Abstract

Um dos principais problemas na pesquisa do câncer é a falta de um modelo tratável para a metástase atrasada. Aqui demonstramos que as células cancerosas suprimidos por SISgel, um material ECM normais de formação de gel derivado de Intestino Delgado Submucosa (SIS), em xenoenxertos de flanco apresentam propriedades de supressão e re-activação que são muito semelhantes à metástase retardada normal e sugerem que estas células reprimidas pode servir como um modelo para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para segmentar micrometástases de cancro ou células reprimidas. Co-injecção com SISgel suprimiu o fenótipo maligno das células cancerosas da bexiga altamente invasivos J82 e células de câncer de bexiga JB-V altamente metastáticas em xenoenxertos rato flanco nus. Células poderiam permanecer viáveis ​​até 120 dias sem formar tumores e apareceu muito mais altamente diferenciada e menos atípica do que os tumores de células co-injetados com Matrigel. Em 40% dos xenoenxertos SISgel, o crescimento foi retomado no fenótipo maligno após um período de dormência supressão ou por pelo menos 30 dias e era mais provável que com o implante de 3 milhões ou mais células. colágeno tipo I ordinária não suprimir o crescimento maligno e tumores desenvolvido tão bem com colágeno como com Matrigel. Um sinal claro na expressão do gene ao longo de diferentes linhas celulares não foi observada por análise de transcriptoma de microarray, mas em contraste, Fase Reversa análise de proteínas de 250 proteínas por 4 linhas celulares identificadas Integrina Linked Quinase (ILK) de sinalização que foi funcionalmente confirmada por um inibidor de ILK. Sugerimos que as células cancerosas suprimidos em SISgel poderia servir como um modelo para a dormência e re-despertar para permitir a identificação de alvos terapêuticos para o tratamento de micrometástases

Citation:. Hurst RE, Hauser PJ, Kyker KD, Heinlen JE , Hodde JP, Hiles MC, et ai. (2013) Supressão e ativação do fenótipo maligno de Matriz Extracelular em xenoenxertos Modelos de cancro da bexiga: Um Modelo de Tumor Cell “dormência”. PLoS ONE 8 (5): e64181. doi: 10.1371 /journal.pone.0064181

editor: Hidayatullah G. Munshi, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Abril de 2012; Aceito: 12 de abril de 2013; Publicado: 24 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hurst et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado, em parte, pelas bolsas de investigação R01CA75322, R01DK69808, uma subvenção de Cook Biotech e uma bolsa da Cancer Center Stephenson (REH); R01 CA136944 e R43 CA135867 (MAI) e R43CA139804 (PJH). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: Robert Hurst, Paul Hauser, Kim Kyker e Michael Ihnat são todos os acionistas em DormaTarg, Inc. Michael Hiles e Jason Hodde são empregados por Cook Biotech. Nenhum dos outros autores têm interesses conflitantes. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A expressão do fenótipo maligno não é nem uma consequência imediata nem inevitável da mutação genes supressores de tumores ou oncogenes. tem sido desde há muito conhecido que, sem a remodelação da matriz extracelular (ECM), as células cancerígenas são capazes de formar tumores [1], [2] e que o próprio ECM contém elementos tanto antagonistas e agonistas do fenótipo maligno [1]. A importância da ECM recentemente tornou-se mais evidente à medida o fenómeno de dormência de células metastáticas foi reconhecido [3] – [5], e que o primeiro passo comprometido na metástase é a fuga de células micrometastáticas de factores inibitórios locais que tendem a favorecer continuou dormência [6], [7]. mucosa bucal em histopatologicamente normais Além disso, a descoberta de que as células com genomas anormais expressar antigénios associados a tumores em urotélio histopatologicamente normal, [8] ou células com mutações p53 característicos do tumor primário são encontrados [9] demonstra que as células cancerosas podem mascarar como células normais . A supressão das propriedades malignas de células com o potencial para a formação de tumores pode muito bem subjacentes ao período de latência do crescimento do tumor primário, bem como de recorrência local e distai retardada. Talvez “dormência” poderia contribuir para a razão que mesmo com novas terapias “alvo” e bilhões de dólares em pesquisa de câncer, a sobrevida global específico do cancro mudou pouco [10], [11]. células dormentes ainda não ter sido reconhecido como um alvo potencial, até recentemente, [12], e claramente tais células são resistentes à quimioterapia convencional por causa da eficácia muito limitada de quimioterapia adjuvante [3], [13]. O que é necessário é um sistema de modelo com o qual para investigar os mecanismos de supressão e activação de células cancerosas pelo ECM que também pode ser utilizado para identificar e testar drogas que têm como alvo as células cancerosas com supressão de ECM.

Anteriormente, demonstrou que o fenótipo de células cancerosas da bexiga foi radicalmente diferente em cultura organotípica 3-dimensional quando cultivada em uma preparação normal de matriz extracelular (SISgel), em comparação com a observada sobre uma preparação modulado-cancro permissiva matriz extracelular (Matrigel) [14]. SISgel é um material formador de gel acelular derivada de submucosa de intestino delgado porcino, enquanto Matrigel é uma preparação de membrana de base obtida a partir de um sarcoma de rato [15]. Quando cultivadas em matrigel, as células cancerosas da bexiga recapitulado o fenótipo descrito para o tumor original. Em agudo contraste, a maioria das propriedades malignas foram perdidos quando as células foram cultivadas em SISgel [14]. As linhas celulares derivadas a partir de papilomas cultivadas em SISgel formada uma estrutura em camadas que lembra urotélio normal, ao passo que linhas de células derivadas de tumores de grau superior formada uma camada não-invasivo de células [14]. Estes achados sugerem que o crescimento de células cancerosas no ECM normal poderia fornecer um modelo para investigar o fenômeno de supressão de malignidade por ECM normal e seu papel na metástase e recorrência.

Nesta comunicação nós exploramos se a supressão fenotípica visto na cultura organotípicas de células de câncer de bexiga em SISgel também é observado

in vivo

. Resultados positivos suportam o uso de SISgel como um modelo para a investigação do fenótipo de células de tumor dormente ou suprimidos e de mecanismos pelos quais o ECM normal, exerce uma influência inibitória sobre a tumorigénese e metástase. As descobertas sugerem fortemente que as interações de células cancerosas com ECM normal de desempenhar um papel importante na recorrência e metástase e ainda sugerem que a segmentação células reprimidas poderia representar um ponto inexplorado até então de vulnerabilidade na terapia do cancro.

Resultados

O fenótipo de uma das linhas celulares de cancro da bexiga agressivos cultivadas em SISgel, colagénio e Matrigel em cultura é ilustrado na Fig. 1. Um fenótipo invasivo, agressivo em Matrigel e colágeno é observada. Em Matrigel, as células invadidas, mas como uma frente, como é observada em tumores clínicos. Em colagénio, células individuais invadido, enquanto algumas células permaneceram à superfície do gel, e aqueles que invadiram tinha uma aparência mesenquimal. As células cultivadas sobre Matrigel também mostrou uma gama de tamanhos e orientações nucleares indicativos de um fenótipo agressivo. Este fenótipo contrasta marcadamente com o observado em SISgel, onde as células não invadir e formou uma camada na parte superior do gel. As células mostraram um fenótipo epitelial, e os núcleos foram mais uniformes e organizada indicativo de um fenótipo normalizada.

a perda da invasão e da aparência mais ordenada das células cultivadas em SISgel. Todas as ampliações são 200X. As imagens são representativas de um mínimo de 4 experimentos.

A seguir, determinar se a supressão de propriedades malignas visto na cultura 3-dimensional também foi observada

in vivo

em xenoenxertos de flanco. Os resultados típicos usando as células J82 estão ilustrados na Fig. 2. Uma imagem de fluorescência de células apenas depois da injecção é mostrado na Fig. 2A. O aparecimento de um tumor que cresceu a partir de células co-injectados com Matrigel é ilustrado na Fig. 2B. FIG. 2C mostra o resultado típico com células co-injectados com SISgel. As células permanecem como um ponto liso que brilha sob iluminação fracamente excitante, mas que geralmente não formam um tumor cresce e permanece visível por semana. Em alguns fracção destes xenoenxertos SISgel, no entanto, as células de escapar da supressão e começam a crescer como um tumor activo, como é ilustrado na Fig. 2D. Como é mostrado abaixo, a fracção que escapa para retomar o crescimento activo depende do número de células injectadas.

(A) células observado 24 horas após o implante. células (B) co-injetados com Matrigel observada após 60 dias mostrando tumor crescendo ativamente. (C) células co-injectados com SISgel observada após 50 dias mostrando células permanecem viáveis, mas não estão crescendo em um tumor ( “brilhante spot”). (D) As células co-injectados com SISgel que escapou após supressão inicial mostrada 60 dias após a injecção. As células permaneceu como um ponto brilhante (ver C) por 45 dias, em seguida, retomou o crescimento rápido como um tumor. Crescimento foi definida como dois aumentos consecutivos em tamanho.

Os tumores que se formaram a partir de células de co-injectados com Matrigel, colagénio I ou que escaparam a partir de células de co-injectados com SISgel foram examinados histopatologicamente em conjunto com um de as manchas de células fluorescentes reprimidas que não conseguiram desenvolver em um tumor em crescimento. Estes resultados, apresentados na Fig.3, confirmar que as células são suprimidos por SISgel. FIG. 3A mostra um corte típico a partir de células JB-V que cresceram em um tumor seguinte co-injecção com Matrigel. A aparência é a de um tumor agressivo com numerosos corpos apoptóticos e figuras mitóticas. As células são marcadamente pleiomorphic e altamente anaplásico, áreas de necrose de coagulação estão presentes e maioria das embarcações parecem anormais. A histopatologia de um dos patches reprimidas de células co-injectados com SISgel mostrado grosseiramente na Fig. 2C é apresentado na Fig. 3B. Em contraste com os tumores que crescem activamente, as células são mais diferenciadas, ou menos anaplásico pleiomorphic com navios normais que aparecem, muito poucas figuras mitóticas e evidência Mimal de áreas apoptóticas ou necróticas. FIG. 3C ilustra uma secção de um dos tumores que cresceram a partir de SISgel após um período de dormência de 8 semanas. O tumor é histologicamente semelhante à da fig. 3A e confirma que quando os tumores escapar de supressão, eles retomar num fenótipo agressivo. FIG. 3D mostra que as células co-injectados com colagénio também formar um tumor agressivo, que aparece com características semelhantes às Figuras 3A e 3B. Tricromo de colagénio em todos os tecidos revelou que no momento em que estes tumores ou manchas de células reprimidas foram recolhidas, o colagénio original na forma de co-injecção tinha desaparecido (não mostrado). A única colagénio discernível na Fig. 3B foi os vasos. FIG. 4 contrasta a expressão do marcador de proliferação, Ki67 e o marcador mesenquimal, vimentina em xenoenxertos de flanco e confirma a avaliação histopatológica apresentado na Fig. 3. Como se mostra, muito poucas células no tecido de células suprimidas estão no ciclo celular, e existe muito pouca expressão de vimentina. Em contraste, os tumores em crescimento activo foram caracterizados por um elevado nível de expressão de ambos, o que indica um fenótipo de crescimento agressivamente. Os tumores de células J82 foram muito semelhantes aos apresentados para as células JB-V em todos os aspectos.

características identificadas histologicamente são mostrados como se segue. Áreas de células malignas são delineados em preto, e áreas de necrose de coagulação são descritos em amarelo. Setas pretas ilustrar corpos apoptóticos. Setas amarelas identificar figuras de mitose. Ao nível de zoom mostrado aqui estes são difíceis de distinguir, mas foram identificados sob alta potência. (A) As células co-injetados com Matrigel que imediatamente apresentado um padrão de crescimento maligno. A descrição patológico observado grandes áreas de necrose coagulativa com inflamação aguda (células pequenas e densas são neutrófilos) com uma área de células atípicas que revelem pleomorfismo nuclear marcado, tudo indicativo de neoplasia de alto grau. (B) As células co-injectados com SISgel que permaneceu no fenótipo suprimida ou latente. Esta lâmina foi lida como células com atipia celular moderada e pleomorfismo com evidência mínima de coagulação necrose, mitose e apoptose. (C) As células co-injectados com SISgel que inicialmente apresentou um fenótipo suprimida durante 8 semanas, mas depois voltou a crescer no fenótipo maligno. Este foi lida como contendo uma área de necrose de coagulação com a inflamação aguda e focos de células atípicas marcadamente juntamente com a mitose e apoptose proeminente. Alguns campos continham células gigantes multinucleadas tumor geralmente indicativos de neoplasia de alto grau (D) As células co-injectados com colagénio I demonstrar um padrão de crescimento maligno semelhantes às ilustradas nos painéis A e C. Todas as imagens são a 400X.

células JB-V co-injetados com Matrigel e rotulados para Ki67 (a) e vimentina (C). células JB-V co-injectados com SISgel e no fenótipo suprimida rotulado para Ki67 (B) e vimentina (D). Os controlos, omitindo o anticorpo primário (não representado) foi inteiramente negativa para ambos os marcadores. Imagens em 200x.

Gráficos de Kaplan-Meier de que os dados são mostrados na Fig. 5A com um ponto de extremidade de iniciar o crescimento do tumor; que é, neste caso, “sobrevivência” é contado como a sobrevivência de um fenótipo suprimida. Porque todas as experiências continha controlos positivos de Matrigel com os mesmos números de células nas mesmas proporções que foram usadas para SISgel, Fig. 5A combina as experiências com números diferentes de células. Quando co-injectados com Matrigel, as células desenvolveram-se em tumores no prazo de 30 dias, em 100% dos animais, mesmo com apenas 250.000 células. Com SISgel, este claramente não foi o caso, e apenas cerca de 40% dos animais desenvolveram eventualmente tumores de crescimento depois de um atraso de entre quatro e até 18 semanas. A diferença de comportamento entre as células co-injectados com Matrigel e SISgel foi altamente significativa estatisticamente (p 0,0001). Um total de 70 xenoenxertos foram preparados a partir SISgel. Dos 60% de animais em que nenhum tumor desenvolvidos, muitas das células implantadas permaneceu como uma mancha fluorescente verde, embora em alguns casos o ponto já não era visível por várias semanas. Em dois xenoenxertos em que as células implantadas tinha aparentemente desapareceram, tumores reapareceram num animal de 12 semanas após a injecção inicial, enquanto que no outro animal um tumor em crescimento foi claramente formando por 15-16 semanas. Mesmo que, pelo menos, 95% das células estavam fluorescentes quando preparado, em dois casos, os tumores re-emergentes, não conseguiu expressar GFP como demonstrado por exame macroscópico, e em outro, o exame macroscópico revelou um mosaico de células fluorescentes e não fluorescentes. A re-emergência do fenótipo maligno é dependente do número de células, com mais tumores com maior probabilidade de ocorrer quando mais de 3 milhões de células são injectados do que quando menos de 3 milhões de células foram injectadas (p 0,0001) (Fig 5B.). Não houve diferenças perceptíveis no comportamento de células J82 JB-V e (p-valores das curvas de sobrevivência foram todos maior do que 0,2) embora as células JB-V tinha sido seleccionado para ser altamente metastático e para crescer preferencialmente na bexiga [ ,,,0],16].

(A) SISgel vs Matrigel. (B) Três ou mais milhões de células implantadas vs. menos de três milhões de células.

Nós também testamos se o gel co-injetados com as células do tumor foi dominante sobre o fenótipo de células de câncer alcançado em cultura. A Tabela 1 resume o crescimento de tumores de acordo com o ECM em que foram crescidas em cultura, bem como que o ECM foi co-injectados no flanco com células tumorais após crescimento em cultura em ECM. A co-injectado ECM em animais com as células de tumor da bexiga regido se formaram tumores, e o fenótipo estabelecida por ECM em que as células foram cultivadas foi superada pelo ECM co-injectado. Como esperado, as células que foram co-injectados com Matrigel uniformemente formado tumores de crescimento, independentemente da forma como elas tinham sido cultivadas em cultura. A co-injecção com SISgel suprimida células cancerosas da bexiga que estavam em crescimento activo e expressar completamente o fenótipo maligno em Matrigel

in vitro.

Interessantemente, as células cultivadas em Matrigel e co-injectadas com meio de cultura por si só não era capaz de tumor formação, apoiando ainda mais que a matriz local é mais importante do que o fenótipo das células no momento em que foram injectados. Nenhuma diferença de tamanho, taxa de crescimento ou a aparência bruta foi detectável entre tumores formados a partir de células que tinham sido cultivadas no fenótipo supressor sobre SISgel mas foram co-injectados com Matrigel, em comparação com células que tinham sido cultivadas em Matrigel ou de plástico e eram co- injetados com Matrigel.

Uma vez que o principal componente do SISgel é o colágeno I [17], nós também células J82 que tinham sido cultivadas em plástico com colagénio I. em contraste com SISgel co-injectado, colágeno I tumores cresceram rapidamente; e em oito dos 12 animais em três diferentes tumores experimentos cresceu dentro do prazo estabelecido para Matrigel. Nestes mesmos experimentos nenhum dos 12 animais co-injectados com SISgel desenvolveram tumores. A diferença entre as células de co-injectados com colagénio e SISgel foi altamente significativa (p = 0,0013), mas a diferença entre as células de co-injectados com colagénio e Matrigel não foi (p 0,05).

Investigou-se também mecanismo para a supressão pela comparação de expressão de genes e expressão de proteínas perfis de células cultivadas em SISgel com as mesmas células desenvolvidas em Matrigel. Os estudos de microarranjos foram essencialmente informativo, sugerindo que o fenômeno de supressão não é regulada ao nível da expressão do gene. Embora 243 genes foram expressas diferencialmente entre as células cultivadas em J82 SISgel vs Matrigel e 214 foram diferencialmente expressos por células JBV cultivadas sob as mesmas condições, houve muito pouca sobreposição. Apenas 11 genes eram comuns às duas listas, e nenhum foi consistentemente expressos diferencialmente entre matrizes na mesma direcção por ambas as linhas celulares. O exame das ontologias dos conjuntos de genes mostrou que o conjunto de genes diferencialmente expressos pelas duas linhas de células cultivadas sobre Matrigel ou SISgel eram diferentes ontologias. Conclui-se que a ausência de uma assinatura de expressão do gene consistente entre as diferentes linhas de células cultivadas em matriz de preparação diferente indica que as diferenças fenotípicas óbvias devem ser resultado de expressão diferencial ao nível da proteína em vez de no nível da regulação da expressão do gene.

análise de fase reversa matriz de proteínas (RPPA) proteína para 250 proteínas sinalizadoras chave identificou (Fig. 6A) uma assinatura consistente em todas as linhas de células 4. análise de caminho pelo IPA usando os nomes de genes mostrou o seguinte foram altamente envolvidos de forma significativa. PI3K /AKT Sinalização (p = 1,00 × 10

-8, MTOR, GSK3A, GSK3B, TNNB1, eIF4E), Insulina Receptor Signaling (p = 1,70 × 10

-8 BRAF, RB1, MTOR, GSK3B, CTNNB1 ) e ILK Sinalização (p = 9,12 × 10

-8 mTOR, IRS1, GSK3A, GSK3B, CTNNB1). O papel funcional de ILK foi confirmada utilizando um inibidor de molécula pequena de ILK, que mostrou que a inibição de ILK em células cultivadas em Matrigel J82 produziu um fenótipo não-invasiva muito semelhante ao observado quando as células foram cultivadas em SISgel como mostrado na Fig. 7. O fenótipo típico do tumor-invasiva como é visto na Fig. 7A com células J82 cultivadas em Matrigel. Em contraste, o fenótipo invasivo é abolida quando 10 QLT0267 uM é adicionado ao meio de cultura das células cultivadas sobre Matrigel (Fig. 7B). O fenótipo é semelhante ao observado quando as células são cultivadas em SISgel (Fig. 1), excepto que as várias camadas são formadas.

O símbolo (V) indica que o anticorpo foi validado para mostrar uma única banda por Western borrão. Um “P” indica que o anticorpo é contra uma forma fosforilada da proteína, com a posição do aminoácido e da identidade fornecida. As duas entradas de mTOR representam duplicatas. Uma lista completa dos anticorpos utilizados no momento da análise é fornecido como Tabela S1.

J82 células cultivadas sobre Matrigel, durante cinco dias, sem inibidor de ILK (topo) ou com 10 fiM QLT0267 inibidor de ILK (painel inferior). Nota supressão de invasão. Todas as ampliações são 200X. As imagens são representativos de 3 experiências.

Discussão

Quando uma célula cancerosa adquire o requisito permitindo que mutações cancerígenas ou um metastáticos escapes de células de circulação não deixa de ser em um ambiente normal que não é permissiva de crescimento tumoral devida a vários controlos redundantes, que funcionam de modo a diferenciar-se e inibem a replicação de células epiteliais [1], [2], [7]. Escape from estes controles normais provavelmente representa o primeiro passo, comprometida na formação de primário, localmente recorrente, e tumores metastáticos. Propomos que o modelo de cultura apresentado anteriormente [14] e o modelo de xenotransplante aqui apresentados representam um novo modelo para a investigação dos fenômenos importantes da supressão de malignidade e de dormência, e para a identificação de novas terapias para atacar metástase e recorrência em seu ponto mais vulnerável.

Este modelo capta vários elementos essenciais de supressão e reativação que sejam observadas clinicamente. O fenótipo maligno de linhas celulares de cancro da bexiga é suprimida por SISgel

in vitro

, e

in vivo

quando implantados com SISgel em xenoenxertos de flanco. Não só as células co-injectados com SISgel não conseguem crescer imediatamente como tumores (Fig. 2), mas na histopatologia são substancialmente normalizada em relação ao fenótipo em crescimento activo (Fig. 3B vs Figs. 3A, C e D). Além disso, a maioria das células não estão no ciclo celular e a expressão da vimentina é muito reduzido sobre o que é visto em tumores em crescimento activo (Fig. 4). Este não é apenas um efeito de crescimento supressiva generalizada de SISgel porque estudos anteriores mostraram que as células cancerosas semeadas em SISgel têm aproximadamente a mesma taxa de proliferação, como em Matrigel, e apenas como eles começam a chegar a confluência faz a taxa de proliferação lenta drasticamente [13 ]. Células co-injectados com SISgel pode permanecer suprimido por semanas ou mesmo meses, muito tempo depois da SISgel é absorvida, apenas para emergir como tumores de crescimento, como ocorreu com cerca de 40% dos implantes com SISgel. Nos restantes 60%, as células permaneceram viáveis ​​tanto como um ponto verde fluorescente ou desapareceram completamente. Três observações sugerem que o re-aparecimento de um tumor é devido a uma pequena população de células, em vez de grandes quantidades para a população. Em primeiro lugar, re-emergência foi positivamente correlacionada com o número de células implantadas (a Fig. 5B). Em segundo lugar, em dois casos, as células cancerosas humanas marcado com GFP aparentemente desapareceram, mas numa data posterior, após a injecção inicial da mancha reapareceu e cresceu em um tumor. Finalmente, dois tumores re-emergentes, não conseguiu expressar GFP e um era um mosaico de células-GFP expressando e não expressando. Por causa, pelo menos, 90-95% das células expressaram injectados GPF, os findins sugerem os tumores re-emergentes ou derivado por clonagem a partir de um número muito pequeno de células que ou deleção experiente do gene GFP a partir da sua posição de inserção no genoma ou nunca adquirida uma inicialmente. Em contraste, o crescimento do tumor imediata, rápida em Matrigel sugere a sobrevivência e o crescimento das células a granel sob estas condições permissivas e é inerente a uma fracção significativa das células injectadas.

Embora outros mecanismos podem estar envolvidos na produção de dormência ou supressão [4], [5], [18] – [21], o passo comprometido parece ser escapar da ECM supressora normal, [7], [22]. As conclusões confirmam nossa hipótese anterior de que o ECM exerce um efeito supressor

in vivo

com base na perda de propriedades malignas em SISgel

in vitro

[23]. O efeito supressor de SISgel não é devida à proteína dominante, colagénio I, ou a ausência de algum factor de SISgel necessário para adulto maligna porque os tumores formados com colagénio co-injectado I cresceu tão bem como eles cresceram quando co-injectada com Matrigel . Supressão pela SISgel parece estar ativo, e não passivo, em que algum fator na matriz extracelular normal, suprime ativamente o fenótipo maligno, como foi sugerido mais de 15 anos atrás por Renato Iozzo [1]. Pesquisas anteriores em nossos laboratórios sugeriu que, ao contrário das células epiteliais mamárias, α6β4 integrinas não estavam envolvidos [24]. Microarray e estudos proteômicos implicado redes complexas que envolvem o TGF-p, cMyc e uma série de fatores de transcrição [23], [25], [26]. Porque um gene assinatura coerente não pode ser identificado, é provável que um interruptor de proteína regula a conversão entre os fenótipos malignas e suprimidos. Os resultados RPPA sugere que a sinalização de ILK é envolvido, o qual é suportado pela descoberta de que a inibição de ILK em si impede invasão. Mais pesquisas serão necessárias para identificar o receptor e mecanismos de sinalização detalhadas.

Embora o fenômeno de supressão de malignidade é mais obviamente relacionada à metástase, as células cancerosas fenotipicamente reprimidas provavelmente também desempenham um papel importante na recidiva local. Embora alguns 80-85% dos cancros da bexiga, inicialmente, não são muscular invasiva, a taxa de recorrência local, até 70% em alguns estudos [27], com algum 15-25% progredindo para doença invasiva músculo mortal [27] cria uma grande clínica problema. Recorrências em cicatrizes, onde as margens estavam livres de tumor é provavelmente não devido a uma falha para detectar células tumorais francas na avaliação histopatológica original, mas é o resultado da promoção de células suprimida pelo microambiente cicatriz [28]. Além disso, encontrar células com conteúdo de DNA aberrante e expressão de biomarcadores em urothelium morfologicamente normais [8] em pacientes com câncer de bexiga apoia fortemente a hipótese de que a supressão ECM-modulada do fenótipo maligno ocorre

in vivo

. Identificar e beneficiar essas células poderia proporcionar um grande avanço na terapia de câncer de bexiga. Achados semelhantes em cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas sugerem que o problema pode ser mais geral [9].

Enquanto a supressão de malignidade por ECM normal, provavelmente opera em geral e é de importância para o pathobiology de cancro da bexiga humana, a compreensão o mecanismo de supressão pode identificar novos alvos para o controle não só de cancro da bexiga, mas outros tipos de tumores com micrometástases atrasadas ou recorrência local. Tanto o

in vitro

e

in vivo

modelos aqui apresentados devem ser úteis na identificação desses mecanismos e no fornecimento de modelos tratáveis ​​para a identificação de novas drogas para alvejar as células cancerosas reprimidas pela matriz extracelular normal. Impedindo a metástase atrasada poderia salvar milhares de vidas por ano.

Materiais e Métodos

Proteína Fluorescente Expressando células cancerosas da bexiga

A linha de células JB-V foi derivado do TCC J253 a linha (ATCC, Manassas, VA) por C. Dinney [16] para ser altamente metastático. A linha é uma linha J82 TCC agressivo obtido a partir do ATCC. As células foram transf ectadas com retrovírus pLEGFP-C1 (Clontech, Mountain View, CA), preparados por co-transfecção da linha celular de empacotamento GP2-293 (Clontech, Mountain View, CA) com o vector de pVSV-L (Clontech, Mountain View, CA ) que contém um gene de envelope viral. Os sobrenadantes das células de empacotamento que contêm o vírus infeccioso foi recolhido a cada 24 horas durante 4 dias. células alvo fluorescentes foram feitas através da infecção de JB-V e linhas de células J82 urothelial carcinoma de células de transição com 1 ml de, fresco sobrenadante contendo vírus /poço contendo 100.000 células-alvo juntamente com 8 ug /ml de polibreno (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Cada aplicação do sobrenadante virai foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,4 um antes da aplicação às células-alvo. O sobrenadante foi removido e meios contendo vírus frescos repostos em células alvo a cada 24 horas até 4 mudanças de meios foram concluídos. meio contendo o vírus, foi substituído por Meio Essencial Mínimo, MEM, (Life Technologies, Carlsbad, CA) contendo 1% de ácidos não essenciais aminoácidos, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sódio e 10% de soro fetal de vitelo e as células foram deixadas crescer a 90% de confluência. transfects estáveis ​​foram selecionados através de uma triagem sequencial e enriquecimento de células fluorescentes de citometria de fluxo.

cultura de células em ECM

matrizes de gel foram feitas por camadas quer 0,8 ml de gelo frio Matrigel (Becton-Dickinson , Bedford, MA), SISgel, ou colagénio do tipo I (BD Biosciences, San Jose, CA) para membranas de tereftalato de polietileno de 6 poços inserções de cultura celular (Falcon, Becton-Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ), que foram então deixadas a gel a 37 ° C. SISgel foi preparado quer por submucosa de intestino solubilizado que nos é fornecida por Cook Biotech (West Lafayette, IN) ou material que nos preparado a partir decelularizado submucosa do intestino delgado, utilizando técnicas estabelecidas [29]. Resumidamente, solo SIS foi parcialmente digerido com pepsina a pH 2,8 a 4 ° C durante 12 dias. Isso representa uma otimização; muito pouco digestão e as formas materiais coágulos em vez de gelificação, e a digestão excessivo produz um material que não de gel. A pepsina foi inactivada aumentando o pH para 10 e incubando o gel a 4 ° C durante 2 horas, seguido por redução do pH para 4 com HCl 6N. O produto foi dialisada contra 10 mM de HCl e esterilizado com CHCl

3, o qual foi, em seguida, dialisada contra 10 mM de HCl. Para formar um gel, o material foi misturado com 1/10

th volume de 10X de solução salina tamponada com fosfato e uma pequena quantidade de vermelho de fenol para ajudar com ajuste do pH. O pH foi ajustado para 7,4 com NaOH 1 M estéril, utilizando um padrão de cor visual que foi verificado em relação um medidor de pH. geles de colagénio foram preparados por mistura de colagénio de cauda de rato, tipo I com 1/10

th volume de PBS 10X, ajustando o pH para 7,4 ± 0,1, e, em seguida, 0,8 ml de camadas em inserções Transwell como descrito acima. As células foram mergulhadas em qualquer Matrigel, SISgel ou colagénio a uma concentração de 5 × 10

5 células /200 meios ul, e 2 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM, Life Technologies, Carlsbad, CA) contendo 1% de penicilina, estreptomicina e 10% de soro fetal de vitela foram mergulhados abaixo da Transwell suporta em placas de 6 poços, como descrito [14]. As culturas foram cultivadas durante 6 dias com mudanças de meio a cada dois dias. As culturas foram removidas das transwells, fixados em formalina a 1% depois de sobreposição com agarose ou SISgel para evitar a perda de células em corte de secções. Secções (5 mm) foram coradas com hematoxilina e eosina. (https://www.affymetrix.com/browse/level_seven_software_products_only.jsp?productId=131414 categoryId=35623#)