Abstract

Purpose

Mudanças radicais em ambos padrão de mucinas transmembranares expressão e de glicosilação têm foi observada em várias doenças malignas. Nós e outros mostraram que MUC1 e MUC4, dois mucinas transmembranares, desempenhar um papel de sentinela em eventos de sinalização celular que impulsionam várias doenças malignas epiteliais. No presente estudo, investigamos o perfil de MUC1 e MUC4 expressão no urotélio da bexiga não-neoplásica, em várias neoplasias malignas da bexiga e em linhas celulares de carcinoma da bexiga.

Material e Métodos

a imuno-histoquímica foi realizada em secções de tecido a partir das biópsias da bexiga urinária, amostras de ressecção do tecido e microarrays (TMAs) com anticorpos monoclonais específicos para MUC1 e MUC4. Investigou-se também a sua expressão em linhas celulares de carcinoma da bexiga por meio de RT-PCR e immunoblotting.

Resultados

MUC1 é expressa na superfície apical ou em células guarda-chuva do urotélio bexiga não neoplásico normal. forte expressão de MUC-1 também foi observada no carcinoma urotelial (UC). MUC1 coloração aumentou de urotélio normal (n = 27, 0,35 ± 0,12) para o carcinoma urotelial (UC, n = 323; H-score, 2,4 ± 0,22, p≤0.0001). Em contraste com a proteína MUC1, MUC4 foi expresso em todas as camadas do urotélio bexiga não neoplásicas (n = 14, 2,5 ± 0,28), tanto na membrana celular e no citoplasma. Em comparação com o urotélio, não neoplásico, observou-se a perda de expressão MUC4 durante carcinoma urotelial (n = 211, 0,56 ± 0,06). No entanto, foi observada re-expressão de MUC4 em um subconjunto de casos metastáticos de carcinoma urotelial (média H-Score 0,734 ± 0,9).

Conclusão

A expressão de MUC1 é aumentada enquanto que a de MUC4 diminuiu em UC em comparação com o urotélio, não neoplásico normal. A expressão de ambos MUC-1 e MUC4, no entanto, são significativamente mais elevadas em casos urothelial carcinoma metastático em comparação com UC localizada. Estes resultados sugerem expressão diferencial de MUC1 e MUC4 durante o desenvolvimento e progressão do carcinoma da bexiga

Citation:. Kaur S, Momi N, Chakraborty S, Wagner DG, Corno AJ, Lele SM, et al. (2014) expressão alterada de transmembrana mucinas, MUC1 e MUC4, no cancro da bexiga: Implicações patológicos no diagnóstico. PLoS ONE 9 (3): e92742. doi: 10.1371 /journal.pone.0092742

editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Janeiro, 2014; Aceito: 25 de fevereiro de 2014; Publicação: 26 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kaur et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos subsídios da National Institutes of Health (SR1 CA 138791, U54 CA163120, UO1 CA111294 e CA127297 P50). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga (BCA) é a quinta neoplasia comum nos Estados Unidos responsável por cerca de 72.570 novos casos e 15.210 mortes relacionadas ao câncer em 2013 [1]. O carcinoma urotelial (UC) é o tipo mais comum de histológico BCa que corresponde a 90% dos novos casos diagnosticados. UCs no momento da gama diagnóstico de lesões papilares de baixo grau superficiais (associada a um melhor prognóstico) para carcinomas malignos altamente invasivos (altamente agressivo com uma baixa sobrevivência). Aproximadamente 70-80% da UCS recentemente diagnosticados são “não-invasiva do músculo” em que a doença está confinada à mucosa da bexiga ou lâmina própria (etapa Ta /T1 de acordo com a classificação TNM) [2]. Cerca de 10% -30% destes tumores avançar para “doença do músculo-invasivo” ( “high grade” UC) (estágio T2 /T3) [2]. cancros papilares de baixo grau são geralmente não-invasivo (apenas 15% invadir a parede da bexiga) e, portanto, passíveis de ressecção cirúrgica. No entanto, os casos de carcinoma invasivo de alto grau estão associadas com elevada probabilidade de metástases e mortalidade [3], [4]. Citologia e cistoscopia com biópsia de tecido continuam a ser os métodos mais precisos disponíveis para detectar BCa até a data. Citologia é altamente específico para o carcinoma urotelial de alto grau, mas não para o carcinoma de baixo grau urotelial.

Nos últimos anos, as alterações aberrantes na expressão e a glicosilação das mucinas têm sido relatados em inflamatória, pré-malignas e condições malignas [5 ] – [10]. As mucinas são glicoproteínas que são caracterizadas pela presença de elevado grau de O- e N-glicosilação em conjunto com trechos curtos altamente repetitivas de resíduos de aminoácidos (denominados como “repetições em tandem”) [9]. Estes são amplamente divididas em duas categorias mucinas nomeadamente ligadas à membrana e secretadas /formação de gel mucinas. Importante, MUC1 e MUC4 representam as mucinas trans-membrana bem caracterizados que jogam um papel importante na fisiologia celular. Em virtude da sua estrutura e composição bioquímica Estas mucinas participa na lubrificação e hidratação da superfície das células, a protecção a partir de microrganismos (bactérias e vírus) e enzimas degradativas [11]. A variação no padrão da proteína MUC1 e MUC4 expressão e a glicosilação tem sido observada em várias malignidades epiteliais, incluindo pâncreas, mama, cólon, próstata e cancro do pulmão [7], [9], [12], [13]. Eles foram mostrados para desempenhar um papel crucial no crescimento do tumor, a sinalização intracelular e extracelular, interacções tumor-estromal, metástase, e a resistência aos agentes quimioterapêuticos e na vigilância imunitária [7], [11], [12], [14]. A disponibilidade de reagentes altamente específicos (

por exemplo. Os anticorpos monoclonais

), capaz de reconhecer alguns glicoformas alteradas fez mucinas alvos atraentes para o diagnóstico precoce de malignidades epiteliais. Altered padrão de MUC1 expressão e localização têm sido observados durante a progressão de neoplasias malignas da bexiga [15] – [18], no entanto, a data não há uma escassez de informações sobre o estado de MUC4. Considerando as suas funções de protecção e lubrificantes, é importante para avaliar as suas funções na bexiga saudável e da alteração na sua expressão durante o desenvolvimento e progressão do carcinoma urotelial.

No presente estudo, examinamos os padrões de expressão MUC1 e MUC4 no urotélio da bexiga não-neoplásica e neoplasias malignas dos tecidos da bexiga em microarrays de tecido (TMA) e secções de tecido de biópsias da bexiga urinária e amostras ressecadas. Além disso, a correlação entre a expressão dessas mucinas e grau do tumor (graus 1-4) foi examinado para definir o significado de diagnóstico e fisiológica de TM mucinas durante a patogênese da UC.

Materiais e Métodos

linhagens de células tumorais e amostras de tecido

formol fixa amostras de tecido BCa arquivados foram obtidos Universidade de banco de tecidos Nebraska Medical Center. O conselho de revisão encontrados neste estudo, com a sua base de dados identificou-de, para ser isentos de avaliação de revisão institucional. Bexiga TMA foram adquiridos de US Biomax para a coloração MUC1 (cat # BL802), Accumax para MUC4 (cat # A215II) e bexiga TMA (2004) (a simpática oferta do Dr. Henry Frierson da University of Virginia, Charlottesville, VA). IHC coloração foi realizada utilizando mAb HMFG2 (anticorpo anti-MUC1, uma simpática oferta do Dr. Gendler, Mayo Clinic) e mAb8G7 (anticorpo anti-MUC4, gerado contra o péptido em tandem repeat, STGDTTPLPVTDTSSV em nosso laboratório e reactivos com a proteína nativa e péptido) [19]. linhas celulares de carcinoma da bexiga [T24 e HT1376, (derivada de bexiga carcinoma de células de transição), cultura TCCSUP (derivada de um carcinoma de células de transição anaplatic) SCaBER (derivadas do carcinoma de células escamosas da bexiga) foram mantidas na American Type Culture Colecção (ATCC) especificado um meio suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco BRL, Grand Island, NY). O meio de crescimento foi mudado em dias alternados, e as células foram tratadas com tripsina a 70% de confluência.

A imuno-histoquímica (IHC)

Para analisar a expressão MUC-1 e MUC4 em neoplasias malignas de bexiga, IHC foi realizada como descrito anteriormente em secções de tecido de TMA e amostras de bexiga urinária [7]. amostras de biópsia e ressecção do carcinoma urotelial foram revisadas pelos patologistas (Drs. S Lele, AH Horn, e DG Wagner na UNMC) para confirmar os diagnósticos e também selecionar blocos representativos para análises de imuno-histoquímica. Para o tecido IHC, 4 mm de espessura foram cortadas de blocos de tecidos embebidos em parafina usando micrótomo de tecidos e foram respeitadas para as lâminas de vidro carregadas. Bexiga TMA e secções de tecido foram incubadas durante a noite a 56 ° C, seguido por lavagens repetidas usando desparafinização de xileno (5 min cada), seguido por re-hidratação de tecidos com álcool graduado. Depois de re-hidratação, os tecidos foram incubados com uma solução metanólica de 3% H

2O

2 para a têmpera de actividade da peroxidase endógena. recuperação de antigénio induzido pelo calor foi realizada aquecendo a amostra de citrato 0,01 M (pH 6,0, 95 ° C) de tampão durante 15 minutos em forno de microondas. Após recuperação de antigénios, as secções foram bloqueadas com soro de cavalo (kit de anticorpo ImmPRESS Universal; Vector Laboratories) durante 3 horas à temperatura ambiente. As lâminas foram depois incubadas com anti-MUC1 (HMFG2 na diluição 1:05 de sobrenadante enriquecido em PBS), MUC4 anticorpo 8G7 (1:2000 diluição de um estoque a 1,8 mg /ml em PBS) [20] durante a noite a 4 ° C. Depois de quatro lavagens com PBS-T (PBS contendo 0,05% de Tween 20), as secções foram incubadas com anti-ratinho de anticorpo secundário (anticorpo kit ImmPRESS Universal; Vector Laboratories) durante 30 min. e subsequentemente, a cor foi desenvolvida por adição de solução de 3,3′-diaminobenzidina (DAB kit de substrato; Vector Laboratories). precipitado castanho avermelhado indicado imuno-reactividade positiva. As lâminas foram contra-coradas com hematoxilina de Gill (Vector Laboratories), desidratadas em etanol graduado seguido de xileno e montadas com meio Vecta de montagem de montagem (Vector Laboratories). Todas as lâminas foram analisadas utilizando um microscópio Nikon Eclipse E400 (Nikon, Tokyo, Japão).

Cada núcleo de tecido foi avaliada pelos uropathologists em UNMC para avaliar a presença de tumor ea pontuação da coloração. Resumidamente, cada ponto na matriz tecidual foi classificada com base na intensidade de coloração em uma escala de 0 a 3 (0-sem coloração, coloração 1-fraco, 2-coloração intermediário e coloração 3-forte). A percentagem de células positivas com uma dada intensidade para cada amostra foi determinada pelos patologistas. O H-score [gama: 0 (nenhuma coloração em qualquer célula) a 3 (todas as células marcadas com o mais alto (3) intensidade] foi calculada como a soma do produto de intensidade da coloração (gama: 0-3) e proporção de células coloração (intervalo: 0-1; 0-nenhuma célula de células coradas e 1-100% corado). Como por H-score reactividade focal corresponde à pontuação H de ≤0.1, reactividade leve (pontuação H 0,1 e inferior ou igual a 1,0), a reactividade moderada (pontuação H 1,0, mas ≤2.0) e reactividade intensa (pontuação H . 2.0) em caso de biópsias de tecidos, devido a um número limitado de cada tipo de tecido (benigna, carcinoma in situ e carcinoma) presente no slide foi marcado na intensidade de resultados só. em casos metastáticos, os cortes foram marcou para a H-marcando semelhante a manchas de tecidos.

Análises estatísticas

os dados foram analisados ​​usando Medcalc para a versão do Windows 9.6.4.0 software. Para efeitos de análise, cada local foi considerada como uma amostra individual. a intensidade da expressão de mucina foram considerados como variáveis ​​contínuas, no entanto, o tipo de patologia [UC, carcinoma de células escamosas (SCC), carcinoma papilar ou adenocarcinoma] , grau de câncer foram consideradas variáveis ​​categóricas. Um valor de p 0,05 foi considerado significativo

Isolamento de ARN total e de Transcriptase Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase

Cellular RNA a partir de células de cultura foi extraído por kit RNeasy de acordo com as instruções do fabricante (. Qiagen, Hilden, Alemanha). O ARN total foi quantificado utilizando um espectrofotómetro de ultravioletas (Peqlab ND-1000; Peqlab, Erlangen, Alemanha) e a qualidade e a integridade das amostras foram avaliadas num gel de agarose a 1,5%. 2 ug de ARN total de cada linha celular BCa foi transcrito de forma inversa utilizando o kit de síntese de ADNc de primeira cadeia (Perkin Elmer, Branchburg, NJ) de acordo com as instruções do fabricante. O PCR quantitativo em tempo real foi efectuada para MUC1, MUC4, e β-actina utilizando os seguintes pares de iniciadores: MUC1 (iniciador directo 5′-GAACTACGGGCAGCTGGACATC’-3 ‘e o iniciador inverso 5′-GCTCTCTGGGCCAGTCCTCCTG-3’), MUC4 (iniciador directo 5 ‘-CGCGGTGG TGGAGGCGTTCTT-3′ e o iniciador inverso 5’-GAAGAATCCTGACAGCCTTCA-3 ‘), e β-actina iniciador directo (5′-TGGACATCCGCAAAGACCTG-3′) e iniciador reverso (5’-CCGATCCACA CGGAGTACTT-3 ‘) (IDT Co -. alville, IA, EUA)

análise de Western-Blot

a proteína total foi extraído a partir de linhas celulares de bca, resolvida e analisados ​​por imunotransf erência de acordo com o protocolo padrão. Em resumo, as células foram lavadas duas vezes com a frio PBS, raspadas em tampão RIPA (Tris 100 mM, EDTA 5 mM, 5% de NP40, pH-8,0) contendo inibidores de protease (diagnóstico Roche, Mannheim, Alemanha) e deixados a lisar para pelo menos 30 min em gelo com agitação em vórtex intermitente. As células foram submetidas a lise por um ciclo de congelação-descongelação e centrifugadas a 14.000 durante 30 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram cuidadosamente retirados e as concentrações de proteína foram determinadas por Bio-Rad DC-kit de estimativa de proteína. Para imunotransferência de mucina, a electroforese foi realizada em 2% de gel de SDS-agarose, utilizando quantidades iguais de amostras de proteína, sob condições redutoras. Para β-actina, SDS-PAGE (10%) foi realizada sob condições semelhantes. As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF e sondado com anticorpos anti-MUC-1 (01:05 diluída sobrenadante mAbHMFG2 em PBS) e MUC4 (1:1,000 diluição de mAb8G7) anticorpos. Após incubação com anticorpos secundários conjugados com peroxidase rato rábano (Amersham Biosciences Buckinghamshire, Reino Unido), o sinal foi detectado com um kit de reagentes electroquimioluminescência (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).

Resultados

Neste estudo, nós exploramos o perfil de mucinas transmembranares (MUC1 e MUC4) em cortes de tecidos de carcinoma urotelial e três tecido TMAs expressão. Além disso, os níveis dessas mucinas de expressão foram avaliados em linhas de células de carcinoma da bexiga.

MUC1 análises de expressão durante neoplasias malignas da bexiga

expressão MUC1 no urotélio da bexiga não-neoplásica.

a maioria das manchas de tecidos da bexiga não neoplásicas de TMA (16/27 ou 59%) foram negativos para a expressão MUC1 (H pontuação = 0). coloração focal menor foi observado em alguns casos, 4/27 (15%). Nos pontos restantes, foi observada positividade leve (27/07, significam H-score 0,58 ± 0,29 numa escala de 0-3) (Fig. 1A). No geral, média H-score de todos os casos juntos foi encontrado para ser de 0,15 ± 0,1 (Tabela 1). Na maioria dos casos, a coloração intensa MUC1 foi restrita a células guarda-chuva com coloração fraca em células restante do urotélio (Fig. 1A, seta). No entanto, em alguns casos, uma coloração intensa MUC1 (27/04 ou 15%) foi observada camada superficial do urotélio (Fig. 1B, representado pela seta). Em geral, a coloração era bastante intensa nas células guarda-chuva superficial do que nas outras camadas /células do urotélio. Uma conclusão similar foi observado para secções de tecido coletadas em UNMC que revelaram moderada a coloração intensa para MUC1 (N = 3, a intensidade de 1,7 ± 0,58 significam, meio H-Score 1,7 ± 0,58), que foi restrita a células da camada ou guarda-chuva superficial.

secções de tecidos tumorais de bexiga ou manchas foram sondadas com mAb anti-MUC1 (HMFG2) após bloqueio não-específicas com soro de cavalo. Todas as secções foram examinadas ao microscópio e a imunorreactividade foi avaliada por coloração castanha avermelhada. fotomicrografias representativas são mostrados para MUC1 manchado não neoplásico da bexiga urotélio (A B), carcinoma papilar de baixo grau (C), carcinoma da bexiga in situ (D), e cancro invasivo de alto grau (E F). Em urotélio da bexiga normal, expressão MUC1 foi restrita a células de guarda-chuva (mostrado pela seta no painel A ea margem interna ampliada) na maioria das amostras. Nalgumas amostras, foi observada uma bainha de mucina MUC1 sobre urotélio (seta na 1B). No carcinoma papilar de baixo grau, foi observada coloração intensa da proteína MUC1 na superfície luminal do urotélio e foi observada uma menor intensidade de coloração nas outras camadas do urotélio (C). No carcinoma urotelial in situ, a expressão MUC-1 foi observada em todas as camadas do urotélio, no entanto, a coloração era comparativamente mais forte em células mais perto da borda luminal (D). No carcinoma urotelial de alto grau invasivo, MUC1 coloração foi observado em células invasoras individualmente (E) ou como pequenos grupos dentro da lâmina (F).

expressão MUC1 na urotelial papilar não invasivo . carcinoma urotelial e carcinoma in situ (CIS)

cancros papilares são geralmente não-invasivo (apenas 15% invadir a parede da bexiga) e, portanto, passíveis de ressecção cirúrgica. Para MUC1, casos de carcinoma papilar foram restritas a secções de tecido sozinho, como em qualquer ponto do tecido TMA correspondeu ao carcinoma papilar invasiva ou não-invasiva. Moderada a coloração MUC1 intensa foi observada em ambos carcinoma urotelial papilar de baixo e alto grau de secções de tecido (intensidade média de 2,9 ± 0,1 e significa H-Score 2,1 ± 0,83 em uma escala de 0-3, Fig. 1C). coloração intensa da proteína MUC1 foi observada na superfície luminal do uroepithelium no carcinoma urotelial papilar de baixo grau. Intensidade de coloração e a percentagem de positividade aumentada a partir de células nas camadas basais de camadas apicais do uroepithelium (Fig. 1C, representada pela seta). Além disso, as células da camada de superfície apresentou coloração mais intensa, em comparação com as células uroepiteliais camada por baixo, demonstrando uma célula não-uniforme ao padrão de coloração de células (Fig. 1C). Em caso de carcinoma in situ, coloração intensa MUC1 (intensidade média de 2,9 ± 0,1 e significa H-Score 2,48 ± 0,74) foi observada (N = 10) nas secções de tecido (Fig. 1D).

expressão MUC1 no carcinoma urotelial primário e metastático.

em casos de carcinoma urothelial, MUC1 coloração variou de nenhuma reactividade (N = 38 ou 12%), a reactividade focal (N = 12 ou 4%, significa H-score 0,057 ± 0,01 ) a moderada (N = 147 ou 46%, significa H-score 1,02 ± 0,05) e intensa imunorreactividade (N = 117 ou 37%, significa H-score de 2,86 ± 0,02) (Fig. 1E e 1F). Em casos invasivos, foi observada coloração com proteína MUC1 em focos (único ou ninho de células) presente no interior do núcleo papilar ou na lâmina própria (fig. 1E e 1F), a distribuição da proteína MUC1 sendo ambos membranas e do citoplasma.

foi observada expressão MUC1 em 66% (8/12) de metástases de uma UC primário para vários locais

ou seja

. parede abdominal, costas, ossos, cérebro e gânglios linfáticos (Fig. 2E e F). Em caso de cortes de tecidos metastáticos (n = 28), foi observada expressão absoluta de MUC1 em todos os casos metastáticos, com média de H-score de 1,91 ± 0,15 e intensidade de 2,72 ± 0,45 dizer. De acordo com estes resultados, não expressão de MUC-1 foi observada em área normal nódulo linfático enquanto que as células metastáticas no nodo linfático tem reactividade positiva (Fig. 2E). A expressão observada MUC1 podem ser categorizados em três padrões diferentes de coloração de membrana luminal (na camada de células guarda-chuva) só, luminal mais coloração citoplasmática (em camadas intermediárias e basais), ou coloração de apenas células isoladas ou grupos de células.

microfotografias representativos mostrados para a coloração MUC1 em carcinoma de células escamosas (a), pérolas de queratina (B), adenocarcinoma (C) adenocarcinoma mucinoso (D), metástase óssea (E), carcinoma urothelial metastático em linfonodo (F). membranoso expressão forte da proteína MUC1 foi observado carcinoma de células escamosas (A) e também nas pérolas de queratina dentro do carcinoma de células escamosas (B). Ambos adenocarcinoma mucinoso (C) e adenocarcinoma mostraram coloração fraca (D) para MUC1. Observou-se forte expressão de MUC-1 no carcinoma urotelial metastático nos ossos (E) e nó de linfa (F). Alto poder mostrou que MUC1 é localizada a ambos citoplasma e membrana nas metástases (inserção de E F).

Como pode ser visto na Tabela 2, foi observada diferença significativa na H-score de coloração MUC1 de grau 1 (0,51 ± 0,1) para tumores de grau 2 (1,62 ± 0,155). Além disso H-score para a coloração MUC1 aumentou de grau 3 para o grau 4 tumores.

expressão MUC1 em Carcinoma de células escamosas (SCC), adenocarcinoma e adenocarcinoma mucinoso da bexiga.

Moderado a foi observada coloração intensa na SCC (N = 33, 65% dos casos), com a média H-score 2,33 ± 0,16 (Fig. 2A), enquanto outros mostraram positividade apenas leve para MUC1 (N = 18 ou 35%, significa H -Score 0,66 ± 0,11, a intensidade de 1,3 ± 0,11 média). coloração moderada para o MUC-1 foi observada em pérolas de queratina que são característica distintiva de grau 1 carcinoma de células escamosas (Fig. 2B, representada pela seta). Não houve diferença significativa na intensidade de coloração entre o grau 2 (N = 6, significa H-score 2 ± 0,3) e grau 3 SCC (N = 12, significa H-Score 3,0 ± 0,7). Dos 12 adenocarcinomas manchas que foram examinadas, 7 mostrou fraca coloração da proteína MUC1 (Fig. 2C), enquanto que em outros expressão estava completamente ausente. Maioria dos pontos de tecido de adenocarcinoma mucinoso eram levemente positiva para MUC1 (média H-score, 0,62 ± 0,14) (Fig. 2D).

Análises MUC4 expressão durante a neoplasia maligna de bexiga

expressão MUC4 no urotélio bexiga não neoplásico.

Quando analisados ​​em tecidos normais (N = 14), foi observada elevada expressão de MUC4 em urotélio da bexiga não neoplásicas (Fig. 3A, intensidade média de 2,54 ± 0,21 e significa H-score 2,54 ± 0,21) (Tabela 3). A expressão de MUC4 (no urotélio normal da bexiga) foi observado tanto na membrana e no citoplasma das células do epitélio com a expressão mais forte nas membranas celulares do que citoplasma. No entanto, em contraste com a MUC1, a coloração para MUC4 era uniforme por todas as camadas do urotélio (Fig. 3a). Curiosamente, foi observada uma forte expressão de MUC4 mesmo em agregados de células uroteliais invaginado conhecidos como “ninhos de von Brunn” (Fig. 3B, representada pela seta).

secções de tecido de tumor da bexiga e tissue microarray foram sondadas com anti -MUC4 mAb (8G7), após o bloqueio não-específicas com soro de cavalo. Todas as secções foram examinadas ao microscópio e a imunorreactividade foi avaliada por coloração castanha avermelhada. fotomicrografias representativas são mostradas para MUC4 coradas normais urotélio não neoplásicas (A), ninhos de von Brunn (B), não invasivo carcinoma urotelial papilar (C), carcinoma urotelial in situ (D), de baixo (E) e carcinoma urotelial alta qualidade (F). foi observada positividade forte de MUC4 em vários urotélio camada de bexiga (A). imagem ampliada mostra que a distribuição de MUC4 é tanto membranoso e citoplasmática. As células em células ninho de von Brunn mostraram forte coloração membranosa da MUC4 (B). Observou-se perda de expressão MUC4 durante carcinoma papilar não-invasivo (C), e carcinoma in situ (D). Ambos carcinoma urotelial de baixo e alto grau mostrou perda de expressão MUC4 (E F)

expressão MUC4 no carcinoma urotelial papilar não-invasiva e invasiva e urothelial carcinoma in situ (CIS)..

Apesar de casos limitados (N = 6) de carcinoma papilífero não invasivo estavam presentes em manchas de tecidos, a maioria deles era completamente negativo (N = 4, a intensidade-score 0), enquanto outros têm positividade parcial (N = 2, intensidade média-score 2.5). carcinoma papilar invasiva (N = 2) mostraram perda total de expressão MUC4 (Intensity-score = 0). Além disso, foi observada perda total de expressão MUC4 em ambos os não-invasiva (Fig. 3C) e invasivos casos de carcinoma papilífero (N = 10, a intensidade de 0,8 ± 0,41 significa, média H-Score 0,31 ± 0,39). expressão MUC4 foi significativamente reprimidos no CIS da TMA (N = 4, significa H-score 0, quadro 3), bem como em caso de cortes de tecido (N = 10; intensidade média de 0,3 ± 0,1; p = 0,02 e significa H-score 0,12 ± 0,06) em comparação com o urotélio, não neoplásico (Fig. 3D). No geral, foi observada perda de expressão MUC4 durante carcinoma papilar invasiva e não-invasiva.

expressão MUC4 no carcinoma urotelial invasivo e metástases.

Na maioria dos casos, foi observada expressão focal de MUC4 no carcinoma urotelial (N = 122 ou 58%, significa H-score, a intensidade 0 significa), enquanto que outros casos mostrou leve positividade (N = 89 ou 42% dos casos, significa H-score 0,68 ± 0,14, a intensidade de 0,91 ± 0,19 média). Em geral, observou-se a perda de expressão em ambos MUC4 carcinoma urotelial invasivo de baixo e alto grau (Fig. 3E e 3F). expressão MUC4 foi significativamente regulada negativamente em células de carcinoma comparação com o urotélio, não neoplásico (significa H-score no urotélio bexiga não neoplásico e UC sendo 2,54 ± 0,21 [P 0,0001], e 0,47 ± 0,05, respectivamente) (dados TMA). Curiosamente, em comparação com o carcinoma urotelial que falta a expressão de MUC4, percentagem mais elevada de casos metastáticos foram consideradas positivas para MUC4. Entre todos (n = 28) casos metastáticos, 57% dos casos (N = 16) demonstrou fraca para coloração MUC4 leve (média H-Score 1,27 ± 0,27) (Fig. 4D-F), enquanto nenhuma a expressão focal foi observada em 43% dos casos (N = 12; intensidade = 0 quer dizer e dizer H-score 0,025 ± 0,02). foi observado tanto coloração citoplasmática e da membrana de MUC4 em vários casos metastáticos (4D-F).

microfotografias representativos mostrados para a coloração MUC4 no carcinoma espinocelular (A), adenocarcinoma (B), adenocarcinoma mucinoso (C) e nó metastático urotelial carcinoma de linfa (D e), e carcinoma do pulmão metastático urotelial (F). casos de carcinoma de células escamosas apresentaram expressão moderada de MUC4 enquanto MUC4 foi encontrado para ser ausente em adenocarcinoma. Focal para moderar expressão de MUC4 foi observada no carcinoma urotelial metastático para os vários órgãos. Alto poder mostraram que a coloração padrão é tanto membranoso e citoplasmática durante a metástase.

Como pode ser visto na Tabela 4, não foi observada diferença significativa na H-score de coloração MUC4 de grau 2 (0,66 ± 0,17) ao grau 4 tumores (0,58 ± 0,19).

expressão MUC4 em carcinoma de células escamosas (SCC) e adenocarcinoma da bexiga.

dos 51 pontos SCC que foram examinadas (em o TMA), positividade focal foi observada em 38% dos casos (n = 19, significa H-score 0,061 ± 0,009), positividade leve em 42% dos casos (n = 21, significa H-score 0,59 ± 0,09) e intensa reatividade em 20 % dos casos (N = 10, significa H-score 2,24 ± 0,13) (Fig. 4A). membranoso coloração forte foi observada na maioria das células com algumas células apresentam coloração citoplasmática. Em casos MUC4 positivos, todos os focos de SCC invasivo na lâmina própria apresentou coloração uniforme (fig. 4A). No co-relação significativa pôde ser avaliada entre a expressão MUC4 e grau de carcinoma de células escamosas, devido à informação limitada sobre o grau do tumor dos casos. Embora o número de secções de tecido foram limitados para o adenocarcinoma (N = 8), não foi observada reactividade ou MUC4 focal (significa H-score 0,4 ± 0,22) (Fig. 4B). Da mesma forma, adenocarcinomas mucinosos também foram encontrados para negativo para a expressão MUC4 (Fig. 4C).

A expressão de MUC1 e MUC4 em linhas de células de bexiga Carcinoma

Depois de analisar a expressão de mucinas em várias patologias da bexiga por imuno-histoquímica, a expressão de MUC-1 e MUC4 foi analisada em ARNm e os níveis de proteína em diferentes linhas de células de carcinoma da bexiga (Fig. 5, painel a-C). O painel incluiu quatro linhas da bexiga-T24 celulares de carcinoma, TCCSUP, HT1376 e scaber. RT-PCR quantitativa para MUC1 e MUC4 revelou que todas as linhas celulares excepto T24 expressa MUC1 e MUC4 (Fig 5A . B). estudos imunológica utilizando anticorpo anti-MUC1 (HMFG2) e anticorpo anti-MUC4 (8G7) indicou expressão diferencial da proteína MUC1 e MUC4 em TCCSUP, HT1376 e linhas celulares scaber (Fig. 5C). Nenhuma expressão de MUC-1 e foi observado em MUC4 linha celular de carcinoma da bexiga T24. Além disso, foram observadas diferentes glicoformas de MUC4 na linha de células de carcinoma de células escamosas em comparação com linhas celulares de CTP.

análises RT-PCR quantitativa de MUC1 (A) e MUC4 (B) mostrou que toda a linha de células de carcinoma da bexiga, excepto T24 expressa MUC1 e MUC4. Mais alta expressão de ambos MUC1 e MUC4 foi observada em linha de células de tumor HT1376. Para a expressão análises de mucina MUC1 e MUC4 ao nível de proteína, os lisados ​​de proteína a partir de todas as linhas celulares de carcinoma da bexiga foram resolvidas em 2% de gel de agarose e sondado com anticorpos anti-MUC4 (8G7) anti-MUC1 (HMFG2) e (Painel C) . β-actina resolvido em 10% de SDS-PAGE foi utilizado como um controlo de carga (Painel C). Nenhuma expressão de qualquer mucina MUC1 e MUC4 foi observada em T24, enquanto outras linhas celulares expressavam ambos os mucinas. (D) representações tabulares de expressão MUC1 e MUC4 durante a progressão do carcinoma da bexiga. mudanças significativas na expressão de ambos MUC1 e MUC4 foram observados durante a progressão do carcinoma urotelial. aumento progressivo na expressão MUC1 foi observado por várias fases e graus de cancro da bexiga enquanto que a expressão de MUC4 diminuiu com a progressão da doença. Num subconjunto de casos metastáticas de carcinoma urotelial, foi detectada a expressão de MUC4.

Em geral, mucina MUC1 e MUC4 análises de TMA cancro da bexiga e secções de tecido indicaram que a expressão de MUC-1 é aumentada, enquanto que de MUC4 diminuiu em UC em comparação com o urotélio, não neoplásico normal. A expressão de ambos MUC-1 e MUC4, no entanto, são significativamente mais elevadas em casos metastáticas de carcinoma urotelial comparação com localizada UC (Fig. 5D).

Discussão

expressão aberrante, a localização e a glicosilação das mucinas são característicos eventos de várias malignidades (pâncreas, ovário, próstata e gástrico, do pulmão, e da mama). Entre os vários membros da família, MUC1 e MUC4 estão implicados no crescimento do tumor, a sinalização intracelular e extracelular, interacções tumor-estromal, metástase, e a resistência aos agentes quimioterapêuticos e na imunidade [10], [12]. Informações completas sobre a expressão dessas mucinas está faltando no carcinoma urotelial. O presente estudo examinou a expressão de TM mucinas MUC1 e MUC4 em tissue microarray bexiga, cortes de tecidos e linhas de células de carcinoma da bexiga. Enquanto as alterações aberrantes foram observadas na expressão e localização padrão de MUC1 entre casos benignos e malignos, foi observada a regulação negativa significativa de MUC4 durante carcinoma urotelial em comparação com tecidos normais da bexiga benignos e /ou.

é um MUC-1-ligada à membrana

o

-glicoproteína que é expresso a nível basal na maioria das células epiteliais [21]. expressão desregulada da proteína MUC1 é uma característica proeminente dos vários tipos de cancro e doenças inflamatórias.