Abstract

células-tronco cancerosas (CSCs) são um pequeno subconjunto de células cancerosas responsáveis ​​pela manutenção e progressão de vários tipos de câncer. O isolamento, propagação, e a diferenciação das CSCs nos nichos estaminais adequadas expor as dificuldades inerentes para estudos posteriores. Aqui nós mostramos que o câncer induzido como as células-tronco (iCLSCs) pode ser gerado pelo

in vitro

manipulação oncogénica de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) com elementos oncogênicos bem definidas; SV40 LTG e H

ras

V12 usando um mouse vírus da haste longa repetição terminal (MSCV-LTR) -com base sistema retroviral. Os mESCs reprogramadas usando ambos os oncogenes foram caracterizados por meio de sua expressão do gene oncogênico, o aumento da proliferação e manutenção sem entraves de propriedades estaminais

in vitro

e

in vivo

. Além disso, estas células transformadas, resultou na formação de, teratoma do ovário imaturos malignas

in viv o

. Para expandir ainda mais com êxito essas propriedades para outros órgãos e espécies, mais pesquisa precisa ser feito para compreender plenamente o papel de um microambiente favorável tumor-. Nosso estudo forneceu uma nova abordagem para gerar induzida por câncer como células-tronco através de

in vitro

reprogramação oncogênico e formação de tumor maligno específico do órgão iniciou com sucesso em um modelo animal cancer pequena ortotópico.

Citation : Cho S, Parque H, Jarboe eA, Peterson CM, Bae YH, janat-Amsbury MM (2015) projeto e Caracterização de células-tronco de bioengenharia como o câncer. PLoS ONE 10 (10): e0141172. doi: 10.1371 /journal.pone.0141172

editor: Masaharu Seno, Universidade de Okayama, Japão

Recebido: 21 de julho de 2015; Aceito: 03 de outubro de 2015; Publicação: 21 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Cho et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a teoria hierárquica da organização de câncer sugere que apenas um pequeno subconjunto de células é responsável pela iniciação e continuação do crescimento do câncer [1-3]. Essas pequenas populações de células foram definidos como cancro de células estaminais (CSCs). Entre outros, exibem características CSCs, como a auto-renovação e a capacidade de diferenciação em células cancerosas heterogêneos e tumorigênicos [1, 4]. CSCs putativos de vários tumores, incluindo o cérebro, mama e câncer de ovário foram isolados até à data com base na sua expressão de moléculas ou combinação de marcadores celulares (por exemplo, CD133, CD44, ALDH) [5-9] específicas. O potencial tumorigénico destas células tem sido demonstrada em vários estudos de xenoenxerto utilizando ratinhos imunocomprometidos [5, 6, 10]. No entanto, uma melhor caracterização das propriedades e capacidades dos CSCs têm sido prejudicados pelas dificuldades intrínsecas de isolar populações CSCs puros, propagação destas CSCs isolados, ea diferenciação das CSCs nos nichos estaminais adequadas [11].

fibroblasto normal e células de mama pode ser transformado em suas células cancerígenas induzida por

in vitro

reprogramação através da introdução exógena de alternâncias genéticos responsáveis ​​por aumentar o comprimento do telômero (hTERT), fornecendo sinais de proliferação constitutivos (H

ras

V12), e inibição das vias de supressão de crescimento, tais como p53 e pRB por vírus de símio 40 (SV40) antigénios [12, 13]. Na mesma linha de

na reprogramação vitro

, Scaffidi

et al

relatou que células somáticas possuem plasticidade suficiente para ser reprogramado e adquirir propriedades CSC através de

in vitro

introdução oncogênico [ ,,,0],14]. Numerosas referências, especialmente no estudo de cancros hematológicos, indicaram que os CSCs pode ser derivada de tecido do caule, as células progenitoras, e até mesmo a partir de células somáticas [10, 14-18]. No entanto, o potencial de

in vitro

reprogramação de células-tronco embrionárias em CSCs manteve-se incerto.

Aqui, nós estudamos se as células do rato-tronco embrionárias (mESCs) podem ser reprogramadas com sucesso em câncer induzido como células estaminais (iCLSCs) através de

in vitro

manipulação oncogênico. Além disso, expondo iCLSCs a vários microambientes específicos

in vivo

, pudemos observar o potencial destes iCLSCs para gerar tumores iCLSC site-specific em camundongos imunocompetentes.

Materiais e Métodos

Chemicals e os plasmídeos

os materiais que se seguem foram obtidos a partir dos fabricantes indicados: (a) Fugene 6 (Promega, Madison, WI), (b) e FBS a polibreno (Sigma-Aldrich, St-Louis , MO), (c) Geltrex (Invitrogen, Carlsbad, CA), (d) mais Mycozap CL (Lonza, Allendale, NJ), (e) pBABE-H

in RAS

V12 (# 1768), pBabe- SV40 LTG (# 10891), pMSCV-GFP (# 33336) e pMSCV-RFP (# 33337) (Addgene, Cambridge, MA), (f) pVSV-G (Clontech, mountain view, CA).

Cultura celular

GP2-293 (Clontech) e seus derivados, e do rato γ irradiado fibroblastos embrionárias células (MEF) (Cyagen, Santa Clara, CA) foram mantidas em DMEM (ATCC, Manassas, VA ) suplementado com 10% ou soro fetal de bovino 15% (Sigma-Aldrich,), respectivamente. Mouse células estaminais embrionárias (mESCs) (C57BL /6 de ratinho de células estaminais embrionárias, # MUBES-01001, Cyagen) foram mantidas em Knockout DMEM (Invitrogen) suplementado com 15% de substituição de soro nocaute (Invitrogen), 1% de L-glutamina (Invitrogen) , 1% de ácidos aminados não essenciais (Invitrogen), 0,1% de beta-mercaptanol (Invitrogen), factor inibidor de leucemia (LIF, 10 ng /ml em meio de cultura; StemRD, Burlingame, CA). Todas as células foram mantidas numa incubadora humidificada com 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C.

Sub-clonagem de genes para pMSCV

Para realizar sub-clonagem, H

ras

V12 e SV40 antígeno T grande (LTG) foram separados do pBABE-H

ras

V12 e pBABE-SV40 LTG pela digestão enzimática com BamHI e EcoRI (NEB, Ipswich, MA), ou com BamHI (NEB), respectivamente. Integração de H

ras

V12 e SV40LTg em qualquer pMSCV-GFP ou pMSCV-RFP foi realizada por ligação com T4-ligase (NEB) e produzido pMSCV-H

ras

V12-GFP e pMSCV -SV40 LTG-RFP. Integração das inserções foi verificada tanto a digestão e DNA enzimática sequenciamento.

Geração de Retrovirus

Para gerar sobrenadante retroviral, GP2-293 células foram transfectadas transitoriamente com qualquer pMSCV-H

ras

V12-GFP ou pMSCV-SV40 LTG-RFP combinada com a replicação incompetente ajudante vector de pVSV-G em uma placa de cultura de 60 milímetros usando Fugene 6. as células foram alimentadas às 24 h pós-transfecção, e o sobrenadante retroviral foi reunidos a partir da coleta em 48 e 72 h pós-transfecção. O sobrenadante foi dividido em alíquotas após centrifugação e armazenadas a -80 ° C para uso futuro. O título virai foi confirmado por análise de FACS (FACSCanto Analyzer, BD Biosciences, San Jose, CA) após a infecção para 1x 10

5 NIH-3T3 de fibroblastos de ratinho (ATCC).

Criação de GP2- Estável 293 derivados

Para gerar GP2-293 derivados com integração gene estável, GP2-293 células ou foram infectados com H

ras

V12 ou SV40 LTG utilizando um sistema retroviral. Separação FACS foi realizada para seleccionar as células infectadas de modo estável de acordo com GFP ou expressão RFP (separador de células FACSAria, BD Biosciences, San Jose, CA). A expressão do gene em células estáveis ​​foi verificada por transferência de western.

infecção retroviral para mESCs

mESCs foram lavadas e tripsinizadas. Após centrifugação, foram re-suspensos em mESCs isento de soro contendo meio de 8 ug de polibreno por ml-PBS e colocadas em placas a 1×10

5 células /1 ml por poço de uma placa de doze poços. Retroviral sobrenadante de vírus único foi adicionada a 1 mL /1×10

5 células ou mesmo proporção em volume de sobrenadante retroviral do vírus do indivíduo foi adicionada para co-infecção. Após 1 h de incubação no

2 incubadora de CO, a placa foi centrifugada durante 2 h a 1000 g à temperatura ambiente. No dia seguinte, os sobrenadantes retrovirais foram removidos; as células foram re-suspensas em meio de mESCs e plaqueadas em placas revestidas quer com Geltrex ou chapeados com MEF irradiado. Os mESCs estavelmente infectadas foram classificadas por FACS baseado em GFP ou expressão RFP (classificador de células FACSAria).

Western Blotting

As células foram lisadas com tampão RIPA (# 9806, Cell Signaling) suplementado com PMSF a 1 mM (Sigma-Aldrich). Western blot foi realizada utilizando 4-20% de gradiente de gel de Tris-HCl de SDS-poliacrilamida (Mini-PROTEAN TGX

®, da BioRad), de acordo com o protocolo do fabricante (Biorad). Os anticorpos usados ​​para a transferência de Western foram anti-ras (# 610001, 1: 1000, BD Bioscience), anti-T grande de SV40 e antigénio T pequeno (# 554150, 1: 1000, BD Bioscience), anti-β-actina (# A5441 , 1: 2500, Sigma-Aldrich), e anti-IgG de ratinho-HRP (# 7076S., 1: 5000, Cell Signaling)

fosfatase alcalina e coloração imunocitoquimica de coloração de células vivas

coloração da fosfatase alcalina foi realizada utilizando o kit de coloração de fosfatase alcalina II de acordo com o protocolo do fabricante (Stemgent). Para a coloração imunocitoquímica de células vivas, células cultivadas numa placa de 12 poços até mostrando colónias visíveis foram tratados com anticorpo solução preparada em meio de cultura celular fresco com uma concentração final de 2,5 ug (StainAlive ™ SSEA-1 (DyLight 550 ™), Stemgent) /ml. Após incubação durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO

2, as células foram examinadas num microscópio de fluorescência (microscópio automatizado, Nikon, Japão) com filtro de TRITC.

Ensaio de Proliferação Celular

ensaio de proliferação celular foi realizado através da utilização do ensaio de contagem de células kit-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, MD). Resumidamente, os 100 jil de suspensão de células (3000 células /poço) foram plaqueadas na placa de cultura de 96 poços revestida com Geltrex (Invitrogen). Durante o período de crescimento, a proliferação de células em cada poço foi medida após 1 h de incubação com 10 ul de solução de CCK-8, utilizando um leitor de microplacas Spectramax 250 (Molecular Device, Inc., Sunnyvale, CA) a um comprimento de onda de 540 nm. Depois de subtração de absorção intrínseca dos meios de comunicação em um comprimento de onda de 540 nm, a proliferação celular relativa (%) foi calculada a partir de ([Absorvância]

test /[Absorvância]

controlo) × 100. [Absorvância]

controle refere-se a absorvância de células cultivadas em meios no dia 1 após a semeadura de células à placa.

In vivo a produção de tumor utilizando mESCs modificados e histo-patológico de avaliação do tecido

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Utah (número de autorização: 14-08011).

Ambos, mESCs modificados e mESCs (controle) ingénuos foram cultivadas por uma semana em MEF células de alimentação até que colónias visíveis foram observados implante antes. Para ortotópico inoculação bursa ovariana de células para animal, de seis a oito semanas de idade, do sexo feminino camundongos C57BL /6 (laboratório Jackson, Bar Harbor, ME) foram pesados ​​antes intraperitoneal injeções anestésicas (xylazein-cetamina; 0,1 ml /10 g de peso corporal). Cada animal colocado em decúbito ventral foi recebido cerca de ~ 1,5 cm de comprimento da incisão dorsal, ligeiramente à esquerda da linha média. A derme foi separado de tecidos subjacentes, e uma pequena incisão foi feita através do músculo liso dorsal fascia para acessar o peritônio abdominal. Após a identificação do rim esquerdo, na área imediatamente abaixo dos rins foi dissecado para localizar o ovário esquerdo, que foi, em seguida, exteriorizada através da incisão. 1x 10

5 células (50 uL de mistura de 1: 1 de PBS e Matrigel (# 354248, Corning, Tewksbury, MA)) foram injectadas directamente em bursa ovariana usando uma seringa de Hamilton (30 g de agulhas). Após a inoculação das células, o ovário tem lugar de volta à sua posição original dentro da cavidade peritoneal. 4-0 foram usadas para suturar a incisão da parede traseira e na pele [19, 20]. inoculação ortotópico de células de mama de ratos foi realizada por injecção directa de 1x 10

5 células (50 uL de 1: 1 mistura de PBS e Matrigel (# 354248, Corning, Tewksbury, MA)) para a gordura de mamífero inferior direito . pad

Este piloto

in vivo

estudo incluiu (n = 16; S1 Table) animais. Em breve, dependendo do local do tumor (glândula mamaria contra a bolsa do ovário), quer teratomas imaturos com propriedades malignas (ovário) ou teratomas maduros (mama) formadas. O número total de animais (n = 16) foram divididos em quatro grupos experimentais. Group1: glândula mamária inoculados com MESC; Grupo 2: bursa ovário inoculados com MESC; Grupo 3: glândula mamária inoculados com MESC-Ras-LTG (iCLSCs), Grupo 4: bursa ovário inoculados com Mesc-Ras-LTG (iCLSCs). Após a inoculação de células ortotópico, os ratinhos foram monitorados duas vezes por semana durante todo o período experimental de 15 semanas. Os animais foram alojados em condições padrão no Centro de Facilidade comparativo Medicina Animal, em conformidade com as orientações do Comitê Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade de Utah. Para a avaliação histopatológica de tecidos, hematoxilina e eosina (H E) manchas foram realizados em secções representativas da massa tumoral de laboratório ARUP (ARUP, Salt Lake City, UT). Um patologista, com especialização em oncologia ginecológica avaliadas imagens microscópicas digitais.

A análise estatística

A análise estatística e plotagem de gráficos foram realizadas utilizando GraphPad Prism software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA) . Todos os resultados são expressos como a média ± SD, e p . 0,05 foi usado para significância estatística

Resultados

Construção de pMSCV-HrasV12 e pMSCV-LTG

plasmídeos retrovirais com a MSCV LTR (rato vírus de células-tronco longa repetição terminal), foram construídas através de sub-clonagem de qualquer H

ras

V12 ou gene SV40 LTG em um local de clonagem múltipla (MSC), seguido por uma expressão condução IRES do gene GFP ou RFP como mostrado diagrama esquemático na Fig 1A. Os insertos em construções foram verificadas através de digestão enzimática (Fig 1B), e sequenciação de ADN.

(A) Os genes de interesse (ou seja, HrasV12 ou LTG) foram inseridos em MSCV entre LTR e, ou GFP ou gene foi RFP usado como um gene marcador. (B) inserções clonadas em plasmídeos pMSCV foram confirmadas por digestões enzimáticas com qualquer BamHI ou EcoRI. M: escada de DNA, 1: pMSCV-GFP; 2: pMSCV-H

ras

V12-GFP; 3: pMSCV-GFP

corte; 4: pMSCV-H

ras

V12-GFP

corte; 5: pBABE-H

ras

V12

corte (+ controle); 6: pMSCV-RFP; 7: pMSCV-SV40 LTG-RFP; 8: pMSCV-RFP

cortar 9: pMSCV-SV40 LTG-RFP

corte; 10: pBABE-SV40 LTG

corte (+ controle). As setas brancas indicam inserções. Sequências de inserção também foram verificados por sequenciação de ADN.

Estabelecimento de GP2-293 derivados para gerar retrovírus

Para estabelecer linhas celulares estáveis ​​retrovírus produtoras, GP2-293 células, um derivado do 293 linha de células de rim humano com a integração estável de

gag /pol

componentes retrovirais, foram transduzidas com plasmídeos pMSCV. As células que expressam tanto GFP ou RFP classificadas por FACS (Fig 2A e 2B) foram adicionalmente verificadas para observar as suas expressões gene correspondente com análise de imunotransferência mostrado na Fig 2C. As células estáveis ​​foram verificados posteriormente usados ​​para gerar retrovírus através de transfecção de um plasmídeo envelope viral, pVSV-L. capacidade de infecção dos retrovírus foi demonstrada por análise de FACS através da medição da quantidade de células de fibroblastos de rato NIH3T3-infectadas com retrovírus que expressam quer GFP ou RFP (Figura 2D).

(A) A confirmação da expressão de GFP bem sucedida na GP2 -293 células, e (B) a confirmação da expressão RFP sucesso em GP2-293 células após a introdução de plasmídeos pMSCV. BF: Imagem de campo claro; FL: imagem de fluorescência. Escala nua é de 400 mm. (C) Análise de imunotransferência ilustrando expressão estável de H

ras

V12 e SV40 LTG em GP2-293 derivados de células; 1. BL: célula em branco GP2-293; 2. GFP: GFP contendo GP2-293 celular 3. HrasV12-GFP: H

ras contendo

celular GP2-293; 4. BL: célula em branco GP2-293; 5. RFP: RFP contendo células GP2-293 6. SV40LTg-RFP: SV40LTg e RFP contendo GP2-293 celular; M: Escada de proteína. (D) A citometria de fluxo (FACS) de 1x 10

5 NIH-3T3 de fibroblastos de rato após a infecção com retrovírus produzida a partir de GP2-293 derivados.

Geração de mESCs geneticamente modificados

de ratinho (Mesc) foram transformadas com a infecção por retrovírus produzidos a partir de derivados de células GP2-293 estáveis. Expressão de genes introduzidos em mESCs foi verificada por análise de imunotransferência (Figura 3A e 3B). Para confirmar que as alterações de proliferação celular, ensaios de proliferação celular foram realizadas em mESCs transformadas, que também foram comparadas para controlar mESCs (Fig 3C). MESC-H

ras

V12 /SV40 LTG mostrou aumento significativo na proliferação quando comparados com MESC-GFP e -H

Ras

V12 no dia 7 (Fig 3D). Além disso comparando proliferação de MESC-SV40 LTG e MESC-H

ras

V12 /SV40 LTG com MESC-RFP, MESC-SV40 LTG e MESC-H

ras

V12 /SV40 LTG mostrou melhoria significativa de proliferação (Fig 3D). No entanto, não houve diferença na proliferação entre MESC-H

ras

V12 /SV40 LTG e MESC-SV40 LTG (Fig 3D)

Imagens representativas de análise immunoblot:. (A) H

ras

V12, (B) SV40 LTG. Ensaio de proliferação (C) CCK células durante 7 dias do período de proliferação de mESCs e mESCs transformadas. (D) Comparação de proliferações no dia 7. A média ± S.D. (N = 3), *, ** e #, ## p 0,05. análise de variância foi realizada com pós-teste de Tukey utilizando o software GraphPad Prism.

Manutenção de stemness após a modificação retroviral de mESCs

Para confirmar a stemness de mESCs transformadas, a expressão de alcalina foi avaliada fosfatase (AP) e específico do estágio embrionário anitigen-1 (SSEA-1) haste marcador de células. Os mESCs transformadas (Figura 4A- (C) – (E)) expressaram níveis similares de coloração AP em comparação com mESCs virgens (não transformadas) (Figura 4A- (b)), indicando a manutenção ininterrupta de células indiferenciadas, mantendo o seu potencial de auto-renovação . Durante a posterior verificação do estado indiferenciado de mESCs transformadas com anticorpo SSEA-1 específico, mESCs transformadas (figura 4B (b) – (d)) mostrou uma positiva para este marcador de superfície como mESCs como não transformadas (figura 4B (um )). A detecção de ambos AP e SSEA-1 em mESCs transformadas demonstraram que os procedimentos de transformação não parece afetar a stemness de mESCs. Coloração

(A) fosfatase alcalina (AP). áreas de cor vermelha indicam atividade de fosfatase alcalina. (uma). imagem Campo brilhante do mESCs; coloração AP: (b). mESCs; (C). MESC-H

ras

V12; (D). MESC-SV40 LTG; (E). MESC-H

ras

V12 /SV40 LTG. Escala nua é de 10 um. (B) coloração imunocitoquímica das células vivas que expressam SSEA1. Pares de brilhante arquivados e imagens SSEA1: (a). mESCs; (B). MESC-H

ras

V12; (C) .mESC-SV40 LTG; (D). MESC-H

ras

V12 /SV40 LTG. As imagens representativas foram obtidos a partir de microscópio de fluorescência com filtro TRITC. barra de escala é de 100 mm.

Caracterizações de células-tronco cancerosas-like bioengenharia

Para confirmar o potencial oncogénico de mESCs reprogramadas, MESC-H

ras

V12 /células SV40 LTG ou foram ortotopicamente inoculado à bursa ovariana esquerda ou apagados almofadas de gordura mamária inguinal. Aos 31 dias após a inoculação, uma massa de ovário tinham formado em ratos que foram submetidos a inoculação ortotópico da bursa ovariana. Em contraste, os ratinhos que tenham sido submetidos a inoculação ortotópico de almofada de gordura mamaria inguinal não formam quaisquer massas. O situs abdominal em ratinhos após inoculação do ovário demonstrou uma massa de ovário (Fig 5A) na forma de ovário esquerdo aumentado em comparação com o normal, contra-lateral, ovário não injectada direita (Fig 5B). Após uma análise bruta adicional, o ovário esquerdo injetada também visivelmente demonstrada a massa formada rompendo a superfície do ovário, bem como unindo-se à parede lateral peritoneal. O espaço retroperitoneal também foi encontrada para ser ocupado pela massa aderente à parede traseira, e rim esquerdo (Figura 5C). Não havia nenhuma evidência bruta de metástases abdominais decorrentes desta massa ovariana.

(A). local abdominal com massa ovariana (círculo azul); (B). Colo do útero com útero, ovário normal direita (seta azul) e massa ovariana esquerda (seta branca); (C). Esquerda ovário com cápsula parcialmente intacta e massa rompendo a superfície do ovário (círculo azul).

A análise histopatológica dos ovários injetados com MESC revelou a geração de um teratoma maduro exibindo epitélio escamoso bem diferenciado com queratinização e epitélio respiratório semelhante (Fig 6a- (b)) em comparação com as características histológicas do ovário normal (Fig 6a- (a)). Curiosamente, ovários injetado com MESC-H

ras

V12 /SV40 LTG também formou teratomas maduros, mas, além disso revelou partes de um teratoma imaturo contendo focos dispersos de uma neoplasia maligna de alto grau, caracterizada por células malignas dispostas linearmente , em pequenos grupos, e, ocasionalmente, como estruturas glandulares-like rudimentares (Fig 6a- (c) pequena janela). Maior ampliação revelou essas células malignas a ser pouco diferenciados com alta núcleo: rácios de citoplasma, núcleos marcadamente atípicas com grosseiramente aglutinados cromatina, nucléolo variavelmente proeminente, e numerosas figuras mitóticas (Fig 6a- (c)). Os ratos que tiveram suas bolsas de gordura mamária inguinal injetados com mESCs parecia ter gerado teratomas maduros exibem epitélio escamoso bem diferenciado, também contendo tecido pancreático, e epitélio respiratório, como com cílios bem formada (Fig 6B- (b)) em comparação com o avaliação histológica do tecido mamário normal (Fig 6B- (a). Em contraste, a mama injetadas MESC-H

ras

V12 /SV40 LTG não mostraram diferenças histológicas notáveis ​​quando comparado ao normal, não injectada … tecido mamário

(a) Painel de ovário: (a) o direito normal ovário (não injectada) (100X) barra de escala é de 100 mm; (b) a massa Esquerda ovário (após a inoculação ortotópico com MESC. ) mostrando sinais de um teratoma maduro (pequena janela, 100X) caracterizada com um foco de madura, queratinizante epitélio escamoso dentro da área descrita no interior da caixa (200X) barra de escala é de 100 m;.. (c) a massa do ovário (após a inoculação ortotópico com MESC-H

ras

V12 /SV40-LTG) mostrando sinais de teratoma imaturo (pequena janela, 100X) caracterizada com focos dispersos de uma neoplasia maligna de alto grau dentro da área descrita no interior da caixa (400X). barra de escala é de 100 mm. (B) Painel de mama: (a). tecido normal mamário murino (100X). barra de escala é de 100 mm; (B). massa de mama (após a inoculação ortotópico de MESC em limpou almofada de gordura mamária inguinal) exibindo sinais de teratoma maduro (pequena janela, 100X) caracterizada com o epitélio respiratório-como ter cílios bem formados dentro da área descrita no interior da caixa (200X). barra de escala é de 100 mm.

Discussão

O presente estudo demonstra que ratos células-tronco embrionárias (mESCs) pode ser reprogramado em câncer induzido como células-tronco (iCLSC) pela introdução de bem elementos oncogênicos definidos, (o vírus símio 40 grandes oncogene T (SV40 LTG) e um ras oncogênicos (H

ras

V12)) usando um rato vírus haste repetição terminal longa (MSCV-LTR) à base de plasmídeo retroviral . O

in vitro

mESCs reprogramadas exibiu aumento da proliferação e manutenção das propriedades da célula-tronco sob

in vitro

condições de cultura. Além disso, as células transformadas também demonstrou diferenças específicas do local da formação do tumor ortotópico de tecidos a seguir à inoculação do ovário e da mama em ratos imuno-competentes. Assim, sugerimos que

in vitro

reprogramação da mESCs com elementos oncogênicos pode ser uma abordagem potencial de gerar câncer induzido como células-tronco.

O sistema retroviral MSCV-LTR foi encontrado para ser um potencialmente ferramenta útil para a transformação efetiva, oncogénico de mESCs. A infecção retroviral de mESCs parece altamente dependentes do vírus gerados a partir de diferentes tipos de plasmídeos retrovirais. No nosso sistema retroviral MSCV-LTR, observou-se uma maior capacidade de infecção e de manutenção estável do gene de expressão, quando comparado com o sistema comum de Moloney retroviral à base de vírus (isto é pBABE série). Os nossos resultados mais recentes são consistentes com relatórios anteriores que retrovírus, que foi gerado a partir de um plasmídeo retroviral baseado em MSCV-LTR, poderia manter a longo prazo e expressão estável de genes em ambos estaminais embrionárias (ES) células e células estaminais hematopoiéticas (SH) células [ ,,,0],21, 22].

In vitro

reprogramação da mESCs para iCLSC cumpridos os requisitos de genes oncogénicos bem definidas, H

ras

V12 e SV40 LTG, tanto para neoplásica transformação e anti apoptose. mutação oncogénica ras, que ocorre em aproximadamente 30% de todos os tumores humanos, é conhecido por estar envolvido no processo de transformação neoplásica de células

in vitro

e tem sido bem relatada [13, 23, 24]. No entanto, a introdução de uma forma constitutivamente activa de ras sozinho (isto é, H

ras

V12) mostrou o seu potencial de sensibilizar células para a apoptose [24-26] e até mesmo a indução de senescência celular prematura através da associação de acumulação de p53 [27 ]. No nosso ensaio de proliferação com reprogramado MESC, a falta de um aumento significativo da proliferação do MESC reprogramado com H

ras

V12 sozinho pode ser explicado em parte pela indução de quer a senescência celular ou a apoptose através da expressão de um constitutivamente forma ativa da H

ras

V12 sozinho. Em contraste, MESC-SV40 LTG e MESC-H

ras

V12 /SV40 LTG pôs em prática suas reforço efeitos proliferativa. Considerando-se um papel anti-apoptótica de SV40 LTG por inactivação de p53 [28], que sugerem que a introdução de SV40 LTG em MESC pode desempenhar um papel na prevenção da senescência celular MESC prematura ou indução de apoptose. Além disso, SV40-LTG poderia cooperar com H

ras

V12 durante a transformação neoplásica de mESCs com prevenção de H

ras

morte celular induzida por V12, que foi encontrado para ser coerente com vários relatórios anteriores [13, 29, 30].

A manutenção bem sucedida de propriedades das células-tronco em mESCs reprogramadas pôde ser confirmada

in vitro

e

in vivo

. No processo de

in vitro

reprogramação da mESCs, usamos a infecção retroviral para introduzir componentes oncogênicos. Embora introdução retroviral de genes tem as vantagens de alta infecção e integração estável de genes exógenos para os cromossomas do hospedeiro, inserção aleatória de componentes retrovirais nos genomas de acolhimento não pode excluir a perturbação ou perda da expressão de propriedades de células-tronco em mESCs. No entanto, nós observamos uma expressão estável dos dois marcadores de células estaminais, fosfatase alcalina (AP) e SSEA-1, depois de transformação retroviral mESCs. Para ganhar uma compreensão mais abrangente dos mecanismos do subjacente a esta manutenção da expressão do gene da haste após a infecção retroviral, um estudo mais aprofundado é necessário. Além da manutenção de células-tronco propriedades

in vitro

, a inoculação ortotópico de mESCs reprogramadas

in vivo

também mostrou a formação de teratomas imaturos no ovário de ratos. Na verdade, a formação de teratomas observada

in vivo

, incluindo imaturos, componentes malignos também exemplificou a manutenção bem sucedida de células-tronco propriedades

in vivo

durante todo o processo de reprogramação.

Se o desenvolvimento de vários tumores malignos das células-tronco será realmente possível, isto pode exigir estudos adicionais para investigar o papel específico de diferentes microambientes na tumorigênese [31]. Nossas experiências com animais nos permitiu observar as diferenças da formação de teratomas em dois locais de implantação ortotópicos diferentes (de ovário e mama). Na implantação do ovário ortotópico, MESC-H

ras

V12 /SV40 LTG induz a geração de teratoma imaturo exibindo focos dispersos de uma neoplasia maligna de alto grau. No entanto, peito colocado com o MESC-H

ras

V12 /SV40 LTG não mostrou a formação de teratoma. Embora a contribuição de microambiente naqueles dois locais para a geração de malignidade continua a ser estudado, um relatório recente do Yan T

et al

sugeriu a potencial contribuição de fatores do microambiente do tumor-favorável durante a transformação do induzida rato pluripotentes células-tronco (miPSCs) em células-tronco cancerosas (CSCs) [32]. Portanto, acreditamos que microambiente do ovário pode ser o lugar favorável para o avanço da tumorigênese de mESC- H

ras

V12 SV40 LTG em comparação com o lugar da mama.

Em conclusão /, nós demonstrou a geração bem-sucedida de câncer induzido como células-tronco usando oncogênico

in vitro

reprogramação de mESCs. Os mESCs reprogramados foram caracterizados por meio de sua expressão do gene oncogênico e manutenção sem entraves de propriedades estaminais

in vitro

e

in vivo

. Além disso, estas células modificadas mostrou a formação de teratomas contendo partes imaturos, malignas quando crescendo ortotopicamente no local de implantação favorável para a tumorigénese. Limitações desta pesquisa existir com base na formação de teratomas avançados

in vivo

no que diz respeito à questão da tumor-microambientes favoráveis. Além disso, sugere-se a necessidade de um microambiente aberrante para o desenvolvimento e manutenção de tumores derivados de câncer induzido como células-tronco. Para entender melhor os processos de tumorigênese natural, bem como para estabelecer modelos de câncer em animais mais previsíveis, o estudo continuado das funções detalhadas do microambiente do tumor, bem como a identificação dos fatores do microambiente potencialmente aberrantes serão necessários para obter insights sobre o

in vivo

geração de vários cancros derivados de câncer induzido como células-tronco. O nosso trabalho tem proporcionado pioneiro bases para permitir uma variedade de aplicações futuras pesquisas adicionais para estes induzida por câncer como células-tronco, mas são necessárias mais pesquisas para compreender melhor os mecanismos de iCLSCs tumorigênese subjacente.

Informações de Suporte

S1 Tabela . formação de tumores em ratinhos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0141172.s001

(TIF)

Reconhecimentos

O autor gostaria de agradecer Dr.Yongen Sun por sua apoio a realização de todas as cirurgias de animais, Ms. Kathy Harvey por sua revisão do manuscrito, o biorrepositório eo grupo patologia molecular (BMP) no Instituto Huntsman Cancer para o seu tipo de suporte em lidar com a coloração histopatológico dos tecidos, e Dr. James Marvin e Mr. Chris Leukel para o seu tipo de suporte de FACS células de triagem dentro da Universidade de fluxo de Utah citometria de núcleo.