Abstract
A resistência aos inibidores de crescimento epidérmico receptor tirosina quinase fator (EGFR-TKI), gefitinib e erlotinib, é um problema crítico no tratamento de
EGFR
câncer de pulmão mutante. Vários mecanismos, incluindo desvio de sinalização pelo fator de crescimento de hepatócitos (HGF) Triggered activação Met, estão implicados como mediadores da resistência. O alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), é uma conduta a jusante de EGFR e de sinalização de TEM, e é, assim, considerada um alvo terapêutico atractivo no tratamento de vários tipos de cancros. O objetivo deste estudo foi examinar se 2 inibidores de mTOR clinicamente aprovados, temsirolímus e everolimus, superar a resistência dependente de HGF ao EGFR-TKI em
EGFR
cancro do pulmão células mutantes. Ambos temsirolímus e everolimus inibiram a fosforilação de p70S6K e 4E-BP1, que são alvos a jusante da via mTOR, e reduziu a viabilidade de
EGFR
células de cancro do pulmão mutantes, PC-9, e HCC827, mesmo na presença de HGF
in vitro
. Em um modelo de xenotransplante, temsirolimus suprimiu o crescimento de células PC-9 superexpressão do
HGF
gene-; isto foi associado com a supressão da via de sinalização de mTOR e angiogénese tumoral. Em contraste, erlotinib não suprimiu esta via de crescimento tumoral ou de sinalização. Vários mecanismos, incluindo a inibição da produção do factor de crescimento do endotélio vascular pelas células tumorais e a supressão da viabilidade das células endoteliais, contribuem para o efeito anti-angiogénico de temsirolímus. Estes resultados indicam que os inibidores de mTOR pode ser útil para controlar HGF-desencadeada resistência EGFR-TKI em
EGFR
câncer de pulmão mutante, e eles fornecem a justificativa para ensaios clínicos de inibidores de mTOR em pacientes estratificados por
EGFR
mutação e estado de expressão de HGF
Citation: Ishikawa D, Takeuchi S, Nakagawa T, Sano T, Nakade J, Nanjo S, et al. (2013) mTOR inibidores controlar o crescimento de EGFR Cancer Mutant Lung Mesmo depois de adquirir resistência por HGF. PLoS ONE 8 (5): e62104. doi: 10.1371 /journal.pone.0062104
editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, Coreia do
Recebido: 29 de novembro de 2012; Aceito: 18 de março de 2013; Publicado: 14 de maio de 2013
Direitos de autor: © 2013 Ishikawa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por KAKENHI (Grants-in-Aid para a Investigação Científica em áreas inovadoras ‘Integrative Pesquisa sobre o Câncer Microenvironment Rede “(para SY) e Grant-in-Aid para Jovens cientistas (para TY e ST)), e Grants-in ajuda para o Projeto de Desenvolvimento da Pesquisa inovativa em Cancer Therapeutics (P-direta) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia (MEXT). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Seiji Yano recebeu honorários da Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. e AstraZeneca. Seiji Yano recebeu financiamento para pesquisa da Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. e Eisai Co., Ltd. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
o cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada com malignidades em todo o mundo, e mais de 80% dos casos são classificados como câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR) mutações de activação, tais como o exão 19 deleção e exão 21 mutação pontual L858R, são encontrados numa população de NSCLC, e estão associados com uma resposta clínica aos inibidores de tirosina-cinase EGFR (EGF-TKI), gefitinib e erlotinib [1] – [3]. No entanto, quase todos os respondedores adquirir resistência e desenvolver recorrência após vários períodos de tempo (resistência adquirida) [4]. Além disso, 20-30% dos pacientes apresentam respostas desfavoráveis, embora os seus tumores têm mutações alvo (resistência intrínseca) [5]. Muitos estudos têm sido realizados a fim de delinear estratégias que podem superar a resistência adquirida e intrínseco. Esses estudos identificaram vários mecanismos de resistência adquirida, incluindo
EGFR
mutação T790M [6], [7],
MET
amplificação [8], [9], o fator de crescimento de hepatócitos (HGF) superexpressão [10], a perda de PTEN [11], a transformação de um cancro de pulmão de pequenas células (SCLC) fenótipo [12] – [14], epitelial-a-mesenquimal transição (EMT) [15] – [17], a activação de a via de NF-kB [18], alteração de microARN [19], e a activação do eixo Gas6-Axl [20]. A complexidade do NSCLC é reflectida pela co-ocorrência de várias combinações destes mecanismos de resistência em diferentes indivíduos. Nós já descobriu que HGF desencadeia resistência EGFR-TKI ativando o eixo /PI3K /AKT MET [10]. Além disso, mostramos que a sobre-expressão de HGF está presente em tumores a partir de pacientes japoneses com resistência intrínseca e adquirida de tumor a EGFR-TKI a frequências de cerca de 60% e 30%, respectivamente [21]. Isso indica que o HGF é um alvo ideal para superar a resistência EGFR-TKI em
EGFR
pacientes com câncer de pulmão mutantes. Para superar a resistência HGF-disparado, 2 sinais de EGFR e HGF-MET devem ser bloqueadas simultaneamente. Nós já relatado que a resistência dependente de HGF pode ser controlada por um anticorpo anti-HGF de anticorpos neutralizantes [22], o antagonista de HGF NK4 [22], TEM-TKI [23] – [25], e fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) inibidores [26], em combinação com o EGFR-TKI. No entanto, estes inibidores não estão clinicamente aprovados e, portanto, não pode ser utilizado para o tratamento de doentes com cancro.
O alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), uma serina /treonina quinase, é um alvo a jusante da via PI3K e vias AKT , e que desempenha um papel crítico na sobrevivência e proliferação das células [27] – [29]. A activação da via PI3K /AKT e subsequente fosforilação de mTOR inicia a fosforilação de alvos a jusante importantes, incluindo ribossomal p70S6 serina /treonina quinase (S6K1) e fator de iniciação eucariótico (EIF) -4E ligação às proteínas (4E-BP1), resultando num aumento da mRNA tradução e síntese de proteínas dependentes de boné, respectivamente. Assim, a mTOR quinase é um nó chave da via de sinalização de PI3K /AKT [27] – [30]. Até à data, vários análogos de rapamicina inibidor de mTOR têm sido desenvolvidos, incluindo temsirolímus e everolimus, que têm sido utilizados para tratar carcinomas de células renais e tumores neuroendócrinos pancreáticos. Rapamicina e seus análogos ligam-FK506 de ligação proteína-12 (FKBP12) e interagir com mTOR, inibindo a sua actividade de cinase e travar a tradução de proteínas críticas para a proliferação e sobrevivência celular.
Como mTOR é a jusante de ambos o EGFR e MET, temos a hipótese de que a inibição do mTOR, mesmo como um agente de monoterapia, pode bloquear EGFR e MET-mediada sinalização simultaneamente e superar HGF-desencadeada resistência EGFR-TKI. No presente estudo, examinamos se o clinicamente aprovado mTOR inibidores, temsirolímus e everolimus, contornar HGF-desencadeada resistência EGFR-TKI em
EGFR
cancro do pulmão células mutantes usando
in vitro Comprar e
in vivo
modelos, e avaliou mecanismos subjacentes.
Materiais e Métodos
culturas e reagentes celular
EGFR
mutante de células de adenocarcinoma de pulmão humano linhas PC-9 (del E746_A750) e HCC827, com eliminações em
EGFR
exão 19, foram adquiridos de Imuno-Biological Laboratories Co. (Takasaki, Gunma, Japão) e da American Type Culture Collection (Manassas, VA ), respectivamente. Humano
HGF
-Gene transfectantes (PC-9 /HGF) e controlo de vectores de células (PC-9 /Vec) foram estabelecidas como previamente descrito [10]. Todas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e antibióticos. Todas as células foram passadas por menos de 3 meses antes da renovação de congelados, os estoques cedo-passagem. As células foram regularmente examinado para micoplasma usando MycoAlert Mycoplasma Detection Kits (Lonza, Rockland, ME). As linhas celulares foram autenticado no Laboratório do Instituto Nacional de inovação biomédica (Osaka, Japão) por análise de repetição em tandem curto. Erlotinib, everolimus, e temsirolimus foram obtidos a partir Selleck Chemicals (Houston, TX). Humano de HGF recombinante foi preparado como previamente descrito [10].
Produção de HGF e VEGF no sobrenadante da cultura de células
As células (2 x 10
5) foram cultivados em 2 ml de meio com 10% de FBS durante 24 h, lavadas com PBS e incubadas durante 48 h em meio com FBS a 10%. Em algumas experiências, o HGF foi adicionado ao meio. Os meios de cultura foram colhidos e centrifugados, e os sobrenadantes foram armazenados a -70 ° C até à análise. As concentrações de HGF e VEGF foram determinados por EIA IMMUNIS HGF (Instituto de Imunologia, Tóquio, Japão) e Quantikine VEGF ELISA (R D Systems, Minneapolis, MN), respectivamente, de acordo com os protocolos dos fabricantes. Todas as amostras foram testadas em duplicado. A intensidade da cor foi medida a 450 nm utilizando um leitor de placas espectrofotométrico. as concentrações do factor de crescimento foram determinadas por comparação com curvas padrão. Os limites de detecção para o HGF e VEGF eram 100 pg /ml e 31 pg /ml, respectivamente.
A viabilidade celular ensaio
A viabilidade celular foi medida pelo método de redução do corante MTT. As células tumorais, plaqueadas a 2 x 10
3/100 ul de RPMI 1640 mais 10% de FBS /poço em placas de 96 cavidades, foram incubadas durante 24 h. Em seguida, erlotinib, temsirolímus, everolimus, e /ou HGF foram adicionados a cada poço, e a incubação foi continuada durante um adicional de 72 h. A viabilidade das células foi medida com uma solução de MTT (brometo de 2 mg /mL; Sigma, St. Louis, MO), conforme anteriormente descrito [10]. Cada experiência foi realizada com amostras em triplicado.
Anticorpos e blotting
aliquotas de proteína Ocidentais (25 ug cada) foram resolvidas por electroforese em gel de poliacrilamida SDS (Bio-Rad, Hercules, CA) e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Bio-Rad). Após lavagem 4 vezes, as membranas foram incubadas com Bloqueio Um (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japão) durante 1 h à temperatura ambiente (TA) e durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários para a p-actina (13E5), Met (25H2), fosfo-MET (anti-P-MET, Y1234 /Y1235; 3D7), p-EGFR (Y1068), AKT ou p-AKT (S473), mTOR, p-mTOR (S2448), p70S6K, pp70S6K ( T389), 4E-BP1, p4E-BP1 (T37 /46) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), com o EGFR humano (1 jig /mL), humano /ratinho /ERK1 rato /ERK2 (0,2 ug /mL), e P-ERK1 /ERK2 (T202 /Y204; 0,1 ug /mL) (R D Systems). Depois de 3 lavagens, as membranas foram incubadas durante 1 h à TA com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano específicos da espécie. bandas imuno foram visualizados com SuperSignal Oeste Dura substrato ampliado Duração, um substrato quimioluminescente melhorado (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).
estudos de xenoenxerto em ratinhos SCID
Suspensões de PC-9 /Vec e PC-9 células /HGF (5 × 10
6) foram injectados subcutaneamente na parte traseira dos ratos macho de 5 semanas de idade, com imunodeficiência combinada severa (SCID) (Clea, Tóquio, Japão). Após 7 dias, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente para nenhum tratamento (grupo de controlo), erlotinib por via oral (20 mg /kg /dia), ou temsirolímus intravenosa (50 mg /kg /semana em água). O tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana, e o volume do tumor foi calculado (mm
3) como [(largura)
2 × comprimento] /2. Todos os experimentos com animais cumpriram as orientações para o Instituto de Animais Experimentais, Advanced Science Research Center, da Universidade Kanazawa, Kanazawa, Japão (aprovação no. AP-081088)
As análises histológicas
.
Para o detecção da proliferação de células tumorais (Ki-67), secções 5 mícrons de espessura foram desparafinados em xileno, re-hidratadas em concentrações decrescentes de etanol, e antigénio-recuperado. Para a detecção de células endoteliais (CD31), secções congeladas de 5 um de espessura de tumores de xenoenxerto foram fixadas com acetona fria e lavou-se com PBS. Em seguida, a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação em 3% aquoso H
2O
2 durante 10 min. A seguir ao tratamento com soro normal de cavalo a 5%, as secções foram incubadas com anticorpos primários para o Ki-67 (MIB-1) (Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca), e rato CD31 (MEC13.3) (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ ). Após a sondagem com anticorpos secundários biotinilados específicos para determinadas espécies, as secções foram incubadas durante 30 minutos com avidina-peroxidase biotinilada complexo (ABC), utilizando um kit Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). O DAB (3,3′-diaminobenzidina, tetracloridrato) sistema líquido (Dako Cytomation) foi utilizado para detectar a imunocoloração. A omissão do anticorpo primário serviram como controlo negativo. Foram selecionadas as 5 áreas que contêm o maior número de células marcadas dentro de uma seção para a quantificação histológica pela luz ou microscopia de fluorescência com uma ampliação de 400 vezes. Todos os resultados foram avaliados de forma independente por 2 dois investigadores (D.I. e T. N.).
A análise estatística
Entre comparações entre os grupos foram avaliadas pelo
t-
testes de Student de duas caudas. Todas as análises foram realizadas utilizando GraphPad Software. A
P
valor 0,01 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
inibidores de mTOR suprimir a viabilidade de
EGFR
cancro do pulmão células mutantes na presença de HGF.
PC-9 e HCC827 são linhas celulares de adenocarcinoma de pulmão humano com deleções do exão 19 em
EGFR
, resultando em ativação constitutiva dessa proteína. Estas linhas de células eram sensíveis ao erlotinib, enquanto que a resistência erlotinib induzida por HGF (Fig. 1). O tratamento com apenas um dos inibidores de mTOR (temsirolímus ou everolimus) sozinho perceptivelmente suprimiu a viabilidade destas linhas celulares. Sob estas condições experimentais, o HGF não diminuir a sensibilidade destas linhas de células para qualquer uma das drogas. Estes resultados sugerem que os inibidores de mTOR pode eficazmente controlar o crescimento de
EGFR
cancro do pulmão células mutantes, independentemente da presença de HGF que induziria
9-PC ou HCC827 células EGFR-TKI resistência. foram incubadas com ou sem erlotinib, temsirolímus, ou everolimus, na presença ou ausência de HGF (20 ng /ml) durante 72 h. Em seguida, a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio do MTT. As barras mostram SD. Os dados mostrados são representativos de 5 experiências independentes, com resultados semelhantes.
O nosso estudo anterior demonstrou que, em pacientes com NSCLC, o HGF é detectada principalmente em células cancerosas com resistência adquirida ao EGFR-TKI, sugerindo que a produção de HGF por estas células ocorre principalmente através de um mecanismo autócrino. Para explorar ainda mais o efeito de inibidores de mTOR na produção HGF autócrino, geramos estáveis
HGF
-Gene transfectantes no PC-9 células (PC-9 /HGF). células /HGF segregadas concentrações elevadas de HGF (28 ± 1 ng /48 h) PC-9, ao passo que as concentrações de HGF secretadas por PC-9- e controlo por PC-9 /Vec células transfectadas com vector estavam abaixo do limite de detecção. Além disso, as células 9 PC /HGF tornaram-se resistentes ao erlotinib (Fig. 2). Descobrimos que temsirolímus ou everolimus visivelmente reduzida a viabilidade de ambas as /células PC-9 /Vec e PC-9 HGF na mesma extensão, enquanto que a combinação de inibidor de mTOR mais erlotinib não teve nenhum efeito em 9 PC células-Vec /na presença de HGF, o que indica que os inibidores de mTOR não sensibilizar ainda mais essas células para erlotinib
in vitro
(Fig. S1). Bater para baixo de mTOR por siRNA resultou em inibição da viabilidade de PC-9 /Vec e células /HGF 9 PC-30% (Fig S2 B), indicando que a viabilidade celular inibida por temsirolímus mesmo na presença do HGF é devido a mTOR inibição. Também realizamos citometria de fluxo utilizando anexina V e descobriu que temsirolimus não induziu apoptose discernível no PC-9 /células HGF (Fig. S3) PC-9 /Vec ou. Estes resultados indicam que os inibidores de mTOR, quando utilizados como agentes únicos, suprimir o crescimento de
EGFR
células de cancro do pulmão mutantes através da inibição da proliferação em vez de indução de apoptose.
PC-9 /Vec e PC células -9 /HGF foram incubadas com erlotinib (a), temsirolímus (B), ou everolimus (C) durante 72 h. Em seguida, a viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de MTT. As barras mostram SD. (D) As células PC-9 /Vec e PC-9 /HGF foram tratados com ou sem erlotinib (0,3 uM), temsirolímus (0,3 uM), ou everolimus (0,3 ^ M) durante 4 h. Os lisados de células foram colhidas e submetidas a transferência de Western. Os dados apresentados são representativos de 3 expericias independentes com resultados semelhantes.
inibidores de mTOR suprimir p70S6K e 4EBP1 fosforilação mesmo na presença do HGF
Para explorar o mecanismo molecular pelo qual os inibidores de mTOR suprimida a viabilidade celular, mesmo na presença do HGF, examinou-se o estado de EGFR, Met, e as suas moléculas de jusante (ERK1 /2, PI3K /AKT, p70S6K, e 4EBP1) em PC-9 /Vec e PC-expressão de proteínas e a fosforilação 9 células /HGF por transferência de western (Fig. 2D). células Vec PC-9 /expressa EGFR e as proteínas MET, enquanto que apenas EGFR foi perceptivelmente fosforilada. Erlotinib significativamente inibida a fosforilação do EGFR, bem como a jusante de ERK1 /2 e AKT, mas ligeiramente inibida p70S6K fosforilação. Embora nem temsirolimus nem everolimus afetou a fosforilação de EGFR, MET, ERK1 /2 ou AKT, que inibiu a fosforilação de p70S6K e 4EBP1, as moléculas a jusante do mTOR.
Em 9 de PC células /HGF, MET foi também fosforilado, presumivelmente devido a que o HGF foi produzida de uma maneira autócrina. Erlotinib inibiu a fosforilação do EGFR, mas não notavelmente inibir a fosforilação do TEM, AKT, p70S6K, ou 4EBP1. Embora nem temsirolímus everolimus nem inibiu a fosforilação do EGFR, Met, ERK1 /2, ou AKT, que inibiu marcadamente a fosforilação de p70S6K e 4EBP1. Estes resultados indicam que os inibidores de mTOR suprimir a fosforilação de moléculas a jusante de mTOR, independentemente da presença do HGF.
inibição de mTOR suprime o crescimento induzida por HGF de tumores resistentes erlotinib
in vivo
a seguir, avaliou se os inibidores de mTOR iria controlar o crescimento de
EGFR
cancro do pulmão células mutantes com EGFR-TKI resistência HGF-desencadeada
in vivo
. A administração oral de erlotinib suprimiu o crescimento do PC-9 /Vec-tumores, mas não PC-9 tumores /HGF, indicando a resistência do PC-9 tumores /HGF ao erlotinib
in vivo
(Fig. 3a). Por outro lado, a administração intravenosa de temsirolímus suprimiu o crescimento de ambos os tumores PC-9 /Vec e PC-9 tumores /HGF. Estes resultados indicaram que a inibição de mTOR podem ser úteis para controlar o crescimento de tumores resistentes a induzida por HGF
in vivo
.
(A) ratinhos SCID que possuem PC-9 /Vec ou PC-9 /tumores HGF foram administrados 25 mg /kg uma vez por dia ou erlotinib 50 mg /kg uma vez por semana temsirolímus do dia 8 ao dia 20. o volume do tumor foi medido utilizando calibradores nos dias indicados. Significam volumes tumorais ± SE são mostrados para grupos de 5 ratos. * P 0,01 (one-way ANOVA). Os dados apresentados são representativos de 2 expericias independentes com resultados semelhantes. (B) ratinhos SCID com PC-9 /Vec ou PC-9 tumores /HGF foram administrados 25 mg /kg uma vez por dia erlotinib durante 4 dias ou 50 mg /kg uma vez a partir temsirolímus dia 8. Quatro horas após a administração final de erlotinib, tumores eram colhido, e os níveis relativos de proteínas nos lisados tumorais foram determinados por western blotting.
foram avaliados ainda os mecanismos moleculares pelos quais temsirolímus inibiu o crescimento de PC-9 /HGF-tumores. As análises Western blot revelaram que o erlotinib inibiu marcadamente a fosforilação do EGFR, ERK1 /2, e AKT, e ligeiramente suprimiu a fosforilação de p70S6K no PC-9 /Vec-tumores (Fig. 3B). Embora a fosforilação de EGFR erlotinib significativamente inibida, apenas ligeiramente inibida ERK1 /2 e a fosforilação p70S6K, ao passo que não inibiu a fosforilação de AKT em PC-9 /HGF-tumores. Por outro lado, embora temsirolímus não afecta marcadamente a fosforilação do EGFR ou de ERK1 /2 em ambas as PC-9 tumores /Vec e PC-9 tumores /HGF, que fosforilação p70S6K significativamente inibida, o que sugere o modo de acção deste fármaco como um inibidor de mTOR.
Curiosamente, o temsirolímus inibiu um pouco a fosforilação de Akt em tumores /HGF 9 PC-, mas aumentou a fosforilação de AKT em PC-9 células /HGF
in vitro
condição (Fig. 2D). Para esclarecer a causa desta discrepância, examinámos o tempo de curso do tratamento inibidor de mTOR em AKT fosforilação
in vivo
(Fig S4). Descobrimos que, de acordo com os resultados de
In vitro
experiências, AKT fosforilação nos tumores foi aumentada 4 h após o tratamento temsirolímus. Mas, em seguida, o nível de fosforilação de Akt foi reduzida e foi ligeiramente inibida às 96 h após o tratamento, de acordo com os resultados mostrados na Fig. 3B. Portanto, a discrepância entre os resultados da Fig. 2D e Fig. 3B foram devido à diferença das amostras de tempo foram colhidas.
inibição do mTOR suprime angiogênese
in vivo
Também examinamos proliferação de células tumorais (Ki-67) e angiogênese (CD31) por imuno-histoquímica. erlotinib inibiu marcadamente a proliferação de células tumorais e angiogénese in PC-9 /xenoenxertos Vec, enquanto erlotinib não afectou a proliferação celular significativamente a angiogénese ou no PC-9 xenoenxertos /HGF (Fig. 4). Em contraste, o temsirolímus marcadamente inibiu a proliferação celular e angiogênese em ambos os PC-9 tumores /HGF PC-9 /Vec e. Estes achados sugerem que o temsirolimus inibe o crescimento de tumores PC-9 /HGF (pelo menos em parte) por inibição da angiogénese.
ratinhos SCID com PC-9 /Vec ou PC-9 tumores /HGF foram administrados como descrito na Fig. 3B. Quatro horas após a administração final de erlotinib, os tumores foram colhidos, e proliferação de células tumorais (A, B: Ki-67) e a angiogénese (C, D: CD31) foram determinadas por imuno-histoquímica. quantificação B e D mostram de células positivas.
* P 0,01, (one-way ANOVA). As barras mostram SD.
Para explorar ainda mais os mecanismos moleculares pelos quais temsirolímus angiogênese inibida, examinamos o seu efeito sobre a produção de células de tumor de VEGF, uma molécula pró-angiogênico proeminente. Ambos PC-9 /Vec células PC-9 e produzida constitutivamente níveis detectáveis de VEGF, que foi estimulada por HGF (Fig. 5A). Consistente com estas observações, as células PC-9 /HGF produziram níveis mais elevados de VEGF do que 9 PC-Vec células /PC-9 e. Temsirolímus suprimida a produção de VEGF em células cancerosas estas, na presença ou ausência de HGF. Derrube de mTOR por siRNA resultou na inibição da produção de VEGF por 9 PC células /HGF PC-9 /Vec e, assim como o tratamento temsirolimus (Fig S2). Estes resultados indicam que a produção de VEGF inibida por temsirolímus mesmo na presença do HGF é devida à inibição de mTOR. Também avaliamos o efeito directo do temsirolímus sobre a viabilidade das células endoteliais
in vitro
. Temsirolímus não inibiu a viabilidade das células constitutiva HMVEC em meio com FBS a 10% por si só (Figura 5B). VEGF e HuMedia-MvG, que contêm EGF e factor de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2), aumentou a viabilidade de HMVECs. Temsirolímus, em concentrações de 1 nM e superiores, inibiu este aumento de viabilidade. Estes resultados indicam que o temsirolimus inibe a angiogénese por vários mecanismos. As células tumorais
(A) foram incubadas com ou sem HGF (50 ng /ml) na presença de diferentes concentrações de temsirolímus durante 48 h. Em seguida, os sobrenadantes foram recolhidos e o número de células tumorais foi contado. concentração de VEGF nos sobrenadantes foi determinada por ELISA. os níveis de VEGF corrigidos pelo número de células de tumor são mostradas. (B) HMVECs foram incubadas em meio RPMI-1640 com FBS a 10% (controlo), meio RPMI-1640 com 10% -FBS acrescida de VEGF, ou HuMedia-MvG com diferentes concentrações de temsirolímus durante 72 h. Em seguida, a viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de MTT. As barras mostram SD. Os dados mostrados são 2 experimentos independentes com resultados semelhantes.
Discussão
No presente estudo, demonstramos que os inibidores de mTOR suprimiu o crescimento da
EGFR
mutante de pulmão células cancerosas, mesmo na presença de HGF,
in vitro
e
in vivo
. Os nossos resultados também indicam que os inibidores de mTOR suprimem a angiogénese por inibição da produção de VEGF e a proliferação endotelial estimulada com vários factores pró-angiogénicos. Estas observações sugerem que os inibidores de mTOR, como agentes monoterapêuticas, são úteis para controlar a progressão de
EGFR mutante
cancro do pulmão e resistência HGF-desencadeada a EGFR-TKI.
HGF, também chamada factor de dispersão , é uma citocina multifuncional [31]. Estudos recentes mostraram que HGF está envolvido na carcinogênese, invasão /motilidade, EMT, angiogênese e metástase em câncer de pulmão, e é, portanto, associada com mau prognóstico dos pacientes [32]. Nós relatado anteriormente que HGF induz EGFR-TKI-resistência no
EGFR
cancro do pulmão células mutantes por restaurar MET /PI3K /AKT sinalização [10]. A sobre-expressão de HGF está envolvido não só na resistência adquirida, mas também a resistência intrínseca a EGFR-TKI [21]. Além disso, o HGF estimula a produção de VEGF por
EGFR
células mutantes de câncer de pulmão, bem como facilita a angiogênese, promovendo assim a progressão do tumor [24]. HGF superexpressão é muitas vezes co-detectado com o
EGFR
-T790M mutação gatekeeper em tumores resistentes adquiridos [9], [11], [21]. HGF induz resistência a irreversível EGFR-TKI e TKI EGFR mutantes selectivo [33], que foram desenvolvidos para superar mediada por T790M resistência EGFR-TKI. Ensaios clínicos recentes com irreversíveis monoterapia TKI não conseguiu demonstrar uma resposta objectiva em
EGFR
pacientes com câncer de pulmão mutantes que foram refractários ao tratamento com o EGFR-TKI-gefitinib e erlotinib [34] reversível. Estes resultados sugerem que a co-existência de sinalização HGF alterada contribui para a resposta desfavorável para irreversível EGFR-TKI nestes doentes [32]. Além disso, a presença do HGF acelera o crescimento de pré-existentes clones resistentes a EGFR-TKI que Harbor
MET
amplificação [35]. Mais recentemente, o HGF foi relatado para induzir resistência à ALK inibidores seletivos em
EML4-ALK
câncer de pulmão [36] e inibidores de BRAF em
BRAF
melanoma mutante [37]. Tal evidência acumulada indica que HGF é um alvo comum para superar a resistência às drogas-alvo em tumores oncogene-viciado.
Nossos resultados também sugerem que os inibidores de mTOR tem vantagem de vários mecanismos para suprimir o crescimento da resistência EGFR-TKI desencadeada por HGF em
EGFR
cancro do pulmão células mutantes. Por exemplo, estes inibidores de sinais de sobrevivência bloco mTOR /p70S6K /4E-BP1 prováveis que são normalmente envolvidas durante a activação de PI3K /AKT em células cancerosas. A /AKT /mTOR via PI3K contribui para a sobrevivência da
EGFR
cancro do pulmão células mutantes [38], [39]. Nós relatado anteriormente que esta via é também crucial para a aquisição de resistência HGF-acionado para EGFR-TKI em
EGFR
cancro do pulmão células mutantes [40]. No presente estudo, tanto temsirolimus e everolimus parcialmente suprimida a fosforilação de p70S6K e 4E-BP1, assim como inibiram a sobrevivência de
EGFR
células cancerosas mutantes
in vitro
. Assim, os inibidores de mTOR alcançar a inibição do crescimento por suprimir ambos os sinais de sobrevivência de EGFR e sinais de resistência de MET em células cancerosas.
Outro mecanismo possível é a inibição da angiogénese. Estudos recentes relataram que a sinalização mediada pelo mTOR estimula a transcrição HIF-1α, que regula o VEGF, através de 4E-BP1 fosforilação [41]. inibidores de mTOR suprimir a transcrição HIF-1α e deste modo inibir a produção de VEGF [28], [29], [41] – [43]. Nós relatado anteriormente que HGF ativa a via MET /Gab1 e aumenta a produção de VEGF por
EGFR
cancro do pulmão células mutantes [24]. No presente estudo, confirmou esta conclusão e ainda demonstrado que os inibidores de mTOR suprimida tanto a produção VEGF constitutiva e produção de VEGF HGF estimulada. Além disso, verificou-se que enquanto os inibidores de mTOR não afectou a viabilidade das células endoteliais não estimuladas, que inibiu a proliferação endotelial estimulada por vários factores pró-angiogénicos, incluindo VEGF. mTOR é activado a seguir acoplamento de várias tirosina-quinases receptoras tais como o VEGFR-2, EGFR, FGFR-1 e [41]; Assim, os inibidores de mTOR pode revogar a estimulação causada por vários factores pró-angiogénicos em células endoteliais. Assim, os inibidores de mTOR pode suprimir a angiogénese, pelo menos, 2 modos de acções. Em primeiro lugar, eles podem inibir a produção de VEGF, mesmo na presença do HGF. Em segundo lugar, eles podem inibir a proliferação de células endoteliais que é estimulada por vários factores pró-angiogénicos.
Os resultados dos ensaios clínicos recentes com medicamentos direcionados indicam a importância da seleção dos pacientes. Por exemplo, a taxa de resposta de gefitinib foi de apenas 10-20% em NSCLC não seleccionado [44], mas foi cerca de 80% em
EGFR
mutação-positiva NSCLC [43]. A sobrevida livre de progressão da
EGFR
pacientes com câncer de pulmão mutantes também foi muito mais longa do que a dos pacientes com NSCLC não selecionados [45]. Embora um grande número de inibidores de mTOR, foram desenvolvidos e estão a ser avaliadas em ensaios clínicos em cancro do pulmão, nem do sirolimus, temsirolímus, ou everolimus, quando utilizados como agentes de monoterapêuticas, mostram uma eficácia clínica em NSCLC não seleccionado [46] [47]. Além disso, estudos recentes de inibidores de mTOR combinados com o EGFR-TKI também não conseguiu mostrar um benefício clínico em NSCLC não seleccionado [46], [48] – [50]. Nosso estudo atual é pré-clínico, e nós demonstramos que os inibidores de mTOR mostrou eficácia considerável em células de câncer de pulmão com resistência HGF mediada à resistência EGFR-TKI tanto
in vitro
e
in vivo
. Dong et ai. também relatada a actividade anti-tumoral dos inibidores de mTOR contra o EGFR-TKI resistente
EGFR
células de cancro do pulmão mutantes com a mutação T790M gatekeeper [51]. Ambos os HGF e T790M mutações gatekeeper são frequentemente detectada em tumores resistentes EGFR-TKI, onde eles contribuem para a resistência. Portanto, estas observações ilustram a necessidade de ensaios clínicos com inibidores de mTOR em
pacientes EGFR
mutante de câncer de pulmão que se tornam refratários ao gefitinib e erlotinib. Além disso, desde HGF confere resistência a medicamentos direcionados em vários tipos de tumores, os ensaios clínicos de inibidores de mTOR são garantidos.
Informações de Apoio
Figura S1. inibidores de mTOR
não sensibilizaram ainda mais
EGFR
cancro do pulmão células mutantes para erlotinib
in vitro
. Vec células PC-9 /foram incubadas com ou sem temsirolímus (A) ou everolimus (B), na presença ou ausência de HGF (20 ng /ml) e erlotinib (0,3 uM) durante 72 h. Em seguida, a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio do MTT. As barras mostram SD. Os dados mostrados são representativos de 3 experiências independentes com resultados semelhantes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062104.s001
(TIF)
Figura S2.
knock-down do crescimento celular inibido mTOR e produção de VEGF. As células tumorais foram transfectadas com ARNsi de controlo ou de mTOR, durante 24 h e (A) os lisados de células foram colhidas e submetidas a transferência de Western.