por qRT-PCR (não mostrado). O resultado mostrou, de forma semelhante, como em células A2058, uma regulação positiva clara, de DKK1 após CT16 knockdown, indicando que o p53 não está envolvido no processo (Figura S5C). Nem tinha CT16 qualquer efeito sobre a alteração conformacional da p53 no extracto bruto de células WM-266-4 (Figura S5D). Além disso, não houve diferença na estabilidade do p53 entre as células A2058 tratada CT16 siRNA e as células de controlo após a inibição da síntese de proteínas com CHX Figura S5E). Em conformidade com isso, nenhum enriquecimento significativo de genes alvo p53 entre os genes expressos diferencialmente foi encontrado (não mostrado). Juntos, estes resultados apoiam a ideia de que a p53 não mediar os efeitos da CT16 ou participar de apoptose.

Alguns X-CTAs também afetam a metilação do gene e modificações pós-traducionais em histonas. Para estudar isto, uma análise da cromatina imunoprecipitação específica do promotor de todo o genoma para as células WM 266-4-transfectadas estavelmente com ADNc ou CT16 controle foi realizado usando DNA metilação das histonas acetiladas H3 e específica de anticorpos específicos e um micro-arranjo que cobre 30.000 promotores humanos. Os genes específicos de amostragem, isto é, com picos (detectada e avaliada por um software NimbleScan) tendo FDR 0,05 para a amostra e no controlo FDR≥0.2 ou vice-versa, foram analisados ​​usando DAVID. Não houve genes significativamente enriquecidos em qualquer categoria ontologia gene entre os genes específicos de amostra (não mostrado). Também comparamos as listas de genes diferencialmente regulados nas linhas celulares derivadas WM-266-4 com o gene de listas específicas de amostras de ambos metilação específico e acetilação das histonas analisa imunoprecipitação específica (Tabela S1). Os resultados sugerem que há uma ligação entre a acetilação das histonas H3 e expressão gênica de genes CT16 regulamentados. No entanto, não é claro se CT16 está envolvida em eventos de acetilação de histonas ou o resultado reflecte meramente a ligação bem conhecido entre a acetilação das histonas H3 e a expressão do gene. Em contraste com a acetilação de histona H3, a metilação do DNA não apresentou correlação com CT16 genes regulados que sugerem que as alterações no perfil de expressão do gene por CT16 não são mediadas por metilação do DNA.

Recentemente, foi demonstrado que proteínas de classe I MAGE regular a transcrição e KAP1 domínio de dedo de zinco KRAB repressão do gene mediada pelo factor através da interacção com KAP1 [34]. No entanto, não é muito provável que também CT16 interagiria com KAP1, uma vez que os alvos KAP1 identificadas numa análise cromatina imunoprecipitação de todo o genoma de KAP1 ligação [35] não foram enriquecidas entre genes expressos diferencialmente a partir de quer o knockdown CT16 ou experiências superexpressão ( não mostrado).

Temos anteriormente excluída a possibilidade de que poderia CT16 se ligam directamente a sequências ricas em GC no ADN de cadeia dupla [19] de uma maneira semelhante como a sua parálogo Page4 [18]. Aqui, não poderia mostrar a localização de CT16 aos promotores imediatos de seus genes-alvo (Figura S6). Assim, o mecanismo de acção CT16, como a função da maioria dos outros X-CTA, permanece desconhecida.

Discussão

O tratamento eficaz de melanoma metastático é um importante problema não resolvido. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de obter novas informações sobre os mecanismos moleculares que regulam a sobrevivência e resistência a drogas em pacientes com melanoma. Resultados recentes de estudos clínicos têm gerado optimismo que num futuro próximo, novos fármacos específicos, tais como o ipilimumab [36] e inibidores BRAF [37], pode ser utilizado para parar a progressão de uma doença avançada. No entanto, muitos melanomas também parecem desenvolver resistência contra as novas moléculas de droga rapidamente, por vezes em meses [38].

Recentemente, relatou que a expressão de CT16 é frequentemente induzida em melanoma humano. Além disso, CT16 soro pode ser medido e utilizado para seguir a progressão da doença [16]. Aqui nós mostramos que CT16 protege células de melanoma contra a cisplatina (50? M) induziu a morte celular. complexos de platina se ligam ao ADN e de ligação transversal, o que leva a apoptose. Curiosamente, CT16 não conseguiram impedir a morte celular induzida por estaurosporina. A estaurosporina é um alcalóide que inibe a um amplo espectro de cinases de proteína [39], e, assim, podem activar a apoptose através de vários mecanismos diferentes [40]. As funções celulares da maioria dos CTA são desconhecidas, mas, além de CT16 também certas outras X-CTA têm sido associadas à sobrevivência celular. A transfecção de células de cancro do ovário por MAGE-A2 MAGE-A6 e pode induzir a resistência à doxorubicina e paclitaxel por um mecanismo desconhecido [41]. Além disso, GAGE-7 foi descrita para funcionar como uma proteína anti-apoptótica, em células HeLa [17], [42]. Mais recentemente, um antigénio do cancro da próstata associado, Page4, foi relatado para inibir a morte celular induzida por stress [18].

Com base na nossa análise do genoma ampla a expressão do gene, CT16 pode regular negativamente processos biológicos específicos, tais como a apoptose e a apresentação de antigénios para melhorar a sobrevivência de células de cancro. O mecanismo de acção CT16 parece ser, pelo menos parcialmente relacionado com o facto de que pode regular a expressão de genes apoptóticos e anti-apoptóticos, tais como metalotioneína 2A, IL-8 e DKK1. Estes três genes estavam entre os onze genes que foram encontrados para ser regulada por CT16 tanto no silenciamento e superexpressão experimentos CT16. A metalotioneína 2A é conhecido para proteger as células HeLa contra a morte induzida por ROS [30], enquanto que a IL-8 inibe TRAIL- e apoptose induzida por fármacos de células de cancro da próstata [33] e aumenta a tumorigenicidade e o potencial metastático de células de melanoma [32]. Mais interessante, CT16 foi encontrado para ser um regulador negativo de DKK1, um gene descrito para ser significativamente regulada negativamente em melanoma maligno [43]. DKK1 é um inibidor extracelular da via Wnt-sinalização anti-apoptótica [44], que pode induzir apoptose em células de melanoma [27]. Portanto, diminuição da expressão de DKK1 é considerado para ser um importante mecanismo de sobrevivência em células de melanoma. Quando analisamos 20 metástases de pele melanoma em sua expressão DKK1 e mRNA CT16, três amostras apresentaram níveis excepcionalmente elevados CT16 e concomitantemente muito baixa expressão DKK1. Assim, nossos dados sugerem que a superexpressão CT16 é um, mas provavelmente não o único mecanismo que leva à supressão DKK1 em melanoma. CT16 também aumenta a expressão da proteína de ligação de ácidos gordos 7 (FABP7), um promotor conhecido da progressão do melanoma [29].

O mecanismo exacto de como CT16 regula a expressão destes genes continua a ser estudada. Page4, um parálogo de CT16, foi recentemente mostrado para se ligar directamente ao ADN [18]. Além disso, tanto CT16 e Page4 proteínas são intrinsecamente desordenados [18], [19], [45]. No entanto, CT16 ligação a ADN não foi observada [19]. Portanto, apesar da homologia entre Page4 CT16 e o ​​mecanismo de acção podem diferir marcadamente entre estas duas proteínas. Além disso, excluímos os dois outros mecanismos conhecidos de ação CTA-X. Os nossos dados indicam que a p53 não mediar os efeitos de CT16 apesar do facto de as proteínas MAGE actua deste modo. Nem poderíamos detectar qualquer conexão entre a metilação do DNA e genes regulados CT16.

Para concluir, os progressos recentes no desenvolvimento da terapia medicamentosa contra o melanoma avançado levou a necessidade urgente de desenvolver novo biomarcador da progressão da doença. Temos sugerido, recentemente, que os níveis séricos CT16 poderia ser utilizada para monitorizar a eficácia do tratamento e recidivas putativos. Aqui, nós relatamos que CT16 também contribui para a patogênese da doença, regulando tanto por apoptose e genes anti-apoptóticos e promover a sobrevivência de células de melanoma. Portanto, CT16 é uma molécula-alvo putativo para o desenvolvimento de drogas que visa potenciar o efeito de indução de apoptose drogas.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Os estudos clínicos foram aprovados pela a placa de revisão institucional de Turku University Hospital, e cada paciente forneceu consentimento informado por escrito para participar nos ensaios e /ou para permitir que seus /suas amostras de tecido a ser utilizado para fins de investigação.

as linhas celulares e transfections

As linhas de células de melanoma A2058, SK-MEL-2, e WM-266-4 originalmente obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA) foram autenticadas pela Protecção da Saúde Agência Cultura Colecções (Porton Down, Reino Unido), utilizando STR método de análise. As linhas de células de melanoma foram mantidas em 5% de CO

2 e 37 ° C em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com soro bovino fetal a 10%. O ADNc CT16 incluindo o codão de paragem foi clonado por PCR a partir do vector de expressão para CT16 [16] e inseriu-se

Xba I e

Eco RI

sítios de plasmídeo pEXPR-IBA103 (IBA GmbH, Gottingen, Alemanha). Uma quantidade de 1 ug do CT16 de cDNA contendo ou intactos (controlo ADNc) pEXPR-IBA103 vector foi transfectado para as células WM 266-4 utilizando Fugene-6 Transfection Reagent (Roche, Basileia, Suíça) de acordo com as instruções do fabricante. Após incubação durante 48 h as células resistentes a G418 foram seleccionados por 0,8 mg /ml de G418 (Invitrogen). As células estavelmente transfectadas foram mantidas em meio contendo 0,2 mg /ml de G418.