Abstract

Pramanicin (PMC) é um agente antifúngico que foi anteriormente demonstrada para expor propriedades antiangiogênicas e anticancerígenos em alguns

in vitro

estudos. Nós inicialmente pesquisados ​​uma série de análogos de PMC para os seus efeitos citotóxicos em células de cancro do cólon humano HCT-116. PMC-A, o análogo com o efeito anti-proliferativo mais potente foi escolhido para interrogar ainda mais o mecanismo subjacente de acção. PMC-A levou a apoptose através da ativação de caspase-9 e -3. A natureza apoptótica da morte celular foi confirmada por abolição da morte celular com pré-tratamento com inibidores da caspase específicos. MAPKs JNK e p38 foram ambos activado Concomittantly com a via apoptótica intrínseca relacionados ao estresse. Além disso, a inibição farmacológica de p38 demonstrou atenuar a indução da morte celular durante o pré-tratamento com inibidor de JNK não exibem um efeito protector. Resistência do Bax – /- células e a natureza de protecção de caspase-9 inibição indicam que as mitocôndrias desempenham um papel central na PMC-A apoptose induzida. Cedo elevação pós-exposição do BIM celular Bax e foi seguido por um marginal Bcl-2 e clivagem de Bid depleção. Outras análises revelaram que a proteína Bcl-2 downregulation ocorre ao nível do ARNm e é crítica para mediar PMC-A apoptose induzida, como ectópica expressão de Bcl-2 poupado substancialmente as células da morte. Por outro lado, a expressão forçada de Bim provou aumentar significativamente a morte celular. Além disso, análises de p53 – /- demonstraram que células Bcl-2 /Bim /Bax modulação e MAPK activações ter lugar independentemente da expressão de p53. Tomados em conjunto, independente de p53 transcricional de Bcl-2 e a regulação negativa de sinalização de p38 parecem ser os principais eventos moduladores em PMC-A apoptose induzida

citação:. Bodur C, Kutuk ó, Karsli-Uzunbas L, Isimjan TT, Harrison P, Basaga H (2013) Pramanicin Analog induz a apoptose em células cancerígenas do cólon humano: Papéis críticos para Bcl-2, Bim e p38 MAPK sinalização. PLoS ONE 8 (2): e56369. doi: 10.1371 /journal.pone.0056369

editor: Jose Vina, Universidade de Valência, Espanha |

Recebido: 22 Outubro, 2012; Aceito: 08 de janeiro de 2013; Publicação: 18 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Bodur et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento para o trabalho foi fornecido pela Universidade Sabanci fundos de pesquisa da faculdade. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Uma multidão de moléculas que ocorrem naturalmente ou sintetizados foi rastreada para o seu uso terapêutico na medicina humana ou veterinária. Tendo sido explorados como desinfetantes e conservantes na indústria, agentes antifúngicos não foram excepções a esta. Pramanicin (PMC) é um produto de fermentação de fungos pertencentes a uma classe de agentes anti-fúngicos definidos por uma cabeça polar altamente functionilized e uma cadeia lateral alifática. O anterior

in vitro

análises sobre endoteliais cultivadas e células T leucémicas confirmou o seu potencial terapêutico tanto como um agente antiangiogênico e anticancerígeno [1], [2].

A exposição prolongada ao

in vitro

doses eficazes de PMC foi mostrado anteriormente para diminuir a viabilidade celular e a apoptose dependente de desencadear caspase [2]. morte celular induzida por PMC foi demonstrado ser mediada por activação de ambos quinases p38 MAP quinase relacionada com o stress (MAPK) e c-Jun N-terminal kinase (JNK), enquanto que a actividade extracelular da quinase regulada (ERK) foi relatado para significativamente diminuir após a exposição ao agente. Apesar de um aumento de cálcio intracelular transiente foi relatado a seguir a exposição PMC em células endoteliais pulmonares cultivadas, este fenómeno não foi sincronizado com o disfunção endotelial ou morte de células [1].

tensões ambientais, incluindo radiação físicos ou químicos, stress osmótico , e ligandos de receptores de stress oxidativo ou de superfície celular, tais como factores de crescimento, citoquinas inflamatórias ou ligandos de receptor de morte pode activar uma quinase de cascata que eventualmente estimula activada pelo stress p38-MAPK e JNK. A montante serina /treonina quinases quinase MAP quinase quinase (MEKKs) e cinases de MAP quinase (MKKs) são responsáveis ​​pela activação por fosforilação e subsequente translocação nuclear de JNK e p38 [3]. Uma vez activada, a JNK e p38 são conhecidos por serem capazes de modulação de apoptose através da activação /desactivação de uma série de factores de transcrição.

A apoptose é um mecanismo de morte celular firmemente regulado que é activada em resposta a vários estímulos extracelulares /intra- como o stress oxidativo e radiação eletromagnética que danificar macromoléculas celulares ou sinais incluindo citocinas inflamatórias e fatores de crescimento. execução apoptótica é assumido por uma família de cisteína proteases chamadas caspases que são activados de um modo bem definido [4]. Enquanto a via intrínseca de libertação é acionada por molécula apoptogénica das mitocôndrias, a via extrínseca é activada através da ligação do ligando a receptores de morte na superfície da célula. Se o circuito apoptótico intrínseca ou extrínseca vão estar em acção é geralmente determinado pela natureza do estímulo. Independente da via que foi ativado inicialmente, ambas as vias intrínseca e extrínseca poderiam estar envolvidos para amplificar o sinal de apoptose em diferentes circunstâncias.

liberação de citocromo c das mitocôndrias, que marca o ponto de não retorno para a atividade apoptótica intrínseca é intricada regulada por interações entre Bcl-2 família de proteínas. O equilíbrio delicado entre os membros pró-apoptóticos e anti-família da carga determina a apoptose no interior da célula. Vários domínios pró-apoptóticos Bcl-2 proteínas Bax e Bak têm a capacidade de homo- /heterooligomerization na membrana mitocondrial externa (OMM) que faz com que a permeabilização da OMM e libertação de moléculas apoptogénicas incluindo citocromo c para o citosol. Embora o anti-apoptóticos Bcl-2 tais como as proteínas Bcl-2, Bcl-xL, A1 e Mcl-1 manter pró-apoptótica Bax /Bak sequestrado impedindo-os de iniciar OMM permeabilização, pró-apoptótica de BH3 (Bcl-2 a homologia 3) proteínas exigidos apenas incluindo Bim, Bid, Noxa, Bad e Puma poderia trabalhar para neutralizar os membros anti-apoptóticos da família [5], [6]. Embora os mecanismos exactos que modulam a Bcl-2 proteínas ainda permanecem obscuros, em grande medida, o equilíbrio entre as quantidades relativas e as actividades celulares de pró-proteínas e anti-apoptóticos Bcl-2 é conhecida por ser rigorosamente controlada nos níveis de genes e de proteínas em células de mamíferos saudáveis . A este respeito, os níveis celulares de BH3-somente proteínas Bcl-2 pró-apoptóticos em relação aos seus homólogos anti-apoptóticas é crítica para definir Bax /Bak livre para iniciar o circuito apoptótico intrínseca.

Para além dos seus papéis na reparação do ADN e regulação do ciclo celular, o bem conhecido supressor tumoral p53 foi demonstrado ser capaz de regular directamente a apoptose. Até agora, este regulamento tem sido demonstrada a ocorrer através da modulação das expressões proteína Bcl-2 família ou do receptor de morte. Além transcricionalmente upregulating Bax, Bid, Puma, Noxas, Bak e receptores de morte transmembrana como um factor de transcrição, p53 também foi relatado para ser capaz de activar directamente Bax ao nível das proteínas [7] – [13]. Evidências recentes também indicam que a própria p53 pode também comportar-se como uma única proteína de BH3-pró-apoptótica de proteínas anti-apoptóticos antagonizam a Bcl-2, bem como causando a transrepressão de transcrição do gene anti-apoptótico Bcl-2 [14] – [17].

neste estudo, definimos um mecanismo para a activação da via intrínseca de apoptose desencadeada por PMC-a, um análogo de PMC potente no qual o grupo epoxi na cadeia lateral de PMC é substituído por um alceno (Fig. 1). PMC-A apoptose através da ativação independente de p53 de p38 e Bcl-2 downregulation mediada no HCT-116 células cancerígenas do cólon humano. Concomitantemente, Bax e Bim foram ambas acumuladas nas células expostas a PMC-A com a subsequente truncamento Bid.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e tratamentos

Wild- tipo (em peso), p53 – /-, e Bax – /- células cancerígenas do cólon humano HCT116 foram gentilmente cedidas por Bert Vogelstein (Howard Hughes Medical Institute, Universidade Johns Hopkins, EUA) [18], [19], cultivadas em 5A de McCoy suplementado com FBS a 10% HI e 100 UI /ml de penicilina /estreptomicina. As culturas foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. Etanol (máximo 0,5%, v /v) foi adicionado a todos os poços /placas de controlo em cada experiência. As células foram recolhidas, quantificados em meio completo e semeado (100000 células /mL) em 12 poços, 6 poços de cultura ou de placas de 60 milímetros, dependendo da experiência. Pramanicin e análogos foram adicionados para as placas de cultura de 36 horas mais tarde. Pré-tratamento com inibidores foram feitas por 30 minutos antes da PMC-Um tratamento.

Reagentes e Analog síntese |

Geral.

espectros Proton NMR foram registados em CDCl

3 ou CD

3OD num Bruker AC-200 ou AC-600 espectrómetro e são relatados como se segue: δ desvio químico (ppm); número de protões, multiplicidade, o acoplamento J constante (Hz), e atribuição. solventes próticos residuais CHCl

3 (δ = 7,26 ppm) e CH

3OH (δ = 3,30) foram usadas como referência interna.

RMN de 13C Os espectros foram registados em CDCl

3 ou CD

3OD a 50 MHz num espectrómetro Bruker AC-200 a 150 MHz num espectrómetro Bruker AC-600, usando a ressonância central da CDCl

3 (δ = 77,16 ppm) como referência interna. Os espectros de infra-vermelhos foram registados num aparelho Perkin-Elmer 983G. Os espectros de massa foram obtidos num Micromass Quattro Ultima (LC-ESI /APCI Triplo Quadrupolo Espectrómetro de Massa) no Departamento de Química, Universidade McMaster. Foram usadas as seguintes técnicas de ionização: ionização de electrões (EI), e por electropulverização (ES). Os pontos de fusão foram determinados num aparelho de placa quente Reichert. As rotações ópticas foram registadas num aparelho Perkin-Elmer (241 MC Polarímetro, λ = 589, Na lâmpada).

Pramanicin (PMC) e pramanicin A (PMC-A) foram preparados como descrito previamente [20]. A cromatografia flash em coluna foi realizada sobre gel de sílica (gel de sílica 60). Cromatografia em camada fina (TLC) foi realizada em placas de sílica pré-revestidas (Alugram SIL G /UV

254) e visualizadas por UV, vanilina ou uma solução de nitrato de amónio cérico. As soluções aquosas foram saturada, a menos que especificado de outra forma. A proporção dos solventes nas misturas refere-se os volumes utilizados. Todas as reacções foram realizadas sob uma atmosfera de azoto ou árgon, em material de vidro seco no forno, que foi arrefecida sob uma corrente contínua de azoto, imediatamente antes da utilização, a menos que indicado de outra forma. THF foi destilado a partir de cetil benzofenona de sódio, CH

2Cl

2 e tolueno de hidreto de cálcio, e EtOAc de carbonato de potássio. Outros solventes e reagentes foram usados ​​tal como fornecidos.

3-tetradecanoil-1-vinylpyrrolidin-2-ona (2).

recentemente destilada

N-2-

-vinylpyrrolidin um (1) (0,96 mL, 9 mmol) foi adicionado a NaH (1,44 g, 36 mmol) em THF sob refluxo (15 ml). A mistura foi agitada durante 30 min a 90 ° C, e, em seguida, acetato de miristato (4,3 mL, 10,3 mmol) foi adicionado. Após 3 h, a solução foi aquecida até à temperatura ambiente, extinguiu-se com solução aquosa saturada de NH

4Cl, e extraiu-se com éter. Os extractos foram secos (Na

2SO

4), filtrada, e concentrada. O sólido resultante foi dissolvido em CH

2Cl

2, filtrou-se e concentrou-se, e purificou-se por cromatografia (CH

2Cl

2 /EtOAc, 01:01) para dar 2 como cristais brancos (3,54 g , 82%): pf 39-40 ° C; IV (película) 2920, 2851 (C-H, str.), 1685, 1637 (C = O, Str.), 1459 (C = C, curva.), 1391, 861 centímetros

-1;

1 H-NMR (CDCl

3, 200 MHz) δ 7,01 (1H, dd,

3 J = 9,0,

3 J = 16,0, NCH = CH

2), 4,46 (2H, m , NCH = CH

2), 3,68 (1H, dd,

3 J = 9,0,

3 J = 6,0, COCHCO), 3,54 (1H, ddd,

2J = 9,0,

3J = 8,5,

3 J = 5,5, CH

2 N), 3,47 (1H, ddd,

2J = 9,0,

3 J = 8,5,

3 J = 5,7, CH

2 N) , 3,01 (1H, m, CH

2CH

2CO), 2,68 (1H, m, CH

2CH

2CO), 2,67 (1H, dddd,

2J = 13,8,

3J = 5,7,

3 J = 8,5,

3 J = 6,0, CH

2CH

2 N), 2,12 (1H, dddd,

2J = 13,6,

3 J = 8,5,

3 J = 9,0,

3 J = 5,5, CH

2CH

2 N), 1,57 (2H, m, CH

2CH

2CO), 1,24 (20H, m, C

10H

20), 0,87 (3H, t,

2J = 6,7, CH

3CH

2);

13 C RMN (CDCl

3, 50 MHz); δ 204,2 (CH

2CO), 169,9 (CON), 130,0 (NCH = CH

2), 94,5 (NCH = CH

2), 57,3 (COCHCO), 44,0 (CH

2 N) , 43,5 (CH

2CH

2CO), 32,7, 30,4, 30,2, 29,8, 24,1, 23,5 (C

10H

20), 20,1 (CH

2CH

2CH

2), 14,9 (CH

3); MS (EI

+) m /z = 321 (M

⋅ +), HRMS (EI) calculado para C

20H

35NO

2 (M

⋅ +) 321,2668 , encontrado 321,2679.

3-Tetradecanoylpyrrolidin-2-ona (3).

Composto 2 (520 mg, 1,6 mmol) foi aquecida a 90 ° C numa mistura de 95% de C

2H

5OH (35 mL) e HCl concentrado (0,5 mL). A reacção foi monitorizada por TLC. A solução foi arrefecida até à temperatura ambiente, secou-se (Na

2SO

4), filtrada, e concentrada. O sólido resultante foi purificado por cromatografia (CH

2Cl

2 /EtOAc, 01:01) para dar 3 como cristais brancos (241 mg, 50,4%): pf 73-74 ° C; IV (película) 3226 (N-H Str.), 2920, 2851 (C-H, str.), 1716, 1671 (C = O, Str.), 1468, 1375, 1278 cm

-1;

1 H-NMR (CDCl

3, 600 MHz) δ 5,73 (1H, largo s, NH), 3,50 (1H, dd,

3 J = 9,0,

3J = 6,0 COCHCO), 3,44 (1H , ddd,

2J = 9,0,

3 J = 8,5,

3 J = 5,5, CH

2 N), 3,34 (1H, ddd,

2J = 9,0,

3 J = 9,0 ,

3 J = 5,4, CH

2 N), 2,95 (1H, ddd,

2J = 17,4,

3 J = 7,4,

3 J = 7,5 CH

2CH

2CO ), 2,57 (1H, ddd,

2J = 17,4,

3 J = 7,2,

3J = 7,2 CH

2CH

2CO), 2,65 (1H, dddd,

2J = 11,0,

3 J = 5,4,

3 J = 9,0,

3 J = 9,0, CH

2CH

2 N), 2,17 (1H, dddd,

2J = 11,0,

3J = 8,5,

3 J = 9,0,

3 J = 5,5, CH

2CH

2 N), 1,59 (2H, m, CH

2CH

2CO), 1,23 (22H, m, C

11H

22), 0,88 (3H, t,

3 J = 6,8, CH

3CH

2);

13 C RMN (CDCl

3, 150 MHz) δ 205,9 (CH

2CO), 171,6 (CONH), 53,9 (COCHCO), 42,9 (CH

2CO), 40,6 (CH

2N), 32,1 (CH

3CH

2CH

2), 29.8~29.2, 23,5 (CH

2CH

2CH

2CO), 22,9 (CH

2CH

2CH

2 NH), 14,9 (CH

3); MS (EI

+) m /z = 295 (M

⋅ +), HRMS (EI) calculado para C

18H

33NO

2 (M

⋅ +) 295,2511 , encontrado 295,2554.

(2R, 5S) -2- (p-fluorofenil) -3-oxa-1-azabiciclo [3.3.0] octan-8-ona (4).

Uma solução de 5-hidroximetilpirrolidina-2-ona (580 mg, 5 mmol) e

P

-fluorobenzaldehyde (810 mg, 6,5 mmol) em tolueno (20 ml) contendo PPTS (30 mg) foi aquecida a de refluxo durante 13 horas usando um separador de água de Dean-Stark. Após arrefecimento, a solução foi diluída com EtOAc, lavada com NaHCO saturado

solução aquosa a 3, depois com salmoura, secou-se (MgSO

4), e evaporou-se sob pressão reduzida para dar um óleo castanho. A separação cromatográfica sobre gel de sílica por eluição com CHCl

3 deu 4 como um óleo amarelo pálido (586 mg, 53%): IV (película) 2920, 2851 (CH, Str.), 1701 (C = O, Str. ), 1559, 1507, 1437 (aromático C = C bend) 1301, 1099, 821, 668 cm

-1.;

1 H-NMR (CDCl

3, 200 MHz) δ 7,34 (2H, dd,

3 J = 8,0,

4J = 5,5, H-Ph), 6,95 (2H, dd,

3 J = 8,6,

4J

IC = 8,6, H-Ph), 6,20 (1H, s, OCHPh), 4,15 (1H, dd,

2J = 7,4,

3 J = 6,4, CH

2O), 4,04 (1H, m, NCHCH

2O), 3,40 (1H, t,

2J = 7,4,

3 J = 7,6, CH

2O), 2,74 (1H,

2J = 17,4

3 J = 9,6,

3 J = 9,4, CH

2CO), 2,47 (1H, ddd,

2J = 17,4,

3 J = 3,7,

3J = 9,8, CH

2CO), 2,31 (1H, dddd,

2J = 20,2,

3 J = 3,7,

3 J = 7,6,

3 J = 7,0, CH

2CH

2CHN), 1,87 (1H, dddd,

2J = 20,2,

3 J = 4,7,

3 J = 9,4,

3 J = 9,8, CH

2CH

2CHN) ;

13 C RMN (CDCl

3, 50 MHz) δ 178,2 (CON), 163,5 (1C, d,

1J

CF = 244,4, CF), 129,5 (2C, d,

3J

CF = 8,2, CHCHCF), 115,4 (2C, d,

2J

CF = 21,5, CHCF), 86,7 (OCHPh), 71,8 (CH

2O), 58,9 (NCH), 33,6 (COCH

2), 23,1 (COCH

2CH

2).

(2R, 5S) -2- (p-f luorofenil) -7-tetradecanoil-3-oxa- 1-azabiciclo [3.3.0] octan-8-ona (5).

a uma solução de lactama protegida 4 (222 mg, 1 mmol) e HMPA (5 ml) em THF (15 mL), LiN (TMS)

2 (1,0 M, 1,3 mL, 1,3 mmol) em THF foi adicionado a -78 ° C. A mistura de reacção foi agitada durante 30 min, e depois acetato de miristato (0,4 mL, 1,2 mmol) foi adicionado. A solução foi lentamente aquecida até à temperatura ambiente. Após 3 h, a mistura reaccional foi desactivada com solução saturada de NH

4Cl solução aquosa, extraiu-se com éter, e o extracto foi seco (Na

2SO

4), e concentrou-se. O produto resultante foi purificado por cromatografia (hexanos /EtOAc, 02:01) para dar 5 como cristais brancos (233 mg, 53%) que foi formado como uma mistura de dois diastereómeros: pf 60-62 ° C; IV (película) 2918, 2851 (CH, Str.), 1716, 1681 (C = O, Str.), 1559, 1512 (aromático C = C curvatura.), 1401, 1240, 1035, 802 centímetros

– 1; MS (EI

+) m /z = 431 (M

⋅ +), HRMS (EI) calculado para C

26H

38NFO

3 (M

⋅ +) 43,2913 , encontrado 431,2914.

(5R) -5- (hidroximetil) -3-tetradecanoylpyrrolidin-2-ona (6).

Uma solução de lactama protegida 5 (50 mg, 0,15 mmol) em 5 mL de AcOH /THF /H

2O (03:07: 1) foi aquecida a 90 ° C durante 3 h. O benzeno (30 ml) foi adicionado à mistura e evaporou-se sob pressão reduzida. A cromatografia flash foi realizada (EtOAc /CH

3OH, 10:01) para produzir 6 como cristais brancos (22 mg, 60%) de uma mistura de diastereómeros: pf 73-76 ° C; IV (película) 3385 (NH Str.), 3307 (OH, Str.), 2920 (C-H, str.), 1699, 1653 (C = O, Str.), 1457, 1119 centímetro

-1; MS (EI

+) m /z = 325 (M

⋅ +), HRMS (EI) calculado para C

19H

35NO

3 (M

⋅ +) 325,2617 , encontrado 325,2599.

(2S, 5S, 7R) -7-hidroxi- (4-fluorofenil) -3-oxa-1-azabiciclo [3.3.0] octan-8-ona (7).

Composto 6 (200 mg, 0,46 mmol) foi adicionado a uma suspensão de CeCl

3.7H

2O (5,6 mg, 0,015 mmol) em 2 ml

i-PrOH

. A suspensão foi misturada fazendo borbulhar ar através do mesmo durante 2 h à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi concentrada. A cromatografia flash foi realizada (CH

2Cl

2 /EtOAc, 01:01) para dar 7 como um óleo incolor (120 mg, 57%): (. OH, str) IV (película) 3384, 1715, 1698 (C = O, str.), 1511, 1230, 1156 cm

-1; [Α]

D

23 = -0,05

0 (c = 0,8 g /100 ml, CH

3OH);

RMN de 1H (DMSO-d

6, 600 MHz) δ 7,41 (2H, dd,

3 J = 8,9,

4J = 5,5, H-Ph), 7,23 (2H, dd,

3 J = 8,9,

4J

IC = 8,9, H-Ph), 6,62 (1H, s, OH), 6,11 (1H, s, H-Ph), 4,28 (1H, dd,

2J = 8,1,

3 J = 8,4, CH

2O), 4,01 (1H, dddd,

3 J = 6,8,

3 J = 7,0,

3 J = 8,4,

3J = 6,0, NCHCH

2), 3,51 (1H, t,

2J = 8,4,

3 J = 8,1, CH

2O), 2,75 (1H, dd,

2J = 13,0,

3 J = 6,8, CH

2CHN), 2,69 (2H, dd,

2J = 18,5,

3 J = 7,2, CH

2CH

2CO), 1,90 (1H, dd ,

2J = 13,0,

3 J = 7,0, CH

2CHN);

13C RMN (DMSO-d

6, 150 MHz) δ 209,3 (CH

2CO), 172,3 (CON), 162,2 (

1J

CF = 244,4, C-Ph), 134,7 (C-Ph), 128,3 (2C,

3J

CF = 8,4, C-Ph), 115,2 (2C,

2J

CF = 21,7, C-Ph), 87,7 (C OH), 85,6 (CH-Ph), 72,2 (CH

2O), 54,6 (CH

2CHN), 37,2 (CH

2CHN), 36,2 (CH

2CH

2CO) , 22,6 (CH

2CH

2CO), 22.05~31.25, 13,9 (CH

3CH

2); MS (EI

+) m /z = 447 (M

⋅ +), HRMS (EI) calculado para C

26H

42FN

2O

4 [(M

⋅ + NH

4)

+] 465,3129 encontrado 465,3126.

(3S, 5R) -3-hidroxi-5- (hidroximetil) -3-tetradecanoil pirrolidin-2-ona (8 )

Uma solução do composto 7 (60 mg, 0,13 mmol) em 5 mL de AcOH /THF /H

2O (3:07:. 1) foi aquecida a 90 ° C durante 3 h. C

6H

6 (30 ml) foi adicionado à mistura e evaporou-se sob pressão reduzida. A cromatografia flash foi realizada (EtOAc /CH

3OH, 10:01) para originar 8 na forma de cristais brancos (22 mg, 48%): pf 74-76 ° C; IV (película) 3300 (NH, Str.), 3226 (OH, Str.), 2995, 2849 (C-H, str.), 1688, 1650 cm

-1 (C = O, Str.); [Α]

D

23 = -4,25 ° (c = 0,04 g /100 ml, CH

3OH); 1H NMR (CD

3OD, 600 MHz) ô 3,81 (1H, dddd,

3 J = 4,9,

3 J = 5,4,

3 J = 6,3,

3 J = 7,9, CH

2CHN), 3,62 (1H, dd,

2J = 11,1,

3 J = 4,9, CH

2O), 3,53 (1H, dd,

2J = 11,1,

3J = 6,3 , CH

2O), 2,74 (2H, m, CH

2CH

2CO), 2,38 (1H, dd,

2J = 14,1,

3 J = 5,4, CH

2CHN ), 2,10 (1H, dd,

2J = 14,1,

3 J = 7,9, CH

2CHN), 1,56 (2H, m, CH

2CH

2CO), 1,31 (3H, t,

3 J = 7,0, CH

3CH

2);

13 C RMN (CD

3OD, 150 MHz) δ 212,2 (CO), 176,7 (CON), 84,5 (COH), 65,5 (CH

2 OH), 54,3 (CHN), 38,7 (CH

2CO), 33.1~30.8, 24,3 (CH

2CH

2CO), 14,4 (CH

3CH

2); MS (EI

+) m /z = 341 (M

⋅ +), HRMS (EI) calculado para C

19H

35NO

4 (M

⋅ +) 341,2617 encontrado 341,2599.

PMC e análogos foram dissolvidos em etanol. 5A de McCoy, de FBS e antibióticos eram de Pan Biotech GmbH (Aidenbach, Alemanha). cocktail de inibidores de fosfatase (PhosStop) e mistura de inibidores de protease foram obtidos a partir de Roche (F. Hoffman-La Roche Ltd., Basileia, Suíça). Anexina V (FITC) foi de Alexis Biochemicals (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, EUA). Caspase-3 clivada, caspase-9, JNK, P-JNK, p38, P-p38, Bcl-2, Bax anticorpos, Bid, Bim e β-actina foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA, EUA ). Inibidores de MAPK SP600125 e SB203580 eram da Calbiochem (La Jolla, CA, EUA). inibidores de caspases Z-VAD-FMK (inibidor geral de caspases), Z-DEVD-FMK (caspase-3 inibidor), Z-LEHD-FMK (caspase-9 inibidor), e Z-IETD-FMK (caspase-8 inibidor) foram adquiridos a BD Biosciences (San José, CA, EUA). Tris, glicina e Tween-20 foram de Molekula Ltd (Shaftesbury, Reino Unido). Todos os outros produtos químicos foram obtidos a partir de Sigma (Darmstadt, Alemanha).

MTT de viabilidade celular Asssay

viabilidade celular após exposição a análogos de PMC foi determinada utilizando um MTT (tetrazólio dimetil tiazolilo difenil) estojo de ensaio ( Roche, Mannheim, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células HCT116 wt em placas de 96 poços foram tratadas como indicado, e 10 ul de reagente de marcação de MTT foi adicionado a cada poço, após o que as placas foram incubadas durante 4 horas. As células foram então incubadas em 100 ul da solução de solubilização por 12 horas, e a absorvância foi medida com um leitor de placas de microtitulação (Bio-Rad, CA, EUA) a um comprimento de onda de teste de 550 nm e um comprimento de onda de referência de 650 nm. percentagem de viabilidade foi calculada por (OD OD de amostra /controlo tratado com fármaco) x 100.

Citometria de Fluxo

A morte celular foi determinada por um ensaio de Anexina-V afinidade. Em peso, p53 – /-, e Bax – /- células HCT116 semeadas em placas de 12 poços foram transfectadas /tratados como indicado, transferido para tubos de citometria de fluxo e as células foram colhidas por centrifugação a 300 g durante 5 minutos. Em seguida, as células foram ressuspensas em 1 ml de PBS frio e de novo centrifugado a 300 g durante 5 minutos. Após remoção do sobrenadante, as células foram incubadas em tampão de Anexina V (HEPES 140 mM, NaCl 10 mM, CaCl 2,5 mM

2, pH: 7,4) contendo 1% (v /v) de Anexina V (FITC) para 15 minutos no escuro. As células foram analisadas por FACS (FACSCanto, Becton Dickinson).

Extracção de proteínas e imunotransferência

As células foram tratadas como indicado, e colhidas por centrifugação a 300 g durante 30 segundos. Após ressuspensão em 1 ml de PBS gelado e transferência para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, as células foram centrifugadas a 13200 rpm durante 30 segundos. O sedimento foi lisadas por incubação durante 30 minutos em 200 ul de tampão de lise celular fria contendo Tris-HCl 50 (pH: 8,0), 150 mM de NaCl, 1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo, protease e inibidores de fosfatase cocktails, e Nonidet P-40 1 % (v /v). Após centrifugação a 13200 rpm durante 10 minutos, o sobrenadante contendo o extracto de proteína total foi removido e armazenado a -80 ° C. As concentrações de proteína foram determinadas pelo ensaio de proteína DC (Bio-Rad, Munique, Alemanha). As proteínas (30 ^ g) foram misturadas com tampão de carga (4% de SDS, 20% glicerol, 10% de 2-mercaptoetanol, 0,004% de azul de bromofenol, Tris-HCl a 0,125 pH: 6,8) e separados em 10-15% de SDS- PAGE e transferidas para membranas PVDF. As membranas foram bloqueadas com 5% de reagente de bloqueio (ECL Advance, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha) em PBS-Tween 20 e incubadas com anticorpos primários e secundários conjugados com HRP apropriados (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha) em reagente de bloqueio a 5% . Após lavagens com PBS-requeridas de Tween20, as proteínas foram finalmente analisada utilizando um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL Advance, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha) e expostas a Hyperfilm-ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha).

transfecções

células HCT116 wt foram transfectadas com Bcl-2 e plasmídeos de expressão Bim (Addgene Inc., Cambridge, MA, EUA) utilizando FuGene 6 reagente de transfecção (Roche, F. Hoffman-La Roche Ltd., Basileia, Suíça) de acordo com o protocolo do fabricante. extracção de proteína total foi realizado depois de 24 horas após a conclusão de procedimento de transfecção para a confirmação da expressão ectópica. As células transfectadas com plasmídeo foram tratados com PMC-A como indicado e analisadas por citometria de fluxo após 24 horas.

Análise Estatística

Todos os resultados ilustrados representam um de pelo menos três experiências independentes, com resultados semelhantes . Todos os valores numéricos são apresentados como a média ± DP. significância estatística das diferenças sensíveis entre as populações de células diferencialmente tratada ou diferencialmente transfectadas foram avaliadas com o teste t de Student não pareado ou emparelhado, respectivamente. Os valores de P 0,05 e P 0,01 são marcados como * ou **, respectivamente

Resultados

PMC-A prova mais citotóxica Comparado com o seu precursor PMC e vários análogos contra células HCT116

PMC foi mostrado anteriormente para danificar selectivamente a células endoteliais vasculares em

in vitro

estudos funcionais na aorta de rato e artérias de cães [1], [21], [22]. PMC e análogos também foram demonstradas para causar a morte celular em células endoteliais vasculares bovinas em cultura e células de leucemia Jurkat T [1], [2]. Em nosso estudo, inicialmente investigou os produtos naturais previamente relatados PMC e PMC-A [20] e, em seguida sintetizados vários análogos para explorar relações estrutura-função (Fig. 1). Assim, PMC-C foi preparado a partir comercial

N

-vinylpyrrolidinone (1) por formação do enolato, em seguida, acilação com miristato de etilo para se obter 2. O grupo protector de vinilo foi então removido com ácido aquoso, dando PMC- C (3) como uma mistura racémica no estereocentro prontamente epimerizado (Fig. 2).

Para análogos PMC-D e F, comerciais (

R

) -5- hidroximetilpirrolidina-2-ona foi convertido para o derivado de 4 protegido, utilizando um procedimento descrito na literatura [23], então desprotonado e acilado com miristato de etilo, dando 5. a desprotecção proporcionou então PMC-D (6). Alternativamente, hidroxilação de 5 com oxigénio e cloreto de cério, como catalisador de acordo com o método de Christoffers [24] que originou 7, a qual foi em seguida desprotegido para originar PMC-M (8). Utilização da

p -fluorofenil

grupo convenientemente resultou na hidroxilação essencialmente completamente estereoselectiva, protegendo ao passo que os outros substituintes no anel de benzeno deram misturas. A estereoquímica de 8 foi estabelecida por cristalografia de raios X, que revelou que o grupo hidroxi foi

trans relativamente ao substituinte hidroximetilo, em oposição à

relação cis

em pramanicin. Era, portanto, de interesse para determinar se este grupo hidroxilo e a sua estereoquímica é importante para a actividade, e assim este composto incluído no painel de teste.

, em seguida, realizado um ensaio de citotoxicidade de 24 horas para procurar o mais potente analógicos contra as células HCT-116. MTT teste de redução que determina indirectamente a viabilidade das células /proliferação por monitorização da actividade metabólica, revelou que 100 uM PMC causou cerca de 8% de diminuição na viabilidade celular (Fig. 3). No entanto, PMC-A que possua uma ligação dupla C = C em vez de um grupo epoxi na sua cadeia lateral, diminuiu a viabilidade celular em quase 70% em comparação com o controlo não tratado. Notavelmente, os análogos de PMC-C, -E e -F todos manteve uma actividade significativa, o que indica que uma pirrolidinona acilado (tal como no PMC-C), no máximo, é o farmacóforo chave e que muitos dos substituintes (epóxido, dieno, C- 5 grupo hidroximetilo, e o grupo álcool em C-3 e C-4) não são essenciais, mas aumentar a actividade.

as viabilidades de células HCT116 foram analisados ​​por ensaio MTT após 24 h de tratamento com 100 uM de cada análogo PMC . células HCT116 do tipo selvagem foram ensaiadas por colorimetria após 24 h de tratamento com os análogos PMC. Os valores médios de absorção relativo ao controlo não tratado são exibidos após multiplicação por 100. Os resultados de pelo menos 3 experiências independentes são apresentados como médias ± DP. Diferença dos valores médios entre as amostras tratadas e não tratadas foram testadas usando o teste t de Student não pareado; ** P 0,01. As células de controlo foram tratadas apenas com solvente. Todos os análogos testados, exceto o precursor PMC levou a uma perda significativa de viabilidade /proliferação enquanto PMC-A e F se revelou mais citotóxico para as células.

PMC-A induz a morte celular através da indução de apoptose intrínseca Caminho

In vitro

doses eficazes do potente análogo de PMC PMC-a (25-100 uM) causou a morte celular de uma forma dependente da dose entre todas as linhas celulares do cancro do cólon HCT116 três (em peso, p53 – /-, e Bax – /-), tal como indicado pelo aumento afinidades Anexina-V, em populações de células (Fig 4A).. A fim de analisar a morte celular e determinar a dose óptima para usar numa escala de tempo de 24 horas, aplicou-se citometria de fluxo, após coloração Anexina-V de células expostas a quatro concentrações fisiologicamente relevantes PMC-A. indução da morte celular foi evidente em todas as doses em todas as linhas de células e aumento dependente da dose. Dado que, mais do que 50% das células wt estavam mortos após a exposição de 24 horas para 100 uM PMC-A, foi realizado o resto das experiências de imunotransferência utilizando dose de 50 ^ M em que aproximadamente 70% de células permaneceram vivas às 24 horas pós-