Abstract

Aneuploidia com instabilidade cromossômica é uma característica marcante do câncer. Estudamos cromossomo 7 (CHR7) a variação do número de cópias (CNV) em gliomas e em culturas primárias derivadas delas. Encontrámos heterogeneidade do tumor com células de CHR7-CNV geralmente ocorre em gliomas, com uma percentagem mais elevada de células em gliomas de alto grau que transportem mais de 2 cópias de CHR7, em comparação com gliomas de baixo grau. Curiosamente, todos os tipos de células CHR7-aneuploides na cultura parental de linhas celulares de glioma estabelecidos reapareceram em subculturas derivadas de uma única célula. Então, caracteriza-se a biologia das três culturas de glioma singeneicos dominadas por diferentes tipos de células CHR7-aneuploidia. Encontramos divergência fenotípica de células seguintes CHR7 mis-segregação, que beneficiou o crescimento global tumor

in vitro

e

in vivo

. modelagem matemática sugeriu o envolvimento de instabilidade cromossômica e interações entre subpopulações de células em restaurar o equilíbrio ideal de tipos de células tumorais. Ambos os nossos dados experimentais e modelos matemáticos mostraram que a complexidade da heterogeneidade do tumor poderia ser reforçada pela existência de cromossomas com alteração estrutural, em adição às suas mis-segregações. No geral, nossos resultados mostram, pela primeira vez, o envolvimento de instabilidade cromossômica na manutenção da heterogeneidade do tumor, que está na base do crescimento, persistência e tratamento resistência aumentada de cânceres

Citation:. Hu Y, Ru N, Xiao H , Chaturbedi A, Hoa NT, Tian XJ, et al. Chromosome (2013) Tumor-Específica Mis-Segregação Controles Cancer Plasticidade através da manutenção de Tumor Heterogeneidade. PLoS ONE 8 (11): e80898. doi: 10.1371 /journal.pone.0080898

editor: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de maio de 2013; Aceito: 17 de outubro de 2013; Publicação: 25 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte por fundos UC Irvine set-up e um presente Stern família generosa (YHZ e ML), as ajudas fornecidas pelo Cancer Research Committee UC Coordenação, UC Comitê de Irvine da Investigação, Seed Grant Cancer Center (Número Award P30CA062203 do National Cancer Institute), Musella Foundation for Brain Tumor Research Informação e voz contra o cancro cerebral (YHZ), National Science Foundation DMS-0969417 (JX), VA Mérito comentário Grant (MRJ). Zhenyu Jia é parcialmente suportado pelo Guizhou Colégio Normal, Guiyang, Guizhou, China, QKHJ [de 2013] 2238. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Liping Yu é um funcionário da Ziren Research LLC, Irvine, CA, EUA. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS ONE sobre a partilha de dados e materiais.

Introdução

De acordo com a hipótese de evolução clonal inicial de Nowell [1], o desenvolvimento do câncer é um processo evolutivo e processo ecológico, de muitas formas que se assemelham a evolução darwiniana [2]. Esta hipótese é suportada pela previsão da progressão do tumor com a diversidade clonal genética em adenocarcinoma esofágico [3], e agora tem sido largamente aceite como uma explicação para a heterogeneidade do tumor observada na maioria dos cancros no momento do diagnóstico clínico, em ambas as original e metastático locais [4], [5]. O conceito de câncer como um processo evolutivo, com tumores tendo genética e fenotipicamente diversificada subpopulações de células é consistente com o modelo de células-tronco do câncer recente, que enfatiza a importância de câncer de ter um tipo de célula capaz de gerar outros tipos de células, de forma unidirecional [6 ] – [9]. No entanto, a descoberta de inter-conversão fenotípica entre três subpopulações de células dentro de linhas celulares de cancro da mama, o que leva a um equilíbrio da população de células [10] revelou a capacidade do cancro para recuperar diversidade biológica a partir de mais do que apenas a subpopulação de células-tronco semelhante. Tal capacidade de recuperar condições de equilíbrio após uma perturbação é uma característica característica de um ecossistema estabelecido, bem equilibrada. Resta saber se, e como, a transição fenotípica de células de câncer se manifesta como uma característica hereditária.

As evidências acumuladas apoia a noção de que os erros mitóticas causam instabilidade cromossômica, o que impulsiona a evolução do câncer, com a seleção natural actuando ao nível da ecologia câncer para evitar o caos citogenética. Aparentemente, a distribuição não aleatória dos ganhos e perdas cromossômicas visto em tipos específicos de tumores é um efeito combinado de instabilidade cromossômica e seleção de fenótipos específicos de entre mudanças maciças do transcriptoma [11] – [15]. Os gliomas malignos são tumores cerebrais primários tendo astrocíticos e /ou características de oligodendrogliais variando malignidade. O grau mais elevado, infelizmente, o glioma mais comumente visto, é glioblastoma multiforme (GBM, grau IV), morfologicamente, geneticamente, e citogeneticamente heterogêneo, e uniformemente fatal devido à sua rápida proliferação celular e fortemente invasivo comportamento [16] – [19]. Sabe-se que a alteração do cromossoma 7 (CHR7) do número de cópias ocorre em ambos os gliomas de alto e de baixo grau e que estas alterações parecem estar associadas com fenótipos invasivos e proliferativas de células [20] – [24]. Aqui nós relatamos estudos de diversidade de células-aneuploidia relacionadas com CHR7 eo papel da CHR7 mis-segregação (CHR7-MS) na manutenção da diversidade fenotípica das subpopulações de células de glioma, o que gera um efeito sinergético no crescimento total do tumor.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Congelados e espécimes de glioma frescas foram fornecidos pelos Bancos de Tecidos da Universidade da Califórnia, Irvine e da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas, com a aprovação do Conselho de revisão Institucional.

trabalho animal e subcutânea (sc) e intracraniana (sc) xenotransplantes

O trabalho com animais foi aprovado pelo animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade da Califórnia, Irvine. Para os estudos utilizando intracraniana (ic) xenoenxertos, células de glioma (1 × 10

5/3 ul de DMEM /F12) foram injectados no lobo frontal de 4-6 semanas de idade, fêmea, ratinhos nus (mancha NCrNu-H, Taconic , Hudson, NY), seguindo IACUC aprovado procedimentos cirúrgicos. Após i.c. implantação, os ratos foram observados diariamente e, periodicamente, pesou para sinais moribundos (postura corcunda, marcada perda de peso e alteração da marcha). Os ratos foram sacrificados quando desenvolveram sintomas cérebro de danos (ataxia, hemiparesia, etc) e /ou 20% de perda de peso corporal, e no dia seguinte foi recorde como a data de sobrevivência para análise de sobrevivência.

Para estudos utilizando subcutânea (SC) xenoenxertos, as células (1 x 10

6 células /50 ul de DMEM /F12) foram injectados subcutaneamente em ratinhos nus, anterior à sua direita e à esquerda das coxas, dos dois lados. As medições do tumor foram feitas a cada 3-4 dias após o implante, e o volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula V = (L * W

2) /2 (L, comprimento; W, largura). Os ratinhos foram sacrificados a um tempo predeterminado do volume do tumor experimento ou quando excedido 1,5 cm

3.

Glioma culturas primárias e linhas de células

tecidos de glioma humano fresco foram dissociadas enzimaticamente (0,05% tripsina-EDTA durante 30-45 min a 37 ° C), interrompido mecanicamente (que passa através de uma pipeta de vidro em DMEM /F12 contendo 0,10 mg ml de DNase e 10% de soro /), e cultivadas em ambos revestidos com colagénio (3-4 ug /cm

2) placas de cultura em DMEM /F12 suplementado com 5% de soro fetal de bovino, designado como aderentes soro (SA) As condições de cultura, e ágar (1%) – revestidas placas de cultura em DMEM /F12 suplementado com factor de crescimento epidérmico (EGF, 20 ng /ml), factor de crescimento de fibroblastos básico (FGF, 10 ng /ml), e 1-5% B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA), designados como as condições de cultura esfera neural (NS). As esferas de glioma multicelulares formados nas condições de cultura NS foram passados ​​em fibronectina (1? G /cm

2) placas revestidas no mesmo meio de cultura antes da congelação ou submetendo a análise de FISH.

As linhas de células de glioma humano ( A172, LN229, LG11, T98G, U251 e U87) foram obtidos do Departamento de Neuro-Oncologia, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center. Os perfis genéticos (7-marcadores STR fornecidos pela IDEXX Radil, Columbia, MO) utilizado por este estudo eram idênticos ou altamente semelhantes aos perfis genéticos reportados para cada linha celular (Tabela S1). A172 aqui relatados foi originalmente denominada como D54, mas transporta perfis genéticos sugerindo uma variante de A-172 relatado por American Type Culture Collection (ATCC). U251 aqui relatados foi originalmente nomeado como U251HF, com perfil genético sugerindo uma variante do U251, em comparação com U251 no painel NCI-60 linhagem de células cancerosas. As comparações de variantes U251 (Tabela S2) foram fornecidos por Beth Bauer (IDEXX Radil).

Todas as linhas de células de glioma (pais) foram cultivadas em condições SA. Os clones SA e NS derivados foram estabelecidas a partir de colónias individuais formadas em agar mole de 0,3% no topo de uma camada de agar de fundo (0,5%) em DMDM ​​/F12 suplementado com soro de bovino a 5% ou EGF /bFGF /B27 como para culturas NS, escolhido por uma pipeta de vidro, e ampliado em SA ou NS condições. Para U251 as mesmas mutações homozigotos de PTEN [E242fs * 15 (723 724 insTT)] e TP53 (R273H) no parental e SA e NS-subculturas foram identificados por Mariam Youssef, Nirvi Shah e Anthony Wong (UC Irvine).

hibridização fluorescente in situ (FISH)

lâminas metafase-propagação foram obtidas por exposição de 80% de células que crescem para confluently nacadozole solução (100 ug /ml final, Sigma) durante 1 hora. Em seguida, as células foram tratadas com tripsina (0,25% de tripsina /EDTA, Invitrogen) para recolher os sedimentos celulares, os quais foram tratados com uma solução hipotónica (tampão de fosfato) durante 5 minutos a 37 ° C. Os sedimentos de células foram fixadas (metanol: ácido acético glacial = 03:01) durante pelo menos 30 minutos. Finalmente, as suspensões de células foram retiradas em lâminas para obter os spreads de cromossomos em metáfase. O B-bandas padrão foi feito para as lâminas à medida que foram efectuadas como tratamento (simultaneamente) com tripsina, e coradas com corante de Giemsa (Invitrogen). FISH foi realizada em metáfase e secções congeladas de tumor (7 mm) usando DNA marcado directo sonda fluorescente Kits com CEP X /cepy, EGFR /CEP 7 e PTEN /CEP10 (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL). A hibridação, lavagem, e contracoloração foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. 250-300 células por amostra foram contadas sob um microscópio de fluorescência com uma lente 100 ×.

infecção por lentivírus

lentivírus infeccioso foi produzido por co-transfecção do plasmídeo vector lentiviral pGIPZ vazio e pTRIPZ -Empty (Open Biosystems) com embalagem plasmídeo psPAX2 e envelope plasmídeo pCMV-VSVG em células HEK-293T, seguindo o protocolo do fabricante.

análises de imunofluorescência de ic xenotransplantes

Os criosecções (7-8 um) de cérebro do rato com i.c. xenoenxertos foram montados por observação directa da fluorescência expressos pelas células tumorais marcadas com GFP e RFP usando 2 × 20 × e lentes de um microscópio de fluorescência da Keyence BZ8100, após coloração nuclear com DAPI. criocortes adjacentes foram submetidos a análises de imunofluorescência utilizando 15 ug /ml de coelho BMI1 (ab38432, Abcam), 15 ug /ml de CD133 de rato (130-090-422, Miltenyi Biotec), 10 ug /ml de ratinho CD31 (CBL1337, Chemicon), 15 ug /ml GFAP cabra (SC-6170, sana Cruz), 10 ug /ml MELK coelho (A01390, a GenScript), e 15 ug /ml de rato SPARC (SC-73051, sana Cruz) anticorpos primários, seguido por anticorpo secundário apropriado, burro anti-rato, de coelho, de rato ou de cabra Alexa Fluor 350 (azul), Alexa Fluor 488 (verde), e vermelho do Texas (Invitrogen), seguindo o processo de imunofluorescência como descrito anteriormente [25]. As secções de tecido foram montadas com reagente antifade Prolongar ouro (Invitrogen), visualizado com uma lente de 40 × de um microscópio de fluorescência e fotografada com uma câmara local. imagens de co-localização foram adquiridos e analisados ​​usando um Nikon dois laser (HeNe e argônio) PCM 2000 Confocal Sistema em um Eclipse E800 microscópio com 100 × _ENREF_20 objetiva (Melville, NY).

Neural-tronco ensaio de diferenciação celular

(5-10 células de glioma × 10

3) é mantido em condições de cultura de esfera neurais foram semeadas em oito poços lâminas pré-revestidas com fibronectina (10 ng /mL) para a cultura durante a noite em meio original ( desdiferenciação), ou em poli-L-lisina (15 ug /ml de poços) revestidas em DMEM /F12 contendo FBS a 1% durante 7-10 dias de cultura (diferenciação); um volume de metade de meio fresco foi adicionado a cada 3 dias, antes da fixação por análises de imunofluorescência. As células foram fixadas com PFA a 4% e bloqueadas com soro de burro a 10%. Os anticorpos primários (coelho Nestin (1:1000) da Millipore (AB5922), MAP2 rato (1:200) da Abcam (ab11267) e GFAP cabra (1:300) a partir de Sana Cruz (sc-6170), rato Beta Tubulin III (1:200) a partir ChemCon (MAB1637)), rato CD133 (1:50) a partir de Miltenyi Biotec (130-090-422), MELK coelho (1:200) a partir de GenScript EUA (A01390), e coelho IMC (1: 200) a partir de Abcam foram incubados com as células durante a noite a 4 ° C e reveladas utilizando AlexaFluor anticorpos secundários (rato ou coelho Alexa Fluor 488 nm e 594 nm (1:200) a partir de Invitrogen).

em tempo real quantitativa comparativa reacção em cadeia da polimerase (PCR-CQ) e quantitativa de transcrição reversa (qRT-) PCR

amostras de DNA de espécimes de glioma congelados foram isolados usando um kit DNeasy (Qiagen, Valencia, CA). iniciadores CQ-PCR padrão (CQ101 do produto) e PCR para quantificar

EGFR Comprar e três genes de referência em 2q34 (

SPAG16

), 3p14.3 (

ERC2

) e 5q31.2 (

SPOCK1

) eram de Ziren Research LLC (Irvine, CA). É um DNA recombinante contendo os fragmentos de PCR de genes de

EGFR

e de referência em uma peça para determinar CNV como descrito anteriormente [26]. PCR em tempo real foi realizada através de arranque rápido SYBR-Green I Mestre Mix (Roche).

Total de RNA (~ 1 g) extraídos usando Ultraspec (Biotecx) a partir de culturas SA e NS-aderentes, após um de cultura de 24 horas em meio basal, foi convertido em cDNA usando 5 unidades de Superscript II de transcriptase reversa (Invitrogen). As amostras de cDNA foram diluídos e quantificados para expressão dos genes de tempo real qRT-PCR (SYBR Green I) usando um único padrão para genes marcadores e de referência [27], normalizados para

ACTB

. Quantificação de

GAPDH

também foi realizado para comparar com o gene de interesse. As sequências dos iniciadores para genes em qRT-PCR e CQ-PCR estão disponíveis a partir Ziren Research LLC (www.zirenresearch.com) mediante solicitação.

hibridação genômica comparativa (CGH)

DNA (1,5 g) As amostras de células de glioma e de controlo (um pool de seis amostras de DNA do sangue humano normal) foram diferencialmente marcado com Cy5 e Cy3-dUTP, respectivamente, purificada e em seguida hibridados com uma Agilent Genoma Humano CGH 244 K Microarray. Os dados foram analisados ​​estatisticamente e visualizados utilizando dois métodos independentes, incluindo Agilent Genomic Workbench 6.5 (Agilent) com o algoritmo de Z-score e um programa escrito em R (https://www.r-project.org/), que detectou o mesmo aberrações cromossómicas. O limite do Z-score usado para o método Agilent foi definido para 4.

zimografia, enzyme ensaios imunom�ricos, Western blot e immunocytofluorescence

Proteínas em 24 horas meios de cultura celular condicionado foram precipitadas com 4 volumes de acetona fria, centrifugadas imediatamente a 14000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C, e ressuspensas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) contendo Cocktail de Inibidor de Protease (Roche). A mesma quantidade de proteína de meio condicionado foi usado para executar zimografia de gelatina. O meio condicionado foi sujeito a Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) para VEGFA (VEGF-165) e SPP1 (osteopontina) utilizando kits de Assay Designs (Ann Arbor, MI), e PTN de R D Systems (Minneapolis, MN). Sonicada lisado de células inteiras em RIPA foi utilizado para realizar Western blotting, com anticorpos de EGFR a partir de Cell Signaling, e actina da Merck Bioscience. As células cultivadas sobre poli-L-lisina ou revestidas com fibronectina de 8 poços lâminas de câmaras, 2 × 10

4 células por câmara, e incubadas durante a noite, foram fixadas com 4% de paraformaldeído em PBS, com uma breve permeabilização em 0,1% de Triton X -100, e uma incubação de um dia para o outro com anticorpo primário de EGFR a 4 ° C. O sinal immunocytofluorescence foi detectada após incubação com anticorpo secundário Alexa 594 Fluor®.

suave formação de colónias em ágar de ensaio

800-1000 células foram misturadas com 1 ml de agar mole de 0,3% em DMEM /F12 suplementado com soro bovino a 5% ou de um suplemento mitogénio para culturas NS como detalhado acima, espalhada sobre agar mole endurecido 0,5% no mesmo meio (1 mL por poço em quatro cavidades de canto de uma placa de 6 poços). 1 ml do mesmo meio foi adicionado 2 e 3 semanas mais tarde e os números de colónias foram contadas 4 semanas mais tarde sob um microscópio com 4 × lente.

A análise estatística

análise MANOVA foi usado em conjunto com diagrama ternário (https://www.davidgraham.org.uk) para comparar GBM a amostras OG para percentagens de células que carregam uma cópia, duas cópias, ou cópias de ≥3 CHR7. Haste-como células e subculturas enriquecida de células-nonstem como foram comparadas as diferenças na expressão dos genes, ELISA, e os dados por meio de zimografia de 2 amostras iguais de variância-t-testes. A sobrevida global de ratinhos portadores de xenoenxertos de glioma intracraniano foi estimada através de curvas de sobrevida de Kaplan-Meier, então comparados para diferenças usando um modelo de regressão de Cox estratificado de forma a ajustar para o potencial de variação ( “efeitos Day”) entre diferentes experiências. versões SAS 9.2 e 9.3 (Instituto SAS, Cary, NC) foram utilizados para todas as análises e

P

. 0,01 foi utilizado como valor de significância para ajustar para comparações múltiplas, sem overinflating erro do Tipo II

a modelagem matemática

Matemática modelo de construção.

Denote x1, x2, x3, x4, x5 como a abundância de células com 1-5 cópias de CHR7. Nós negligenciado células com 6 cópias, assumindo que eles foram estágios anáfase de células CHR7 3-cópia. Nós não esperamos que os resultados abaixo seria significativamente afectada por esta suposição vez que a percentagem das células 6-cópia é baixa em todas as medidas. Para simplificar nós também assumir que as taxas de mis-segregação de CHR7 normal e anormal são os mesmos. Para os paus (2Chr7: 1n, 1d), assumimos as células podem dividir simetricamente, ou ter um CHR7 mis-segregação, como resumido abaixo

Da mesma forma para TMCs (3Chr7: 2n, 1d), temos

os parâmetros

r

i é a constante da taxa de crescimento de espécies de

i

, p

2 e p

3 referem-se as probabilidades de assimétrica (mal) a segregação de um par de CHR7 nas STICS e TMC por divisão celular, respectivamente. Em geral, estas probabilidades dependem de x, mas para simplificar podemos negligenciar essa dependência possível. Note-se que para o TMC, duplo mis-segregação de dois pares de CHR7 pode resultar em quer uma ou + 5 3 + 3, para a qual assumimos uma probabilidade igual. Para as células com outra CHR7 copiar números, uma vez que as suas percentagens são muito baixos, temos negligenciado as contribuições ainda menores de possíveis eventos de cromossomos mis-segregação. As equações de taxa que regem are China

Por conveniência de discussão que também denotam a porcentagem de cada α subpopulação em um determinado ponto do tempo eu como. Estas quantidades foram o que medida experimentalmente usando FISH.

Consideramos três casos

No mis-segregação, ou seja, p

2 = p

3 = 0 SCs e MCs não têm mútua influência direta

existe Mis-segregação, os paus e TMCs não têm influências mútuas directas

Missegragation existir, STICS parcialmente inibir o crescimento das TMCs, que é modelada por uma função de Hill como e MCs activar o crescimento de SCS, que é modelado como, onde e é a constante da taxa de crescimento de TMC quando percentagem STIC e, respectivamente, e são e a constante da taxa de crescimento de STIC quando TMC percentagem e, respectivamente. Nós, na verdade, também considerar o caso com coeficiente de Hill 4 em vez de 2, mas o resultado não mostra nenhuma mudança significativa

método numérico

As equações diferenciais ordinárias acima foram resolvidos usando Matlab. No início de cada passagem, de modo que rescale. Experimentalmente. Para a nossa modelagem matemática o número exato de N

0 não afeta os resultados. Para a passagem 1, foram utilizados os valores de ρ usados ​​experimentalmente como os valores iniciais. Para passagens subsequentes, foram utilizados os valores ρ calculados no final da passagem anterior como os valores iniciais.

Para cada caso, o melhor conjunto de parâmetros foi obtida através da minimização onde e referem-se às porcentagens calculadas e medidas de α subpopulação no final da passagem i, respectivamente. Utilizou-se o método simplex down-hill [28] para executar a minimização. Com cada melhor conjunto de parâmetros, previmos os tempos de duplicação.

Resultados

heterogeneidade Tumor especificado pelo CHR7-CNV comumente existe em gliomas de alto e baixo grau

Para determinar CHR7 número de cópias variação (CNV) a nível subpopulação de células, foi realizada fluorescente

in situ

fluorescente (FISH) com sondas duplas para o

gene e na região centromérica do cromossomo 7 EGFR

(CEP7 ). Examinamos GBM e Oligodendroglioma (OT), o segundo mais comum grupo de gliomas, caracteriza-se por recursos oligodêndricas. OT inclui oligodendroglioma (OG, grau II), Oligoastrocitoma (OA, grau II); e oligodendroglioma anaplásico (AO, grau III), com base em critérios da Organização Mundial de Saúde. O número de centrómeros CHR7 por núcleo, detectados pela sonda FISH CEP7, foi determinada por contagem de mais de 250 células por tumor, e estes dados foram utilizados para determinar o nível de heterogeneidade do tumor em relação à CHR7-CNV. Nós, então, realizada uma comparação das diferenças no estado de equilíbrio para a heterogeneidade do tumor com base em dados CHR7-CNV a partir de 14 GBMs e 12 OGs. Havia uma percentagem significativamente mais elevada de células que transportem mais de 2 cópias de CHR7 (amplificação) em comparação com OG GBM (

P

0,0005) (Figura 1A). Em contraste com OG, o CHR7-CNV na OA e AO foi próximo ao de GBM, com dados representativos apresentados na Figura 1B.

A, plot ternário de proporções populacionais com 1 cópia (supressão), 2 cópias (normal), e 3 ou mais (amplificação) cópias de CHR7, com base em sinais CEP7 em Ffuorescent

in situ

fluorescente (FISH) de multiformes 14 de glioblastoma (GBMs,

triângulo vermelho

) e 12 Oligodendroglioma (OGs,

quadrado preto

),

P

= 0,0012 a partir da análise MANOVA. B, a comparação da heterogeneidade do tumor em relação ao cromossoma 7 (CHR7) aneuploidia do tumor original (T) e correspondentes culturas primárias de 3-4 semanas de idade, sob aderente soro (SA) ou condições de cultura esfera neural (NS). C-D, os padrões de células com CHR7-CNV em GBMs-EGFR altas amplificados sequenciais e. Representativos fish imagens de células portadoras 1-4 cópias de CHR7 com a amplificação de EGFR focal.

Para determinar se as populações de células tumorais CHR7 CNV caracterizados são viáveis ​​e contribuindo para a diversidade clonal dentro de cada tumor, examinamos a curto prazo (4-6 semanas com 1-2 passagens) culturas primárias sob aderente soro (AS) e /ou condições de cultura esfera neural (NS). Encontramos células subpopulação com CHR7-CNV em todas as culturas primárias de glioma examinadas (Figura 1B). Houve uma maior percentagem de células com CHR7-amplificação em culturas de GBM do que naqueles de OG. Em ambos os casos, a percentagem de células com CHR7-ampliciation foi maior em culturas primárias do que no tumor correspondente. Para AO, que é um tipo mais progressivo da OT, também observamos uma CHR7-amplificação semelhante no tumor e na sua cultura primária derivada. Curiosamente, em oligo-astro misturado OT, com o nome “OA”, o equilíbrio da composição celular para CHR7-heterogeneidade dos tumores originais era semelhante ao de GBM. No entanto, em culturas primárias derivadas de OA, observou-se heterogeneidade assemelha-se surpreendentemente que de OG, com uma maioria de células possuindo duas cópias CHR7 e menos de 40% das células que transportam três ou mais cópias de CHR7 (Figura 1B).

em seguida, compararam os padrões de CHR7-heterogeneidade em OG ou GBM com recorrentes e

de novo

status, e não encontrou nenhuma correlação. No entanto, verificaram-se aumentos incrementais na percentagem de células com CHR7-amplificação em GBMs sequenciais (isto é, tumores da amostra ao longo do tempo na progressão ou recorrência) de um paciente com neurofibromatose (Figura 1C). Isto é consistente com a análise acima, mostrando uma capacidade de crescimento mais rápido para as células com CHR7-amplificaiton.

Uma consequência directa de amplificação molecular CHR7 é a amplificação do oncogene EGFR residente no seu interior, que confere uma vantagem de crescimento. amplificação focal de EGFR é comumente visto no subtipo clássico de GBM [29]. Nós, portanto, em comparação CHR7-CNV com EGFR-CNV, determinada pelo tempo real comparativa PCR quantitativa. Nós achamos um equilibrada

EGFR

, relativamente à referência genes (proporção 0,7-1,3, dada uma variação de 20-30% em quantificação) em todos os tumores oligodendrogliais (n = 17) e em 53% dos GBMs (n = 51), e um baixo nível de

EGFR

amplificação (relação 1,4-2) em 23,5% dos GBMs, todos bem correlacionada com a calculada

EGFR

níveis, com base na percentagem de células e sua número CHR7. Nos restantes 23,5% do GBM, encontramos um alto nível de

EGFR

amplificação (relação entre 5-48), que foi verificado por EGFR /CEP7 Peixe a amplificação EGFR focal (Figura 1D). Em EGFR (focal) GBMs amplificados, o padrão de heterogeneidade CHR7-tumor verificou-se ser semelhante à da GBMs sem EGFR (focal) amplificação.

Tomados em conjunto, observou-se um nível substancial de heterogeneidade do tumor, sendo células mostrando CHR7-CNV comumente ocorrem em ambos os gliomas de baixo e de alto grau. Monossomia do cromossoma 10 é também uma instabilidade cromossoma funcionalmente relacionada com a malignidade de tumores [30] e ocorre em cerca de 80% dos tumores GBM. Quando presente, a monossomia 10 é mostrado de forma homogénea, em contraste com a heterogeneidade observada para CHR7. Esta diferença sugere que deve haver um processo activo para manter CHR7 heterogeneidade nos tumores, os quais nós identificámos ser CHR7-MS. Para estudar ainda mais este processo examinamos CHR7-MS e CHR7-CNV em linhas de células de glioma estabelecidos.

CHR7-MS está envolvido na manutenção heterogeneidade celular em linhas de células de glioma estabelecida

Realizamos B- bandas usando corante Giemsa sobre os spreads de cromossomos de seis linhas celulares de glioma maligno humano e determinou o intervalo de números de cromossomos inteiros (WCN) agrupados em torno do modo com base em mais de 7 células. EGFR FISH /CEP7 e foram realizadas contagens de sinais CEP7 em mais do que 250 células da interfase foram usadas para determinar a percentagem de células que transportam diferentes números de CHR7 (Figura 2A). Todas as linhas celulares do glioma revelou a co-existência de diversos sub-populações de células com base em CHR7-CNV, com uma percentagem significativa das células que transportam 2-, 3-, e 4-cópias de CHR7 com um cariótipo diplóide quase-(U251, U87 e LG11) , 4, 5, e 6 cópias de CHR7 quase em triplóides /tetraploid (A172 e LN229) e 6, 7 e 8 cópias de CHR7 em cariótipo quase pentaplóides (T98G).

A-B, a percentagem de células com CHR7-CNV em linhas de células de glioma, e as suas subculturas SA e NS da única (por exemplo, 1, 2) ou misturado (mistura) colónias soft-agar, respectivamente. números cromossoma inteiro (WCN) variando perto do modo foram encontrados em 50% de células em cada linha de células de glioma. D, peixes fotos mostrando normal (n) e derivativo (d) CHR7 e do cromossomo desconhecido (?) Transportando um EGFR translocado de uma célula metaphase representante para cada linha de células. O cromossomo é mostrado por DAPI (azul), centrômero e EGFR são apresentados por sondas de peixe para CEP7 (verde) e EGFR (vermelho).

Em condições SA-cultura que foram usados ​​para a cultura destes linhas de células de glioma, estabelecemos subculturas de chapeamento de uma única célula ou colónias-ágar mole individuais das linhas de células de glioma, que nós chamados clones SA (SA1, SA2, etc). PEIXES mostrou re-aparecimento de heterogeneidade das células CHR7 em cada um dos clones SA (Figura 2B), mantendo características de CHR7 e

EGFR

amplificação e /ou translocação que foram encontrados nas suas culturas parentais (Figura 2D) . Curiosamente, a percentagem dessas células que tinha sido na maioria na cultura dos pais diminuiu nas subculturas clonais SA. A exceção foi LN229, que foi originalmente composto por duas subpopulações de células quase igual em percentagem. Evidentemente, a heterogeneidade do tumor foi mantido na linha de células de glioma estabelecida por CHR7-MS. Ele também indica que uma linha celular estabelecida é um ecossistema cultivadas com subpopulações de células alcance certo equilíbrio ao longo do tempo. Em seguida, perguntou se pela mudança das condições de cultura que poderia mudar o equilíbrio de heterogeneidade, de modo a permitir uma subpopulação de células previamente minoria para se tornar dominante sob novas condições de cultura. Se isso provou ser o caso, que seria capaz de variar as condições de cultura para obter um número suficiente de várias células minoritários para um estudo mais aprofundado de seus fenótipos e as contribuições para o crescimento global.

Nós exposta linhas de células de glioma de NS condições de cultura, que foram originalmente desenvolvidos para a cultura de células estaminais neurais e, em seguida, modificados para o enriquecimento de células de glioma expressando características de células estaminais neurais semelhante [31], [32]. Verificou-se que após a cultura de um mês em condições de ns, durante os quais houve uma morte massiva das células, (com as células mortas repetidamente removidos por passagem de células e para trás entre as condições aderentes não-aderentes e mediada por fibronectina em meio de NS), uma subpopulação de células minoria na linha parental passou a dominar as subculturas NS. Nós ainda estabelecido subculturas NS clonais de colónias individuais formados em soft-agar preparada usando meio NS, e nomeou essas “NS clones” (NS1, NS2, etc). Figura 2C mostra os dados PEIXES representativas de subculturas NS de linhas de células de glioma. Estes dados mostram re-aparições de heterogeneidade de células CHR7 a partir de subculturas NS clonais.

Foram necessários 4 semanas para colônias a se formar em agar mole, antes da sua transferência para condições de cultura SA ou NS para um maior crescimento. Após a transferência, levou cerca de 2 semanas para obter células suficientes (2 × 10

5) para a análise de FISH. O tempo necessário para restabelecer a heterogeneidade cultura a partir de uma única célula foi menos de 18 divisões celulares, que levou cerca de 6-7 semanas. Re-ganhando de culturas de células heterogêneos com CHR7-CNV em clonais SA e NS subculturas de todas as linhas de células de glioma estudados demonstraram que CHR7-MS poderia acontecer em qualquer célula subpopulação de conduzir diversidade populacional tumor, enquanto as condições de cultura determinou o equilíbrio heterogeneidade da tipos de células tumorais.

mudanças dramáticas no equilíbrio das subpopulações de células entre SA e culturas NS foram observadas para as duas linhas de células de glioma com cariótipo diplóide perto, U251 e U87.