Abstract

Neste estudo, foi realizada uma meta-análise em dados de expressão de genes de alto rendimento para identificar TNF

–

genes mediada por alfa implicados no câncer de pulmão. Em primeiro lugar, investigou os perfis dos dois modelos independentes murino TNF-α /TNFR KO de expressão gênica. A via de sinalização do receptor de EGF foi topo via associado com genes mediadas por TNF-α. Depois de combinar os genes de ratinho de TNF-ct mediada por aos seus ortólogos humanos, foram comparados os padrões dos genes de TNF-ct mediada por em tecidos normais e tumorais pulmonares obtidas a partir de seres humanos de expressão. Com base nos genes TNF-alfa-mediada que foram desregulados em tumores de pulmão, foi desenvolvido um gene assinatura de prognóstico que efetivamente previu a sobrevida livre de recorrência no câncer de pulmão em duas coortes de validação. testes de reamostragem sugeriu que o poder prognóstico da assinatura gene não foi por acaso, e análise multivariada sugeriu que este gene assinatura foi independente dos fatores clínicos tradicionais e melhorado a identificação de pacientes com câncer de pulmão em maior risco de recorrência.

Citação: Wang B, Song N, Yu T, Zhou L, Zhang H, Duan L, et al. (2014) Expressão de Genes de Tumor Fator de Necrose Alpha mediada prevê recorrência-Free sobrevida no câncer de pulmão. PLoS ONE 9 (12): e115945. doi: 10.1371 /journal.pone.0115945

editor: Renato Franco, Istituto dei Tumori Fondazione Pascale, Itália |

Recebido: 24 Julho, 2014; Aceito: 26 de novembro de 2014; Publicação: 30 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo projecto 61271054 da National Science Foundation Natural da China e também foi apoiado por KYZ201320 projeto dos Fundos investigação fundamental para a Universidades centrais. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Tong Yu e Miao Zhu, dois dos autores do manuscrito, estão atualmente filiados com Nanjing Decode Genomics Biotechnology Corporation. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é uma citocina inflamatória pleiotropic envolvido em sistémica inflamação que estimula a reacção de fase aguda. Esta citocina afeta mais órgãos humanos e está envolvida numa variedade de processos biológicos, incluindo a proliferação celular, diferenciação, apoptose, metabolismo lipídico e da coagulação [1], [2], [3]. TNF-α também serve como um mediador em diversas patologias, tais como choque séptico, rejeição de transplantes, esclerose múltipla, diabetes, artrite reumatóide, traumatismo, malária, meningite, e síndrome de dificuldade respiratória do adulto [4].

A papel do TNF-α em cancros humanos é mais complicado [5], [6]. TNF-α tem um papel duplo na indução e progressão tumoral [7]. TNF-α pode facilitar a geração e a manutenção de respostas imunitárias anti-tumorais através da activação de células assassinas naturais e células T CD8 [7], [8]. TNF-α também inibe a vascularização induzida por tumores por danificar a vasculatura associada ao tumor [9]. Além disso, o TNF-α pode afectar directamente as células tumorais, aumentando enzimas lisossomais e induzir a libertação do citocromo c das mitocôndrias e apoptose [10].

Apesar de o TNF-α tem actividade antitumoral, existe evidência crescente de que sugere que endógena TNF-α actua como um promotor de tumor. TNF-α tem sido conhecido por contribuir para a inflamação crónica e promoção do tumor formação, crescimento e metástase [7], [11]. Também tem sido observado que o TNF-α nocaute (KO) foram mais resistentes a carcinogénese química de tumores da pele [12], [13]. Além disso, ratinhos deficientes em TNF receptor de tipo 1 (TNFR-1) e TNF receptor de tipo 2 (TNFR-2) eram resistentes ao desenvolvimento de tumores da pele [14], e knockdown de TNF-α em linhas celulares de cancro do ovário levou à diminuição crescimento e densidade vascular [15]. Mais recentemente, Pitroda et ai. examinaram o papel da inflamação estromal mediadas pelo TNF-α no crescimento do tumor. Eles descobriram que a ruptura de estroma de TNF-α sinalização significativamente prejudicado o crescimento de tumores em receptores TNF-α ratinhos (TNFR) KO comparada com a de tipo selvagem (WT) ratos [16]. Com base neste modelo experimental de dados inflamação TNF-α-mediada e de expressão de genes de alto rendimento, que também desenvolveu um gene assinatura de prognóstico que previu a sobrevida global em cancros humanos [16].

O cancro do pulmão é o mais frequentemente diagnosticado cancro e é a principal causa de morte por câncer em homens, que compreende 17% do total de novos casos de câncer e 23% do total de mortes por câncer [17]. Neste estudo, foram realizadas meta-análise em dados de expressão de microarranjo de alto rendimento para identificar o TNF

– genes associados-a

que foram implicados no cancro do pulmão. Primeiro, identificamos os genes potencialmente regulados pelo TNF-α e TNFR. Usando dois conjuntos de dados de microarranjos independentes, que caracterizou os genes comuns desregulados em camundongos KO e TNFR KO TNF-α. Nós considerado destes genes como genes de TNF-ct-associado. Em segundo lugar, foi desenvolvido um gene assinatura prognóstico derivada a partir dos genes de TNF-ct-associado, e que corresponde aos genes de TNF-ct em associada-rato para os seus ortólogos humanos. Em seguida, comparou a expressão dos genes de TNF-ct-associado em tecidos humanos normais e de tumores de duas coortes de cancro do pulmão. Dezassete genes de TNF-α-associados foram identificados como sendo expressos diferencialmente vulgarmente entre os dois grupos; portanto, esses genes compôs um preditor resultado câncer de multi-molecular. Esta assinatura molecular efetivamente previu a sobrevida livre de recorrência no câncer de pulmão e foi independente dos fatores prognósticos clínicos e patológicos padrão.

Resultados e Discussão

genes TNF-associado-a

o primeiro investigados os genes potencialmente reguladas pelo TNF-α e seus receptores. TNF-α liga dois receptores, o TNFR1 e TNFR2. TNFR1 é expressa na maioria dos tecidos, ao passo que TNFR2 é encontrada apenas em células do sistema imunitário. Dois conjuntos de dados de microarranjos independentes contendo informações expressão gênica tanto para WT e TNF-α /mice TNFR KO foram coletadas a partir do Gene Expression Omnibus (GEO) do banco de dados [18]. Foram comparados os padrões de tumores gástricos do WT e KO de TNF-α (GEO adesão ID: GSE43145) expressão dos genes e de melanomas de camundongos WT e TNFR KO (GEO adesão ID: GSE33253) [16]. Em um taxa de 5% falsa descoberta (FDR), 390 genes eram comumente-regulada em comparação com ratinhos WT em ambos os conjuntos de dados (S1 tabela). Em contraste, 305 genes foram encontrados para ser geralmente regulada para baixo em comparação com ratinhos WT (S1 tabela). Foram consideradas estes genes desreguladas genes de TNF-α-mediadas. análise de caminho usando o banco de dados PANTHER [19] indicou que a via de topo associada a esses genes desregulados foi o “receptor via de sinalização EGF” (

P

= 0,029 pelo teste exato de Fisher) (S2 Table), o que sugere um forte relação entre o TNF-α e receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR). O EGFR é um membro da família de receptores ErbB. Alteração na expressão de EGFR podem resultar em câncer [20], incluindo câncer de pulmão, câncer anal, e glioblastoma multiforme. TNF-α é um regulador central de múltiplas vias de sinalização inflamatórias, e um alvo importante de TNF-α pode ser a via de sinalização a jusante de EGFR [21]. De facto, o TNF-α tem sido mostrado induzir transactivação de EGFR em uma variedade de células [22], [23], [24].

Para determinar se os genes de TNF-ct mediada por derivados de ratinhos eram relevantes a cancros humanos, nós combinamos os genes de rato TNF mediada-a para 651 orthologs humanos distintos. Em seguida, analisamos os padrões desses genes humanos TNF mediada-a no câncer de pulmão de expressão. Nós exploramos a diferença na expressão genética entre os tecidos normais e tumorais em duas coortes de câncer de pulmão independentes da Espanha (ES [GEO adesão ID: GSE18842]) [25] e Taiwan (TW [GEO adesão ID: GSE19804]) [26]. Um teste-t emparelhado foi utilizado para identificar os genes expressos diferencialmente entre os tecidos normais e de tumor (Fig. 1). No total, 232 genes de TNF-α mediadas foram identificados como sendo expressos comumente diferencialmente entre os tecidos normais e tumorais (ajustado

P

0,05 e dobre mudança 1,25) em ambos os grupos (S3 Tabela). Cento e vinte e nove genes de TNF-α mediadas foram regulados positivamente em tecidos de tumor, enquanto que 103 genes de TNF-α mediadas foram regulados negativamente (Tabela S3). Para investigar em quais categorias funcionais destes genes caem, realizamos gene análise ontologia usando o banco de dados GO [27]. Descobrimos que estes genes foram significativamente enriquecida por GO termos de processos biológicos, tais como “processo de macromolécula catabólico”, “aminoacila�o tRNA” e “processo catabólico proteína dependente de ubiquitina” (S4 Tabela).

Emparelhado normal e tecidos tumorais de pacientes com câncer de pulmão nas coortes ES e TW foram incluídos na comparação. Eixo Y: valores de expressão transformou-log2

Uma assinatura de 17 gene prediz sobrevida livre de recidiva do cancro do pulmão

Nossa hipótese é que o 232 diferencialmente expressos TNF-α-mediada. genes pode prever o resultado tumor no câncer de pulmão. Univariada de Cox de regressão contra a sobrevida livre de recidiva foi realizada através do conjunto 232-gene em uma coorte de treinamento da Coreia (KR [ID adesão GEO: GSE8894]) [28]. Apenas os genes com valores absolutos da estatística de Wald (razão entre o coeficiente de regressão para o seu erro padrão) maior do que dois foram mantidos. No total, foram identificados 17 genes TNF-alfa-mediada associados com o cancro do pulmão sobrevida livre de recorrência no grupo de treinamento. Nós designados os 17 genes TNF mediada-a como a assinatura de 17 genes (Fig. 1 e Tabela 1).

Foi aplicado um sistema de pontuação para atribuir a cada paciente um escore de recorrência que era um linear combinação da expressão do gene da assinatura 17-ponderados pelos coeficientes obtidos a partir da coorte formação (ver os métodos para detalhes) [16], [29], [30], [31]. O peso de cada gene é apresentado na Tabela 1. Os pacientes positivos de 17 genes foram definidos como aqueles que têm uma recorrência pontuação maior do que a média do grupo. Como esperado, houve uma sobrevivência significativamente reduzida livre de recorrência para os pacientes 17-gene-positivos na coorte de formação (Fig. 2). Os pacientes positivos de 17 genes tinham um risco significativamente aumentado de recorrência de 2,95 vezes na coorte KR (Tabela 2).

A pontuação recorrência da assinatura de 17 gene prediz mau resultado clínico em câncer de pulmão. As curvas são pretos para os pacientes-17-gene-assinatura positivo, enquanto que as curvas são cinzentos para os pacientes 17-gene-assinatura-negativas. Os pacientes de 17 gene-signature-positivos foram definidos como aqueles que têm uma recorrência pontuação maior do que a pontuação média do grupo.

P

-Valores foram calculados usando testes de log-rank para as diferenças na sobrevivência. O painel esquerdo mostra a coorte de formação (KR), enquanto os painéis meio e da direita mostram as coortes de validação (JP e SE).

A seguir, investigaram o poder prognóstico do escore de recorrência foi determinado usando o assinatura 17-gene em coortes de validação independentes. Duas coortes de validação do Japão (JP [GEO adesão ID: GSE31210]) [32] e Suécia (SE [GEO adesão ID: GSE37745]) [33] foram recolhidos. Kaplan-Meier análise de sobrevivência demonstraram uma sobrevivência significativamente reduzida livre de recorrência para os pacientes de 17 gene-positivos nas coortes de validação (

P

= 5,4 × 10

-5 para a coorte JP e

P

= 0,011 para a coorte SE pelo teste de log-rank) (Fig. 2). Univariada de Cox regressão indicado que os doentes 17-gene-positivos tiveram um aumento significativo do risco de recidiva de 2,67 vezes na coorte JP e de 2,08 vezes na coorte SE (Tabela 2). Estes resultados indicaram que a assinatura 17-gene é preditiva de sobrevivência livre de recidiva em cancros do pulmão.

Investigou-se também o poder de prognóstico para cada gene no interior da assinatura 17-gene na coorte JP, que é o maior coorte neste estudo. Os pacientes foram estratificados em dois grupos de acordo com o nível de cada gene expressão, usando a mediana como ponto de corte. Foram identificados três genes,

HNRNPAB

,

PPIL1

, e

SRPK1

, que pode ser usado para prever a sobrevida livre de recidiva individualmente (ajustado

P

.. 0,05 pelo teste de log-rank) (S1 Fig)

na verdade, entre o conjunto de 17 genes,

ABCE1

,

CKS1B

,

HNRNPAB

,

PCDH7

,

PPIL1

, e

SRPK1

já foram relatados a desempenhar um papel importante na patogênese do câncer. Por exemplo, o silenciamento

ABCE1

por pequeno ARN interferente pode inibir a proliferação e invasão de linhas celulares de cancro do pulmão de células pequenas [34].

CKS1B

-depleted células cancerosas da mama não só exibem retardaram G (1) a progressão, mas essas células também se acumulam no G (2) -M devido à entrada mitótico bloqueada [35].

HNRNPAB

foi encontrado para ser sobre-expressos em células e tecidos tumorais altamente metastático de pacientes com carcinoma hepatocelular com a recorrência [36].

PCDH7

foi regulada em tecidos de cancro da mama com metástases ósseas, e supressão do

PCDH7

proliferação de células do cancro da mama inibida, migração e invasão in vitro [37].

PPIL1

foi observada frequentemente a ser sobre-expressos em células de cancro de cólon em comparação com células não cancerosas epiteliais da mucosa do cólon [38]. Mais interessante, expressão aberrante

SRPK1

em qualquer direção pode promover o câncer por interferir com desfosforilação PHLPP mediada da Akt [39]. Neste estudo, demonstramos que mesmo que o poder prognóstico da assinatura 17-gene é superior, os genes individuais, tais como

HNRNPAB,

PPIL1

, e

SRPK1,

podem ser usados ​​como biomarcadores individuais para prever a sobrevida livre de recidiva.

teste resampling para a assinatura de 17 genes

Foi realizado um teste de resampling para determinar se o poder preditivo da 17- gene assinatura foi significativamente melhor do que o de conjuntos de genes aleatórios. Construiu-se 1.000 assinaturas de genes ao acaso, cada um contendo 17 genes que foram escolhidos aleatoriamente a partir do genoma humano. Os escores de recorrência foram calculados com base nas assinaturas genéticas ao acaso, e univariada de Cox de regressão de sobrevivência foi realizada para cada assinatura gene refeita. A associação entre cada gene assinatura aleatória e sobrevida livre de recorrência foi medida usando a estatística de Wald. A nossa hipótese alternativa é que o valor da estatística de Wald nossa assinatura 17 do gene deve ser mais elevado do que o das assinaturas de genes ao acaso, se a assinatura 17-gene era mais preditiva do que as assinaturas ao acaso. FIG. 3 indica que a estatística de Wald da assinatura 17 do gene foi significativamente maior do que a das assinaturas de gene randomizados (

P

= 0,045 para o grupo JP e

P

= 0,009 para o grupo SE ), o que sugere que a associação entre a assinatura de 17 genes e sobrevida livre de recorrência não é por acaso.

os losangos pretos indicam as estatísticas Wald da assinatura de 17 genes. Os histogramas cinzentas mostram a distribuição das estatísticas de Wald para as 1.000 assinaturas genéticas reamostrados com tamanho idêntico sob a hipótese nula de não associação entre a assinatura de 17 genes e sobrevida livre de recorrência.

A publicado anteriormente estudo de Venet et al. comparado 47 prognósticos assinaturas cancro da mama para assinaturas de genes aleatórios [40]. Verificou-se que ~ 60% das assinaturas não foram significativamente melhores do que as assinaturas preditore randomizados de tamanho idêntico, e ~ 23% eram piores preditores do que o assinatura aleatória mediana [40]. Portanto, não é possível concluir que um mecanismo em particular está associada com o cancro humano da constatação de que um gene assinatura para este mecanismo prediz a evolução do cancro, porque a maioria das assinaturas randomizados fazer [40]; No entanto, aqui, indicam que a nossa assinatura de 17 genes supera esse problema.

A análise multivariada

Nós investigamos o desempenho da assinatura de 17 genes em comparação com fatores clínicos associados com a evolução do cancro do pulmão . Para o grupo JP, consideramos fatores incluindo a idade do paciente, sexo, história de tabagismo, palco,

EGFR

/

KRAS

/

ALK

status de alteração do gene, e nível de proteína Myc . No JP coorte, palco e

EGFR

/

KRAS

/

ALK

status de alteração do gene pode prever individualmente sobrevida livre de recidiva (S2 Fig.). Para o grupo SE, tomamos idade, sexo, e estágio em conta. No entanto, nenhum destes factor na coorte SE pode prever individualmente sobrevida livre de recorrência. A multivariada de Cox de regressão de sobrevivência indicou que o status da assinatura de 17 gene permaneceu covariável significativa em relação aos fatores clínicos em cada coorte de validação (

P

= 3,4 × 10

-3 para o JP coorte e

P

= 2,5 × 10

-2 para a coorte SE) (Tabela 3). Na coorte JP, idade do paciente, palco, e

EGFR

/

KRAS

/

ALK

status de alteração também foram variáveis ​​significativas. No entanto, na coorte SE, o status da assinatura 17 do gene era o único covariante significativa no modelo multivariado (Tabela 3). Estes resultados sugerem fortemente que a assinatura de 17 gene é largamente independente dos fatores clínicos tradicionais e melhora a identificação de pacientes com câncer de pulmão em maior risco de recorrência.

A assinatura de 17 genes foi derivado de um método em vez de triagem do genoma inteiro “conduzido de hipóteses”. Tradicionalmente, o poder prognóstico de genes individuais no genoma humano foi testado um por um. Os genes com a melhor significância estatística seriam retidos e usados ​​como biomarcadores de cancro. No entanto, as assinaturas de genes estatisticamente derivados de triagem do genoma são muitas vezes altamente precisas nas coortes descoberta de que foram identificados, mas a maioria deles não foram validados como ferramentas úteis clínicos [41], [42]. Neste estudo, a primeira hipótese de que o TNF-α está implicado no cancro do pulmão. Em seguida, pré-identificados os genes que são potencialmente mediadas por TNF-α /TNFR utilizando ratinhos TNF-a /TNFR KO. A análise multivariada indica que este método “bottom-up” produz um gene definido com poder preditivo promissor, que acrescenta valor prognóstico para os achados clínicos e patológicos no câncer de pulmão.

Conclusões

Nós investigamos o gene perfis de expressão de dois modelos murinos independentes TNF-α /TNFR KO. A via de sinalização de EGFR foi encontrado como sendo o topo via associado com genes mediadas por TNF-α. Com base nos genes de TNF-ct mediada por encontrados nos modelos murinos, foi desenvolvido um gene assinatura prognóstico que efectivamente prevista de sobrevivência livre de recorrência do cancro do pulmão em duas coortes de validação. Ao trabalhar cooperativamente com fatores clínicos tradicionais conhecidos, a assinatura de 17 gene pode aumentar a precisão da previsão para a identificação de pacientes com maior risco de recorrência.

Métodos

processamento de dados Microarray

Todos os dados de microarray analisados ​​neste estudo foram obtidas da base de dados GEO [18]. A média de pastilhas múltiplas (GCRMA) algoritmo robusto de GC [43] foi usada para resumir a nível de cada sonda para definir os dados de microarray expressão. A análise de significância de microarranjos (SAM) algoritmo [44] foi utilizado para identificar os genes expressos diferencialmente entre WT e TNF-a ratinhos /TNFR KO. Um teste-t emparelhado foi utilizado para detectar os genes expressos diferencialmente entre os tecidos do pulmão humanos normais e tumorais.

P

-Valores foram ajustados usando o procedimento Benjamini-Hochberg.

sistema de pontuação de risco

Para o grupo de treinamento (KR), univariada de Cox de regressão foi utilizada para avaliar a associação entre a sobrevida livre de recidiva e expressão gênica. Uma pontuação recorrência foi então calculada para cada paciente, usando uma combinação linear de expressão do gene que foi ponderada pela estatística de Wald (razão entre o coeficiente de regressão para o seu erro padrão), como mostrado abaixo [16], [29], [30], [31]:

Aqui,

S

é a pontuação recorrência do paciente;

N

é o número de genes;

Z

i

denota a estatística de Wald de gene

i

(listadas na Tabela 1);

e

i

denota o nível de gene

i

expressão; e

μ

i

e

τ

i Quais são a média eo desvio padrão dos valores de expressão de genes para o gene

i

em todas as amostras. Os pacientes foram divididos em grupos positivos e negativos, com a mediana da pontuação recorrência como o ponto de corte. Uma pontuação maior recorrência implicava um mau resultado. O sistema de pontuação e os coeficientes escala associados foram fixados com base nos grupos de formação e, em seguida, avaliada em coortes de validação [16], [29], [30], [31].

ferramenta estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas pela plataforma R. A biblioteca de “sobrevivência” foi utilizada para fazer análise de sobrevivência. A significância estatística entre duas curvas de Kaplan-Meier foi determinada pelo teste log-rank usando a função “survdiff”. Ambos uni e multivariada de Cox de regressão foi realizada pela função “coxph”.

Informações de Apoio

S1 Fig.

A expressão de

HNRNPAB

,

PPIL1

, e

SRPK1

prediz sobrevida livre de recidiva individualmente. Os pacientes do grupo JP foram estratificados em dois grupos de acordo com o nível de cada gene expressão, usando a mediana como ponto de corte. As curvas pretas são para os pacientes a expressão gênica mais elevados do que a média, enquanto as curvas de cinza são para os outros pacientes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115945.s001

(PDF)

S2 Fig .

Palco e

EGFR

/

KRAS

/

ALK

gene status de alteração prever individualmente sobrevida livre de recorrência no grupo JP. O painel da esquerda é para estágio. A curva preta é para os pacientes com estágio II, enquanto a curva de cinza é para os pacientes com estágio I. O painel da direita é para o status de alteração do gene. A curva preta é para os pacientes sem alterações, enquanto a curva de cinza é para os pacientes com alteração.

P

-Valores foram calculados usando testes de log-rank para as diferenças na sobrevivência

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115945.s002

(PDF)

S1 Table.

Os genes diferencialmente expressos comumente entre WT e TNF-α /mice TNFR KO

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115945.s003

(XLSX)

S2 Table. .

Os 10 melhores caminhos PANTERA associados com os genes desregulados em camundongos TNF-a /TNFR KO

doi: 10.1371 /journal.pone.0115945.s004

(XLSX)

S3 Tabela.

TNF-alfa mediada por genes que são diferencialmente expressos entre os tecidos normais e tumorais

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115945.s005

(XLSX)

S4 Table.

Os termos de processo biológico GO associados com os genes TNF-alfa-mediada que estão desregulados em tecidos tumorais

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115945.s006

(XLSX)