Abstract

SNPs na célula da próstata Stem Antigen (

PSCA

) gene foram encontrados associados com câncer gástrico risco (GC) em um estudo de associação do genoma. Esta associação foi replicada em várias populações. Neste estudo avaliou o impacto da

PSCA

genótipo sobre o risco de lesões pré-cancerosas gástricas avançadas e GC. Usamos base de dados histopatologia gástrica e DNA de biópsias gástricas congeladas de 2045 indivíduos incluídos em um ensaio quimioprevenção para lesões pré-cancerosas gástricas na Venezuela, e 180 casos de GC da mesma área. Foram analisados ​​3 SNPs no

PSCA

gene (rs2294008, rs9297976 e rs12155758) que foram encontrados anteriormente para ser associado com o risco de GC nos europeus. O alelo T do rs2294008 foi encontrado para ser associado com uma maior prevalência de gastrite atrófica (OR = 1,44; IC 95% 1,03-2,01 para o modelo dominante) e metaplasia intestinal (OR = 1,50; IC 95% 1,13-1,98 para o dominante modelo). Nós também confirmou a associação com maior risco de câncer gástrico (OR = 2,34; IC 95% 1,36-4,01 para os portadores do alelo). SNP rs12155758 não foi associada a risco de lesões pré-neoplásicas gástricos, mas confirmou sua associação com maior risco GC (OR 1,95; IC 95% 1,29-2,97 para o modelo dominante). Nós testamos a relevância da presença da

Helicobacter pylori cagA

gene, que é conhecido por aumentar o risco de lesões gástricas mais graves, mas não encontramos qualquer interação clearcut com

PSCA

SNPs na definição de risco de lesões pré-cancerosas gástricas ou câncer

Citation:. Rizzato C, Kato I, Plummer M, Muñoz N, Canzian F (2013) Variação genética em

PSCA

e risco de gástrico avançado pré-neoplásicas lesões e câncer em relação à

Helicobacter pylori

infecção. PLoS ONE 8 (9): e73100. doi: 10.1371 /journal.pone.0073100

editor: Ludmila Prokunina-Olsson, do National Cancer Institute, National Institutes of Health, dos Estados Unidos da América

Recebido: 28 de fevereiro, 2013; Aceito: 18 de julho de 2013; Publicação: 04 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Rizzato et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Comunidade Europeia (CT90-0555 para IK) e do Instituto Nacional do Câncer dos EUA (CA 98309 para IK) DOI: 10.1002 /ijc.28019. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O celular da próstata Caule antigénio (

PSCA) gene está localizado no cromossoma 8q24.2 e codifica uma proteína de superfície celular do ácido 123 amino com 30% de homologia com o antigénio de células estaminais do tipo 2 (SCA- 2), um marcador da superfície celular de linfócitos imaturo [1].

PSCA

é conhecido por ser expresso principalmente em células de diferenciação, em vez de células estaminais [2], [3]. Os membros da /Ly-6 família de Thy-1, ao qual pertence o PSCA, mostram uma notável diversidade funcional variando de activação de células-T a regulação da apoptose no sistema nervoso [4].

é expressa PSCA na epitélio de vários órgãos, tais como o da próstata, da bexiga, da vesícula biliar e do estômago. A sua expressão é específica para algumas populações de células no epitélio das estes órgãos: no epitélio gástrico, o local de expressão principal são as regiões do istmo e do pescoço, que contêm células de diferenciação. Em particular, a expressão de PSCA é regulada negativamente no tecido gástrico com metaplasia intestinal [2].

O primeiro estudo de associação do genoma (GWAS) sobre câncer gástrico (CG), realizado em uma população japonesa, identificado um associação entre rs2294008 SNP () do

PSCA

e risco do tipo difuso de GC. Substituição do alelo C com o alelo de risco T em rs2294008 no primeiro exão cria um local de início da tradução novel (Met em vez de Thr), estendendo-se desse modo a proteína de 9 aminoácidos e que afectam a actividade de transcrição do gene de [2]. A associação entre rs2294008 e risco de GC tem sido replicado em outras populações asiáticas e caucasianos [5] – [9]. Uma associação com o tipo intestinal GC também foi encontrada tanto em caucasianos e asiáticos, embora com odds ratio menores do que com tipo difuso [5], [6], [10], [11].

Dois outros SNPs eram previamente encontradas associadas com CG em europeus [6]. Estes SNPs são rs9297976, localizado em 9,6 kb a montante do

PSCA

e 0,8 kb a montante do

JRK

; e rs12155758, localizado em 1,7 kb a jusante da

PSCA

.

Aqui, realizamos um estudo para avaliar o impacto destas 3

PSCA

SNPs sobre o risco de gástrico avançado lesões pré-cancerosas e câncer gástrico, pela primeira vez em uma população da América Latina (Venezuela). Esta população está em risco relativamente elevado de câncer gástrico (a taxa de incidência é de 10,4 casos novos por 100.000 pessoas por ano ea mortalidade é de 8,9 mortes por 100.000 pessoas por ano (https://globocan.iarc.fr/), em especialmente os estados de Táchira (onde foram coletadas as amostras) mostra uma taxa de mortalidade por câncer gástrico 3-4 vezes maior do que o restante do país [12]. a população venezuelana também tem muito elevadas taxas de infecção com

Helicobacter pylori ( H. pylori)

, o fator de risco mais conhecido por câncer gástrico [13], [14].

Nós também testamos a relevância da presença da

H. pylori cagA

gene, que em estudo anterior [15] temos demonstrado para aumentar fortemente o risco de lesões mais avançadas. o

cagA

gene reside dentro da ilha de patogenicidade gene associado a citotoxina (cagPAI), a melhor caracterizada

H pylori

marcador de virulência;. Nesta região, forma um sistema de secreção de tipo IV, que transloca produtos bacterianos para a célula hospedeira. cagA é responsável pela maior parte do

H. pylori

associada fenótipos malignas: desencadeia a interleucina-8 secreção, priming uma resposta inflamatória, promove a proliferação celular, migração e dispersando [16], [17]. A prevalência de

cagA

-positivas em populações venezuelanas foi estimado entre 59% e 95% no

H. pylori

doentes com serologia positiva [18], [19].

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os participantes do estudo prevenção assinaram um consentimento informado por escrito, enquanto que para o participante para o estudo de caso-controle consentimento informado oral foi obtido de acordo com o procedimento normal implementado no Centro de controle do Câncer e no hospital em San Cristobal, onde as amostras foram coletadas, no momento em que o estudo foi realizado.

Ambos os estudos foram aprovados pelos conselhos de ética em pesquisa da Agência Internacional de Investigação do Cancro (IARC) Comitê de ética em Lyon, França, e o Centro de Controle do Câncer, em San Cristobal, Venezuela.

Estudo da População

o estudo randomizado, que forneceu a base para este estudo foi descrito anteriormente [15]. Os indivíduos elegíveis eram participantes do programa de controle de GC de Estado Tachira, Venezuela, entre 35 e 69 anos de idade. Todos os indivíduos foram submetidos a exame gastroscópico com coleta de biópsias gástricas, sangue e amostras de urina, e eles foram administrados um questionário sobre variáveis ​​sociodemográficas e de estilo de vida por um entrevistador treinado. Durante o período de recrutamento estudo entre julho de 1991 e Fevereiro de 1995, havia 4349 indivíduos elegíveis, dos quais 2272 foram convidados a participar no julgamento. Destes, 72 se recusaram a participar. Para 155 sujeitos do DNA a partir de biópsias não estava disponível mais ou a qualidade era insuficiente para genotipagem, deixando assim um total de 2045 indivíduos que foram incluídos na análise estatística.

casos de câncer gástrico foram identificados no hospital geral em San Cristobal, capital do Estado de Tachira, entre janeiro de 1991 e janeiro de 1997 como parte de um estudo de caso-controle correndo em paralelo com o julgamento de intervenção [13], [20]. A fim de ser elegível para inclusão no estudo, os casos tiveram que ser residente em Tachira por pelo menos 5 anos, ter mais de 35 anos de idade, ter confirmado histologicamente câncer gástrico e não tiveram a cirurgia gástrica anterior. Foram excluídos os tumores não epiteliais do estômago. Os casos foram classificados de acordo com a classificação de Lauren. Cinco dos 7 biópsias retiradas de cada indivíduo no início do estudo foram utilizados para avaliação histopatológica. Estes foram obtidos a partir do antro (3 biópsias), o ângulo da incisura (uma biopsia) e o corpo (1 biópsia). As biópsias foram fixados em formalina tamponada e coradas com hematoxilina-eosina e Giemsa. Um dos 3 patologistas do Centro de Controlo do cancro classificadas cada um dos 5 biópsias como indicativos da mucosa normal, gastrite superficial, gastrite crónica, gastrite atrófica crónica, metaplasia intestinal ou displasia, como descrito anteriormente [13], [20] controlos a partir da estudo caso-controle não estão incluídos na presente análise, pois não forneceram biópsias gástricas e por isso não tem dados comparáveis ​​sobre

H. pylori

infecção.

SNPs Seleção e Genotipagem

Foi selecionado o PSCA três

SNPs que foram previamente relatados para ser associado com o risco de GC nos europeus [6]. Nós não digite rs2976392 SNP, originalmente encontrada associada com o risco de câncer gástrico no primeiro GWAS em câncer gástrico [2], porque ele está em muito alta ou completa desequilíbrio de ligação com rs2294008 (0.97≤r

2≤1.0) em 6 populações com origem da Europa, Norte ou América do Sul analisadas no projeto 1000 genomas (https://www.1000genomes.org) [21] e, portanto, provável na população venezuelana também.

DNA total foi extraído a partir de amostras de biópsias gástricas após a digestão com proteinase K. Resumidamente, as biópsias foram incubados em 250 ul de uma solução de Tris 10 mM – HCl (pH 8,0), EDTA 5 mM, 0,1% de sulfato de dodecilo de sódio, e 0,1 mg /ml de proteinase K durante pelo menos 2 horas a 55 ° C. Proteinase K foi inactivada por incubação a 95 ° C durante 10 minutos.

A genotipagem foi realizada utilizando um sistema específico de alelo baseada em PCR Kaspar genotipagem de SNP (KBiosciences, Hoddesdon, Reino Unido). A termociclagem foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. A detecção foi realizada utilizando um Prism 7900 Sequence Detection System HT ABI com SDS 2.2 Software (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

A presença do

H. gene pylori cagA

em biópsias gástricas foi previamente avaliada por hibridização reversa utilizando um ensaio de sonda de linha ou um ensaio imunoenzimático DNA em Delft Laboratório de Diagnóstico [22], [23]. Além disso, digitamos dois SNPs no

gene cagA

na posição 154 (cagA154_GA) e 858 (cagA858_CT), pelo sistema de genotipagem Kaspar SNP baseado em PCR alelo-específico. A presença dos dois sítios polimórficos foi determinada por sequenciação de um pequeno subconjunto da mesma população [24]. Além disso, os resultados obtidos com este ensaio foram comparados com os resultados da sequenciação com concordância de 100%. Uma amostra foi definida como positiva quando se cag mostrou um sinal em pelo menos duas das três reacções de PCR (isto é, a hibridização reversa /imunoensaio enzima ADN e os dois ensaios de SNP).

Análise estatística

a variável resposta neste estudo foi de diagnóstico histológico global, que foi dividida em 5 grupos: câncer gástrico; displasia; EU ESTOU; gastrite atrófica; e epitélio normal a gastrite crónica. O último grupo serviu de grupo controle neste estudo porque a freqüência combinada de epitélio normal e gastrite superficial nesta população foi inferior a 5%. análise de regressão logística multinomial foi empregada, utilizando o procedimento SAS CATMOD, para estimar odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (CIs) associados SNPs para gastrite atrófica, IM, displasia e câncer gástrico, em comparação com os controles. Todas as RUP foram ajustadas para variáveis ​​básicas demográficos (sexo, idade e escolaridade), e outros fatores de risco relatados anteriormente nesta população (o consumo de cigarros, e duração do uso frigorífico) [25]. A igualdade de RUP entre os estratos (H: β1-β2 = 0) foi testada usando um grau de liberdade Wald estatística qui-quadrado. No modelo dominante, heterozigotos e homozigotos para o alelo secundário foram considerados como um único grupo de portadores do alelo de menor importância. A fim de ter em conta o grande número de testes foi utilizado o teste de Bonferroni para definir o limiar de significado, resultando em um limiar final de p . 0,004 (se dividir 0,05 /12 (3 polimorfismos * 4 terminais de diagnóstico))

resultados

características básicas da população incluída neste estudo são apresentados na Tabela 1. sucesso genótipo foi 95%. amostras duplicadas cegos (16,7%) incluído para controle de qualidade mostraram 99% de concordância genótipo. As freqüências genotípicas de todos os SNPs em controles estavam de acordo com Hardy-Weinberg (dados não mostrados).

Foi avaliado o risco de lesões pré-cancerosas gástricas e câncer gástrico, em comparação com o normal e não gastrite atrófica, de acordo com os genótipos em

PSCA

SNPs (tabela 2)

para rs2294008, observou-se um risco aumentado de gastrite atrófica (OR = 1,49;. IC 95% 1,05 IC 95% 1,03-2,01 no modelo dominante) e IM (OR = 1,56;; -2,11 em portadores heterozigotos e OR = 1,44 IC 95% 1,16-2,09 em portadores heterozigotos; OR = 1,40; 95% CI 1,02-1,93 em portadores homozigotos e OR = 1,50; IC 95% 1,13-1,98 no modelo dominante). Nós também confirmou o aumento do risco de câncer gástrico em geral em ambos os portadores heterozigotos e homozigotos de T alelo rs2294008 (respectivamente OR = 2,16; IC 95% 1,23-3,82; OR = 2,60; IC 95% 1,44-4,68; P

tendência = 0,002) e uma associação significativa com o alelo T sob o modelo dominante (OR = 2,34; IC 95% 1,36-4,01)

Para rs12155758 não observamos qualquer associação estatisticamente significativa com lesões pré-neoplásicas gástricas, no entanto. heterozigotos portadores do alelo a foi associado com um risco aumentado de GC (OR 2,13; IC 95% 1,38-3,28) e sob o modelo dominante do alelo a também foi associado com aumento do risco GC (OR = 1,95; IC 95% 1,29-2,97 ).

rs9297976 não mostrou associação estatisticamente significativa com lesão pré-neoplásica ou de risco GC.

Associações com GC subgrupos

foi realizada uma análise sub-grupo em indivíduos do associações significativas com câncer gástrico na tabela 2 para ver se a força da associação diferiu por tipo histológico (103 casos de subtipos intestinais, 56 difusa e 21 outros tipos) e sub-localização anatômica (18 casos de cárdia e 162 casos não cárdia) . Os resultados são mostrados na Tabela 3; rs9297976 é omitido porque ele não mostrou associação com câncer gástrico. Nenhuma das diferenças observadas de associação entre subgrupos GC foi estatisticamente significativa (tabela 3).

Associações de Estado cagA

Nós também realizou uma análise sub-grupo de associações significativas com GC e com lesões pré-cancerosas no modelo dominante, para ver se a força de associação variaram pelo

status cagA

(Tabela 4). Associações que não foram significativas na Tabela 2 são omitidos. Também combinado metaplasia intestinal e displasia em uma única categoria, devido ao pequeno número de displasias no grupo negativo cagA [15].

A interação significativa entre limítrofe

H. Observou estado pylori cagA

e genótipos em rs2294008 para o grupo combinado de indivíduos com IM ou displasia (p = P = 0,056), na qual a associação foi mais forte no

cagA

grupo -positivo (OR = 1,80, 95% CI 1,29-2,42) do que o

cagA

grupo -negative (OR = 1,03; IC 95% 0,63-1,68). No entanto, não foi observada tal interação para GC, onde as RUP apareceu igualmente forte em ambos os sub-grupos (OR = 2,40 vs OR = 2,55, p = 0,99) (Tabela 4).

Discussão

Relatamos aqui a reavaliação de 3 SNPs em

PSCA

encontrado para ser associado com o risco de câncer gástrico em europeus [5], [6] e seu possível envolvimento em risco de lesões pré-cancerosas e cancerosas em relação com a infecção com o

cagA

-positivo

H. pylori

.

Três GWAS anterior encontrou uma associação significativa do alelo T do rs2294008, um SNP funcional no

PSCA

gene, com o risco de câncer gástrico e da bexiga [2] , [26], [27] e o alelo C durante úlcera duodenal [28]. Vários estudos de caso-controle confirmou a associação desse SNP com GC em populações asiáticas e caucasianos. Meta-análises [10], [11], [29], [30] mostrou RUP variando entre 1,41-1,66 para o modelo dominante e entre 1,14-1,33 para o modelo recessivo. O outro

PSCA dois

SNPs do nosso estudo foram previamente encontrado para ser associado com o risco de GC nos europeus [6]. Confirmamos a associação entre o alelo T do rs2294008 e alelo A rs12155758 com o risco GC.

Atrofia intestinal metaplasia, displasia e câncer desenvolver sequencialmente ao longo de várias décadas em pacientes suscetíveis, com persistente

H. pylori

gastrite -associated [31]. Lochhead e colegas [5] descobriram que o alelo rs2294008 T está também associada com a gastrite atrófica. Os resultados do presente estudo mostra a associação entre o alelo T do rs2294008 com o risco de gastrite atrófica e IM. Um maior grau de associação é observado também para displasia, embora não seja estatisticamente significativa, possivelmente devido ao pequeno número de amostras analisadas. Observamos um gradiente de risco consistente com a progressão de menos grave de lesões pré-neoplásicas mais graves e com câncer. Estes resultados devem ser interpretados com cautela, devido ao pequeno tamanho dos grupos individuais de indivíduos com lesões pré-neoplásicas específicas. Mais estudos, com amostras maiores são necessários para tirar conclusões definitivas quanto a este ponto.

In vitro

ensaios repórter mostrou que o alelo T do rs2294008 reduziu a atividade transcricional do

PSCA

promotor em ambas as linhas de células gástricas e na bexiga [2], [27]. Além disso, um estudo recente mostrou que funcional a variação genética em

PSCA

poderia alterar a localização subcelular e estabilidade da proteína [28]. Estes resultados conduziram à hipótese de que a susceptibilidade a úlcera duodenal e cancro gástrico é influenciada pela variação genética em

PSCA

através de um efeito de promoção do crescimento do alelo T e um efeito sobre a activação de células T por o alelo C [ ,,,0],28]

intestinal e adenocarcinoma gástrico tipo difuso são diferentes em suas características epidemiológicas, etiologia e prognóstico [32] – [36].. De forma consistente com estudos em europeus e meta-análises de estudos em asiáticos [5], [11], [29], [30], observa-se uma associação deste SNP com todos os tipos histológicos de GC, sem qualquer evidência estatisticamente significativa de diferença no risco entre os subtipos de GC de acordo com a histologia ou localização. Deve-se notar, porém, que o tamanho da amostra dos subgrupos neste estudo é bastante pequena.

A associação entre rs2294008 e

H. pylori

foi investigada em 3 estudos, mas nenhum deles ter encontrado uma associação estatisticamente significativa, exceto por uma fraca interação entre o SNP ea infecção encontrada em uma população europeia [5], [6], [37] . Nós exploramos a interação entre

PSCA

polimorfismos ea presença ou ausência de

cagA

cepas e não de

H. pylori

infecção, porque em um estudo anterior [15] sobre a mesma população, observamos uma forte correlação entre

cagA

presença e risco de lesões pré-malignas avançadas. Não foi observada qualquer interacção entre convincente

PSCA

SNPs e

cagA

status de risco de lesões gástricas pré-neoplásicas ou GC. A interação fracamente significativa entre rs12155758 e

cagA

status com relação ao risco de IM /displasia é difícil de interpretar, porque rs12155758 se mostram agora uma associação com o risco de IM /displasia por conta própria. Estas observações sugerem que PSCA pode estar envolvido na carcinogênese gástrica através de ambas as vias cagA-dependentes e independentes de.

Nós percebemos que o nosso estudo apresenta algumas limitações. Em primeiro lugar, embora o estudo geral é bastante grande, o tamanho da amostra para subgrupos específicos é bastante pequena. Além disso, inferir relação causal para as associações observadas em um estudo transversal, pode ser difícil, porque as relações temporais entre os riscos e os resultados não são claros. No entanto, a análise transversal tem uma vantagem em acumular alterações histológicas desenvolver ao longo de várias décadas como

H. pylori

é geralmente adquirida na infância em populações de alto risco [38]. Em terceiro lugar, não temos informações sobre a etnia dos sujeitos do estudo. Existem diferenças nas distribuições alélicas desses SNPs em populações diferentes (ver tabela S1 suplementar), no entanto as frequências que observamos são semelhantes aos de outras populações latino-americanos para os quais existem dados disponíveis (quadro suplementar S1). Embora não possamos demonstrar formalmente que estas três variantes cobrir adequadamente as marcadas na população europeia estudado por Sala

et al

. [6], a população venezuelana que estudamos tem uma forte componente de ascendência europeia, portanto, o padrão de desequilíbrio de ligação deve, sem dúvida, não ser muito diferente. Finalmente, o nosso estudo foi limitado a uma população venezuelana e os resultados não podem necessariamente ser extrapolados para outras populações

.

Em resumo, mostramos que um SNP funcional no

PSCA

gene está associado ao risco de lesões avançadas pré-cancerosas gástricas e GC e a avaliação do risco não parece ser modificado pela presença ou ausência de

H.pylori

estirpes que transportam o gene que codifica a cagA citotoxina bacteriana.

Informações de Suporte

Tabela S1.

freqüências alélicas e genotípicas da população venezuelana estudado e as populações do Projeto 1000 Genomas

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0073100.s001

(DOCX)

Agradecimentos

Somos gratos a Leen Jan van Doorn (DDL Laboratório de diagnóstico, Voorburg, Holanda) para a caracterização inicial das amostras venezuelanos positivos CagA, e Silvia Franceschi (Agência Internacional de Investigação do Cancro, Lyon, França) para leitura crítica do manuscrito.