Abstract

Temos relatado anteriormente uma tecnologia antisense, ‘vetores snoMEN’, por alvejado knock-down de proteína de codificação usando mRNAs snoRNAs humanas manipuladas para conter regiões curtas de complementaridade de sequência com o ARNm alvo. Aqui caracterizamos o uso de vectores snoMEN para segmentar o knock-down de micro transcritos de ARN primário. Nós documentamos o knock-down específico de miR21 em células HeLa usando vectores de plasmídeo expressando RNAs snoMEN miR21-alvo e mostrar-lhe induz a apoptose. Knock-down é dependente da presença de sequências complementares no vector snoMEN e a indução da apoptose pode ser suprimida por sobre-expressão de miR21. Além disso, também desenvolveram vectores lentivirais para entrega de snoMEN ARN e mostrar isto aumenta a eficiência da transdução do vector em muitas linhas de células humanas que são difíceis de transfectar com vectores plasmídicos. A transdução de vectores lentivirais que expressam snoMEN alvejado a pri-miR21 induz a apoptose em células de adenocarcinoma do pulmão humano, que expressam elevados níveis de miR21, mas não em células humanas primárias. Mostramos que a supressão mediada snoMEN-expressão de miARN é impedida por siRNA knock-down de ago2, mas não por knock-down de ago1 ou Upf1. snoMEN RNAs colocalise com ago2 nos núcleos celulares e nucléolos e pode ser co-imunoprecipitado a partir de extractos nucleares por meio de anticorpos específicos para ago2

citação:. Ono H, Yamada K, F Avolio, Afzal V, D Bensaddek, Lamond AI (2015) Targeted knock-down de miR21 transcritos primários Usando snoMEN vetores induz a apoptose em linhas celulares de cancro humano. PLoS ONE 10 (9): e0138668. doi: 10.1371 /journal.pone.0138668

editor: Christophe Antoniewski, CNRS UMR7622 Universidade Paris 6 Pierre-et-Marie-Curie, França |

Recebido: 24 de junho de 2015; Aceito: 02 de setembro de 2015; Publicação: 25 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ono et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. o financiamento para esta pesquisa foi fornecido por um Programa de Bolsas de Wellcome Trust para AIL (Ref: 073980 /Z /03 /Z) (https://www.wellcome.ac.uk/) e por uma concessão do MRC Milstein para A.I.L. (Ref: G0801738) (https://www.mrc.ac.uk/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

snoMEN (snoRNA modulador da expressão do gene) vectores proporcionam uma forma de tecnologia anti-sentido para modular a expressão de genes alvo com base em interacções de emparelhamento de bases complementares, de forma análoga aos familiares mais sistemas de vector siARN /shRNA [1]. A tecnologia de vector de snoMEN é criado através da manipulação da caixa humana C /D pequeno ARN nucleolar (snoRNA) HBII-180C. Esta classe de snoRNAs conter uma sequência interna (H quadro) que pode ser alterada para tornar complementar a alvos de ARN. snoRNAs são uma família de RNAs nucleares conservadas concentradas no nucléolo, onde eles ou função na modificação do RNA ribossomal (rRNA), ou participam no processamento de rRNA durante a síntese da subunidade do ribossoma [2-5]. Caixa de C /D snoRNAs têm o nome de um motivo comum de ARN nesta subfamília que serve como um local de ligação para um grupo de proteínas caixa de C /D, incluindo NOP56, NOP58, 15.5K e o fibrilarina proteína altamente conservadas, o que tem duas específica «actividade -O-metilase. A maioria dos snoRNAs são codificados dentro de sequências de intrões, localizado quer nos transcritos primários de genes codificadores de proteínas, ou em transcrições específicas que contenham matrizes em série de múltiplos snoRNAs. snoRNAs RNAs nucleares endógenos são altamente abundantes que são eficientemente processados ​​de transcritos primários. Assim, processamento e entrega de snoMEN ARN é igualmente eficiente e não propenso a saturação da máquina de processamento da célula hospedeira quando expressa a partir de snoMEN são vectores exógenos.

Em estudos anteriores foi demonstrado que os vectores de snoMEN pode reduzir os níveis de expressão de proteínas batendo-se a expressão de ARNm de pré-nuclear, permitindo que a orientação das sequências complementares dentro do intrão e /ou de não codificação 5 ‘e 3’ que flanqueiam sequências de ARNm dentro de precursores (pré-ARNm) [6]. Isto aumenta efectivamente o conjunto de sequências de ARN alvo que podem ser exploradas para conseguir efeitos inibidores específicos do gene. Em comum com snoRNAs endógenos, são eficientemente snoMEN ARN transcrito a partir de ARN-polimerase II promotores, em vez de a partir de ARN-polimerase III promotores utilizados para plasmídeos shRNA [7]. Como snoMEN RNAs são codificados dentro de intrões, é relativamente fácil para conceber vectores que podem expressar várias snoMEN dentro de diferentes intrões de um único transcrito, que também codifica uma proteína repórter. Isso facilita a criação de qualquer transientes ou estáveis, Gene knock-ins, conseguida utilizando um único transcrito, conduzido a partir de um único promotor. Esta abordagem utilizando vectores snoMEN foi assim utilizada para estabelecer ‘substituição proteína’ humano linhas celulares estáveis, onde a expressão de uma proteína-alvo é reduzida por snoMEN ARN e eficazmente substituído pela expressão de uma proteína recombinante codificada pelo mesmo transcrito usado para entregar o snoMEN [6].

Cancro e outras doenças proliferativas (como a doença auto-imune e inflamação) são frequentemente associadas a apoptose anormal, ou morte celular. Em células de cancro, por exemplo, os mecanismos são geralmente interrompido que induzem a morte celular programada, quer após o dano grave de ADN e /ou defeitos na progressão do ciclo celular normal, permitindo assim que as células cancerosas para evitar a apoptose. Uma abordagem potencial para a terapia do cancro é, portanto, para provocar a apoptose de encontrar uma maneira de ultrapassar os mecanismos que estão a bloquear as vias de sinalização endógenas que de outra forma conduzir à morte das células cancerosas. agora pensou-se que um dos mecanismos que contribuem permitindo que muitas formas de células cancerosas para suprimir a activação de percursos de morte celular é mediada por sobre-expressão de microRNAs específicos, tais como miR21 [8].

miR21 foi um dos primeiros miARNs detectada no genoma humano e exibe forte conservação evolutiva entre uma vasta gama de espécies de vertebrados, incluindo mamíferos, aves e peixes clados [9]. perfis de expressão de ARN, detectadas utilizando abordagens de alto rendimento transcriptoma de perfil, que comparam miARNs em tumores e outras linhas de células associadas com o cancro com as de células /tecidos normais, surpreendentemente sugerem que miR21 é sobre-expresso na maioria dos tipos de cancro analisadas [8 ]. Mais recentemente, estudos anti-sentido de segmentação miR21 maduros sugerido que o bloqueio da função miR21 pode induzir apoptose por activação da expressão da morte celular programada 4 proteína (PDCD4) em determinados tipos de células cancerosas, e.g. células HeLa e células MCF-7 [10, 11]. A inibição da miR21 foi relatado usando análogos oligonucleotídeo antisense sintética, complementares para miR21 [12, 13]. No entanto, enquanto miR21 knock-down via antisense modificado oligonucleotídeos foi relatado para deter a proliferação das células do tumor, tanto

in vitro

e

in vivo

, questões permanecem em usar essa abordagem para a terapia clínica, relativa à a baixa eficiência do sistema de distribuição e aos potenciais efeitos colaterais de oligonucleotídeos antisense que ainda têm de ser resolvidas. O uso de ARNsi /shRNA como um mecanismo alternativo para a segmentação inibição de pequenos RNAs tem sido sugerido como um agente terapêutico, mas também inclui riscos potenciais, tais como os efeitos fora do alvo e as turbulências do silenciamento complexo (RISC) na célula induzida por ARN [ ,,,0],14-17]. No entanto, vários estudos têm descrito a inibição da expressão de miR21 maduros usando siRNA /shRNA, especificamente afetam apenas a base 22 processados ​​miRNA mas não causando knock-down do transcrito primário miR21 [18].

Micro RNAs (miRNAs) compreendem uma família de RNAs curtos, reguladores, tipicamente 22 nucleótidos de comprimento, que pode pós-transcricional regular a expressão gênica

in vivo

. Nos mamíferos, miARNs têm sido relatados para regular a expressão de genes, principalmente por mecanismos que inibem a tradução de transcritos que codificam proteínas, provavelmente através de emparelhamento de bases com sequências alvo específicas em regiões não traduzidas do ARNm de 3 ‘(UTRs) [19]. Em alguns casos miARNs são transcritos como uma unidade de transcrição independente que não codificar para a proteína. No entanto, muitos miARNs estão localizados dentro das sequências de intrões de genes codificadores de proteínas. Estes miRNAs codificadas-íntron são, portanto, co-expressa com genes sua proteína de acolhimento de codificação [20-25]. miRNAs maduros são processados ​​a partir de longos transcritos pré-miRNA, que são geralmente ~ 70, estruturas hairpin nucleotídeos de comprimento. Estes pré-miARNs por sua vez, são processados ​​a partir dos transcritos do gene primárias originais, muitas vezes referida como pri-miARNs [26].

Neste estudo, que mostram que vectores snoMEN pode ser usado para knock-down por miR21 sequências de direccionamento específicos dentro de transcritos de pri-miARN, resultando na apoptose de linhas celulares de cancro humano. Nós investigar os fatores necessários para snoMEN inibição mediada de expressão miRNA e mostrar que snoMEN podem ser entregues em células de ambos os vectores de plasmídeo e lentivirais.

Resultados

snoMEN segmentação pri-miR21 induzir a apoptose em células transformadas

a nossa hipótese é a de que, se snoMEN podem ser direcionados para causar uma redução nos níveis de transcrito primário miR21 este pode induzir a apoptose em células tumorais, cuja sobrevivência é dependente de níveis elevados de expressão miR21. Por conseguinte, para testar se snoMEN pode ser usado para modificar a expressão de miR21, um vector de plasmídeo que expressa M snoRNAs-box modificada direccionada para endógena pri-miR21 foi construído (Fig 1A), com base no desenho snoMEN anterior [1]. Este vector snoMEN (mCherry-pri-miR21 snoMEN) codificado snoMEN três, os quais, cada um direccionado diferentes regiões da sequência pri-miR21. Estes três RNAs snoMEN são cada um codificado dentro de intrões separadas do mesmo RNA transcrito de pol II, que também codifica a proteína mCherry que actua como um marcador de proteína fluorescente (FP) em células transfectadas. Após transfecção do vector plasmídeo mCherry-pri-miR21 snoMEN em células HeLa, FISH (fluorescência

in situ

hibridação) experimentos, usando sondas específicas-snoMEN, mostrou um padrão de localização de estado estacionário para os RNAs snoMEN que era predominantemente nuclear, com acumulação no nucléolo (Figura 1B e outros dados não apresentados). Este padrão é consistente com estudos de expressão snoMEN anterior [1, 6].

(a) Estrutura para o alvo endógena miR21 transcrito primário (mCherry-pri-miR21 snoMEN) e diagrama esquemático da via de maturação miR21. Esta construção tem três snoMEN ARN (pentágonos azul), como descrito anteriormente [1], excepto que aqui as sequências de caixa M são complementares a sequências específicas dentro do transcrito primário miR21 endógena. (B) Validação de expressão snoMEN por fluorescência in situ A hibridação (FISH) análise. Cada RNA snoMEN foi detectada usando uma sonda de RNA específica caixa de M marcada com Cy3 (Cy3). ADN é corado por DAPI (DAPI). barra de escala é de 10 mm. (C) análise de RNA. O ARN total a partir de células HeLa foram colhidas 24 horas após a transfecção e qRT-PCR foi realizada para identificar moléculas precursoras miR21 utilizando iniciadores específicos miR21 precursoras (pré-miR21). Após a síntese de cDNA, qPCR foi realizada utilizando amadureceu primer específico miR21 e primer universal prestado pelos kit Perfecta SYBR Green qPCR (Quanta Biosciences, ver também métodos) (Amadurecido-miR21). U3 foi utilizado como um controlo de carga. Gráfico descreve média e desvio padrão de um mínimo de 5 experiências independentes. (D) As células HeLa transfectadas com pri-miR21-snoMEN /Controlo durante 24 horas antes da extracção do ARN total e análise de mancha de Northern.

Ao fim de 24 horas após a transfecção transitória do plasmídeo snoMEN mCherry-pri- miR21 em células HeLa, que miR21 altamente expresso [27], observamos ~ 65% e ~ 45% knock-down para a pré-miR21 e amadureceu miR21, respectivamente, em comparação com um snoMEN de controlo negativo (Control) do vetor, como julgado por ambos qRT-PCR (Figura 1C) e análise de transferência de Northern (Figura 1D). Além disso, as células transfectadas com o mCherry-pri-miR21 plasmídeo snoMEN mostrou níveis elevados de apoptose (Fig 2A seta). Em contraste, as células transfectadas com um plasmídeo snoMEN controle (controle), que não se destina a quaisquer genes endógenos, não mostraram sinais de apoptose (Fig 2A). Múltiplos marcadores de apoptose foram testados em cada caso, incluindo um ensaio de Anexina-V utilizando FACS (separação de células activada por fluorescência) (Fig 2B), uma análise de imunofluorescência de caspase-3 (Fig 2C), análise de transferência de Western para PARP1 clivado e caspase-3 (figura 2D). Todos estes ensaios mostraram a sobre-regulação de apoptose especificamente em células transfectadas com o plasmídeo mCherry-pri-miR21 snoMEN. No entanto, a co-transfecção dos plasmídeos miR21 shRNA-pLVX (que expressa pré-miR21) e mCherry-pri-miR21 snoMEN, resultou em pouca ou nenhuma citotoxicidade e apoptose, em comparação com a co-transfecção de células com mCherry-pri-miR21 snoMEN e o controlo negativo de EGFP-pLVX (expressando EGFP proteína sozinha) plasmídeos de expressão (Fig 3A e 3B). Estes resultados indicam que a apoptose causada pela depleção miR21 snoMEN mediada pode ser resgatado por miR21 exógenos mais de expressão.

(a) As micrografias que mostram exemplos de indução de apoptose em células HeLa transfectadas com pri-miR21-snoMEN. As imagens foram recolhidas 72 horas após a transfecção. As setas indicam as células que apresentam um fenótipo de apoptose. barra de escala é de 10 mm. (B) O gráfico mostra um curso de tempo das alterações na população de células positivas para a Anexina-V (marcador de apoptose) quer após a transfecção com pri-miR21-snoMEN (verde), ou de controlo (vermelho). O número de células foi contado utilizando FACS. sinal de anexina-V foi detectada usando Goiaba nexina Reagente (tecnologias de goiaba). (C) As imagens mostram padrão de localização de ADN (DAPI, azul), um marcador de transfecção FP-de qualquer das pri-miR21-snoMEN /Controlo (mCherry, vermelho) e um marcador de apoptose (caspase-3 clivada, verde). Pontas de setas mostram células positivas marcadoras apoptose. barra de escala é de 10 mm. (D) transferência de Western que mostra proteínas fabricante em células HeLa transfectadas com pri-miR21-snoMEN /Controlo durante 24 horas antes da extracção de proteína. Os lisados ​​celulares totais foram analisados ​​utilizando os anticorpos indicados.

(a) As micrografias que mostram experimento salvamento de indução de apoptose por co-transfecção com pri-miR21-snoMEN (mCherry) e plasmídeo de expressão de pré-miR21 (GFP miR21 +) /plasmídeo de controlo que expressa a proteína GFP sozinho (GFP). As imagens foram tiradas 72 horas seguido após a transfecção. barra de escala é de 10 mm. (B) análise de RNA. O ARN total a partir de células HeLa foram colhidas 24 horas após a co-transfecção com pri-miR21-snoMEN (mCherry) e pré-miR21 plasmídeo de expressão (miR21) /plasmídeo de controlo que expressam a proteína GFP sozinho (GFP) e qRT-PCR foi realizada para identificar miR21 moléculas precursoras usando miR21 precursor primers específicos (pré-miR21, vermelho). Após a síntese de cDNA, qPCR foi realizada utilizando amadureceu primer específico miR21 e primer universal fornecido pelo kit Perfecta SYBR Green qPCR (Quanta Biosciences, ver também métodos) (Amadurecido-miR21, verde). SnoRNA U3 foi utilizada como um controlo. Gráfico descreve média e desvio padrão de um mínimo de 3 experiências independentes. (C) micrografias mostram a prevenção da indução não-apoptose por transfecção com pri-miR21-snoMEN Mut, que tem 3 desemparelhamentos de bases em cada sequência complementar caixa de M a pri-miR21. As imagens foram tiradas 72 horas seguido após a transfecção. barra de escala é de 10 mm. (D) análise de RNA. O ARN total a partir de células HeLa foram colhidas 24 horas após a transfecção com um ou-miR21-snoMEN pri Mut ou de controlo. Após a síntese de cDNA, qPCR foi realizada utilizando amadureceu primer específico miR21 e primer universal fornecido pelo kit Perfecta SYBR Green qPCR (Quanta Biosciences, ver também métodos). SnoRNA U3 foi utilizada como um controlo. Gráfico mostra média e desvio padrão de um mínimo de 4 experiências independentes.

Para investigar a relação entre a sequência na região de caixa de M do snoMEN eo miR21-pri sequência alvo, uma versão mutante mCherry-pri-miR21 plasmídeo snoMEN (pri-miR21 snoMEN mut), que incluiu três descasamentos de a sequência complementar pri-miR21, foi feito e testado para medir ambos os níveis de knock-down e qualquer fenótipo apoptose potencial (Fig 3C e 3D). Os resultados mostram que os 3 mutações desemparelhamento de bases na caixa H eliminar eficazmente tanto o fenótipo apoptose e actividade knock-down, comparável com o vector de controlo negativo snoMEN (Figura 3C e 3D). Concluímos que miR21 knock-down e o fenótipo apoptose resultando visto com o vector mCherry-pri-miR21 snoMEN é dependente de complementaridade de sequência entre a região da caixa de M ea região de destino da pri-miR21.

Nós também construído e testado outro vetor snoMEN, mCherry pré-miR21 snoMEN, que tem como alvo sequências precursoras miR21 (Fig a em arquivo S1). transfecção transiente do mCherry-pré-miR21 snoMEN plasmídeo em células HeLa resultou em miR21 knock-down e indução da apoptose, semelhante aos resultados obtidos com o plasmídeo acima mCherry-pri-miR21 snoMEN. Os resultados para mCherry-pré-miR21 snoMEN e mCherry-pri miR21 plasmídeos snoMEN foram semelhantes no que diz respeito à análise de FISH, o ensaio de Anexina-V utilizando FACS e níveis de knock-down miR21, tal como analisado por qRT-PCR, (figuras BD em ficheiro S1). Estes resultados indicam que os vectores snoMEN pode realmente alvo de miRNA transcritos primários, o que proporciona mais flexibilidade na concepção de vectores knock-down de visar apenas a curto (~ 22 bases), sequências de miRNA maduras.

Em seguida, testaram se vectores snoMEN poderiam ser utilizados para direccionar outras miARNs, distinta da miR21. Assim, os vectores snoMEN foram projetados para atingir quatro anteriormente bem caracterizados miRNA transcritos primários [27-30], ou seja, pri-miR31, pri-let-7 g, a sua actividade knock-down pri-miR132 e pri-miR210 e medidos utilizando qRT -PCR após transfecção transiente em células HeLa (Fig 4A). Isto mostrou específico e reprodutível knock-down para todos os quatro miARNs segmentados, em comparação com os snoMEN de controlo negativo, tal como avaliado por qRT-PCR. Além disso, para cada um dos miARNs específicas neste estudo investigou-se a especificidade de miARN knock-down pelos vectores snoMEN. Para fazer isso usamos qRT-PCR para medir e comparar os níveis do respectivo alvo e não-alvo micro RNAs após expressão de qualquer um miRNA alvo snoMEN RNA, ou o controlo negativo snoMEN RNA (Fig 4B). Este mostrou, por exemplo, que a expressão da mCherry-pri-miR21 snoMEN causou uma redução específica em níveis miR21 com efeitos fora do alvo pouco ou nenhum sobre os níveis dos outros quatro micro RNAs testadas. Resultados semelhantes foram obtidos para cada um dos vetores snoMEN direcionados para os outros quatro miRNAs testados anteriormente, ou seja, pri-miR31, pri-let-7 g, pri-miR132 e pri-miR210.

vetores (a) snoMEN alvo para miARNs adicionais. O ARN total a partir de células HeLa foram colhidas 24 horas após a transfecção e seguindo a síntese de cDNA, qPCR foi realizado utilizando miARNs maturados alvo iniciadores específicos, isto é, miR31, deixou-7g, miR132, miR210, e iniciador universal fornecido pelo kit de Perfecta SYBR Green qPCR (Quanta Biosciences, ver também métodos) (amadurecido-miRNA, verde). SnoRNA U3 foi utilizada como um controlo. Gráfico descreve média e desvio padrão de um mínimo de 3 experiências independentes. (B) Análise de especificidade de direcionamento de miRNA knock-down usando vetores snoMEN. qPCR foi realizada durante 5 miRNAs diferentes (miR21, miR-31, deixe-7g, miR132, miR-210) para verificar possíveis efeitos pontuais alvo de vetores snoMEN segmentação pri-miRNAs, ou seja, pri-miR21 snoMEN, pri-miR31 snoMEN, pri -let-7g snoMEN, pri-miR132 snoMEN, pri-miR210 snoMEN. O gráfico mostra rácio médio do sinal para três experimentos independentes comparando snoMEN específicos orientados com controle snoMEN transfecção (Control, vermelho). Cada sinal foi normalizado por comparação com o nível U3 snoRNA.

A expressão de snoMEN a partir de um vector lentiviral

Para melhorar a flexibilidade de entregar snoMEN em células, em particular, com o objetivo de melhorar a prestação de snoMEN em linhas de células que apresentam baixas eficiências de transfecção para vectores plasmídicos, procurou-se construir vectores lentivirais que expressam pode snoMEN (Figura 5A). A maioria das células de mamíferos são susceptíveis à infecção por lentivírus, incluindo tanto divisória e células que não se dividem, células estaminais, células primárias e [31]. Nós comparamos a expressão lentiviral de pri-miR21 snoMEN tanto em células primárias, ou câncer, derivadas de tecidos humanos. Dois vectores snoMEN lentivirais separadas foram construídos, isto é, lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN e lenti-mCherry-pré-miR21 snoMEN, que têm como alvo diferentes regiões do transcrito primário miR21 (Fig 5A e também ver Fig A no ficheiro S1). Ambos pri-miR21 snoMEN pré-miR21 snoMEN também codificam ADNc mCherry como um marcador de expressão para células transfectadas. Tal como mostrado por análise de FISH, cada um dos lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, lenti-mCherry-pré-miR21 snoMEN e controlo negativo lenti-mCherry-Control snoMEN (EGFP-alvo), expressar ARN snoMEN que se acumulam nos nucléolos, semelhante à os resultados obtidos quando snoMEN RNAs são expressos a partir de vectores plasmídicos transfectadas (Fig e em ficheiro S1 e Fig 1B) [1]. A expressão de ARN snoMEN a partir dos vectores virais também foi confirmada por análise de transferência de Northern (dados não apresentados).

(a) a estrutura de codificação de vector lentiviral snoMEN orientadas para o transcrito primário miR21 endógena (Lenti-mCherry-pri -miR21 snoMEN). Esta construção tem três snoMEN ARN (pentágonos azuis) e um ADNc de FP-mCherry marcador tal como descrito na Figura 1A, excepto que a inserção foi sub-clonado num vector que produziria a partícula lentivírus (pLVX-Puro, Clontech). (B) micrografias mostram indução de apoptose por transdução com qualquer Lenti-mCherry-pri-miR21-snoMEN, ou partículas de vírus Lenti-mCherry-Control-snoMEN. As imagens foram recolhidas 72 horas após a transdução. barra de escala é de 10 mm. (C) Total RNA do ensino primário de pulmão humano (ATCC-CCL-75) e câncer de pulmão (ATCC-CRL-5868) foi colhida 24 horas após a transdução. Após a síntese de cDNA, qPCR foi realizada utilizando tanto um primer específico miR21 amadurecido e um primer universal fornecido pelo kit Perfecta SYBR Green qPCR (Quanta Biosciences, ver também métodos). GAPDH foi usada como um controlo. Gráfico descreve média e desvio padrão a partir de um mínimo de 4 experiências independentes. (D) Gráfico mostra um curso de tempo de mudanças na população de células positivas anexina-V transduzidas com qualquer lenti-pri-miR21-snoMEN (Verde), lenti-pre-miR21-snoMEN (azul) ou Control (vermelho). O número de células foi contado utilizando FACS. O sinal de anexina-V foi detectada usando Goiaba nexina Reagente (tecnologias de goiaba).

Em seguida, vírus lenti-mCherry-pri-miR21 foram transduzidas quer em WI-38 (ATCC-CCL-75) humana células de pulmão de fibroblastos (isolado a partir de um feto com 3 meses de gestação), que expressam níveis baixos de miR21, ou em células de adenocarcinoma de pulmão humanos, estabelecidas a partir de um paciente humano (55 anos de idade, fase 2), que altamente expressa miR21 (Fig F em S1 Arquivo). Este nível de expressão miR21 não se alterou após a transdução de um vetor lenti-mCherry-Control snoMEN (Fig F no arquivo S1). Estas células são difíceis de transfectar com plasmídeos de ADN, utilizando reagentes de transfecção gerais. Mais de 90% de ambas as células de cancro primário e mostrou expressão mCherry 24 horas após a transdução lentivírus. As células primárias transduzidas por qualquer pri-miR21 snoMEN, ou pré-miR21 snoMEN, continuou crescendo e continuou a expressar mCherry (Fig 5B e Fig G painéis esquerdos em Arquivo S1). No entanto, as células de adenocarcinoma de pulmão lentivírus transduzidas mostrou uma forte fenótipo citotóxico no prazo de 3 dias de transdução (Fig 5B painel do meio e Fig G painéis direito no arquivo S1). Enquanto se observou esse fenótipo citotóxico específico de células de câncer seguinte transdução quer com o lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, ou o vetor lenti-mCherry pré-miR21 snoMEN, transdução com o vector lentiviral de controlo negativo expressar snoMEN segmentação EGFP (lenti-mCherry -control snoMEN;. nenhum alvo endógena), não mostrou um fenótipo citotóxico tanto no primário, ou células de adenocarcinoma de pulmão (Fig 5B painel direito)

Transdução de qualquer lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, ou lenti-mCherry-pré-miR21 snoMEN, em células de adenocarcinoma de pulmão, que altamente expressa miR21, resultou, em cada caso, em ~ 25% de redução nos níveis de ARN maduro miR21, em comparação com as células transduzidas com o controlo negativo, lenti-mCherry- snoMEN vector de controlo, tal como avaliado por qRT-PCR (Fig 5C e a Fig H em ficheiro S1). Além disso, o ensaio de Anexina-V, usando FACS, mostrou-regulação de Anexina-V nas células de adenocarcinoma de pulmão após transdução com qualquer lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, ou lenti-mCherry-pré-miR21 snoMEN, mas não depois transdução com a lentiviral vector de controlo negativo snoMEN (Figura 5D).

Concluímos que os vectores lentivirais capazes de expressar snoMEN RNAs pode ser transduzido para as células de mamífero com alta eficiência. Entrega de snoMEN alvo a sequências correspondentes em pri-miR21 induz a apoptose em células de adenocarcinoma do pulmão humano, mas não em células primárias de pulmão humano não transformadas.

Comparação de ARNsi /shRNA e snoMEN pri-miARN interferência

Tendo mostrado acima que M snoRNAs modificada-box podem reduzir a expressão de miARN endógeno em células humanas, quando apontado a uma sequência dentro do transcrito primário de um miARN que não está presente no miARN maduro, que ao lado em relação a capacidade de oligorribonucleótidos de siRNA para knock-down expressão de miR21 quando dirigidas contra as mesmas sequências transcrito primário (Fig 6a). Para executar essas comparações, três oligorribonucleótidos de ARNip complementares para as mesmas sequências de transcrito primário em miR21 pri-miARN como alvo pelos M snoRNAs modificada-box em mCherry-pri-miR-21 snoMEN, foram transfectados em células HeLa (Fig 6A e Fig Eu no Arquivo S1). Todos os três pri-miRNA siRNAs (si21M1-3), mostrou pouca ou nenhuma knock-down de qualquer dos níveis pré-miR21 madura-miR21 ou, como fez um controle ainda mais negativo siRNA (Scramble), conforme avaliado por qRT-PCR (Fig 6B painel esquerdo) e por Northern blot (Fig 6B painel da direita). Como um controlo positivo, um outro alvo ARNsi com a sequência madura miR21 (SI21), resultou em ~ 25% do knock-down, especificamente para miR21 maduros mas não por pré-miR21, consistente com relatos anteriores [12, 13]. Além disso, as mesmas análises foram realizadas utilizando a tecnologia também shRNA (Figura 6A e 6C e a Figura I, no ficheiro S1). Assim, três shRNA plasmídeos de expressão por gene, complementares às mesmas sequências transcrito primário em miR21 como alvo das M snoRNAs modificada-box em mCherry-pri-miR21 snoMEN, foram transfectados em células HeLa (Fig 6A e Fig I em Arquivo S1) . Todos os três pri-miR21 alvo shRNAs (sh21M1-3), mais uma vez mostrou pouca ou nenhuma knock-down dos níveis de ambos os madura-miR21, ou pré-miR21, assim como um controlo negativo shRNA mais, tal como avaliado por qRT-PCR ( Fig 6C painel esquerdo) e por Northern blot (Fig 6C painel da direita). Em contraste, um plasmídeo shRNA controle positivo expressar uma shRNA direcionados para a sequência miR21 maduro (sh21), resultou em ~ 70% knock-down de madura miR21.

(a) As regiões no pri miR21-RNA alvo pelo vector snoMEN usadas neste estudo são mostradas num diagrama esquemático (SH /si21M1-M3). As mesmas sequências pri-miR21 como alvo do vector snoMEN foram alvo de oligoribonucleótidos siRNA e plasmídeos de expressão shRNA. (B) O gráfico mostra o resultado de qRT-PCR /qPCR. O ARN total a partir de células HeLa foram colhidas 24 horas após a transfecção e qRT-PCR foi realizada para identificar moléculas precursoras miR21 miR21 utilizando iniciadores específicos de precursor (pré-miR21, vermelho). Após a síntese de cDNA, qPCR foi realizada utilizando amadureceu primer específico miR21 e primer universal fornecido pelo kit Perfecta SYBR Green qPCR (Quanta Biosciences, ver também métodos) (Amadurecido-miR21, verde). U3 foi utilizada como um controlo. Gráfico descreve média e desvio padrão a partir de um mínimo de 4 experiências independentes. O painel da direita mostra o resultado da análise de mancha de Northern para experiências de ARNip. Detecção de níveis miR21 RNA endógenos após a transfecção de células HeLa usando tanto o controle siRNA (Scramble: lane1), miR21 siRNA (SI21: lane2), miR21 M caixa de siRNA-1 (si21M1: lane3), miR21 M caixa de siRNA-2 (si21M2: Lane4), miR21 caixa de M siRNA-3 (si21M3: lane5). Uma quantidade equivalente de ARN total de HeLa foi carregado para cada pista e o ARN separadas por PAGE, electrotransferidos para uma membrana e sondados com uma sonda de ambos miR21 e com uma amostra ARNt, como um controlo de carga. (C) A mesma série de experiências com ARNsi de transfecção, conforme descrito na figura 6b, excepto plasmídeos de expressão shRNA foram transfectadas em vez de ARNsi.

Conclui-se que os vectores de snoMEN pode causar uma redução na expressão de miRNAs específicos por alvo sequências de RNA precursoras nucleares que não parecem ser passíveis de knock-down por qualquer oligoribonucleótidos siRNA, ou vetores shRNA. Em contraste, RNAs citoplasmáticos, incluindo miRNAs maduros, pode ser knocked-down por vetores shRNA que têm como alvo as mesmas sequências utilizadas nos vectores snoMEN.

Mecanismo de snoMEN interferência de RNA

Temos demonstrado anteriormente que o mecanismo pelo qual snoMEN pode modular o nível de expressão de um ARNm alvo requer Argonaute-2 (ago2), que é por sua vez envolvido na via de RNAi principal [32]. O mecanismo snoMEN também pode envolver-se-frameshift-1 (Upf1), que se pensa ser essencial para o decaimento mediado por mutações nonsense (NMD) via [6, 33-35]. No entanto, não era claro se a modulação mediada por snoMEN do nível de uma proteína não-alvo que codifica o RNA, incluindo pri-miARNs expressão, envolveria exactamente o mesmo mecanismo. Por isso, nós examinamos se a depleção de várias proteínas, incluindo ago2 RNAi-mediada, pode afectar a capacidade dos vectores snoMEN para alterar a expressão de miARN (Fig 7). Os resultados mostram que o knock-down snoMEN-dependente dos níveis de pri-miR21 foi impedido especificamente em células desprovidas de ago2 por tratamento de siARN, como comparado com as células tratadas com um siRNA de controlo negativo mexidos (Figura 7A e 7B). controlos adicionais mostraram que o nível de expressão de ARN snoMEN não foi afectada por transfecções siRNA (Fig J no ficheiro S1). Isto implica que pode estar envolvido ago2, quer directamente ou indirectamente, no mecanismo de supressão snoMEN-mediada de miARN níveis de transcrição primário. No entanto, encontramos aqui que nem o esgotamento mediada por siRNA de Upf1, que foi mostrado anteriormente para afetar a capacidade de snoMEN para knock-down RNAs codificadores de proteínas [6], nem de ago1, que, como ago2 [32], pode associar com snoRNAs, impediu a inibição da expressão miR21 por snoMEN.