Abstract

Gene

MAGEA1

pertence a um grupo de genes específicos de linhas germinativas humanas que dependem de metilação do DNA para fins de repressão em tecidos somáticos. Muitos destes genes, denominados genes de linha germinal-cancro (CG), tornam-se activadas e desmetilado em uma ampla variedade de tumores, onde eles codificam antigénios específicos de tumores. O processo conducente à desmetilação de ADN de genes em tumores CG permanece incerto. Os dados anteriores sugeriram que a acetilação de histona pode ser envolvido. Aqui, nós investigamos a contribuição relativa de metilação do DNA e acetilação das histonas na regulação epigenética do gene

MAGEA1

. Mostramos que

MAGEA1

hipometilação do DNA na expressão de células de melanoma é de fato correlacionados com aumentos locais de acetilação das histonas H3 (H3ac). No entanto, quando

MAGEA1

-negativas células foram expostas a um inibidor de histona desacetilase (TSA), que observada apenas a activação de curto prazo do gene e detectado nenhum desmetilação do seu promotor. Como um ensaio mais sensível, foi utilizado um clone de células albergando um metilado

MAGEA1 /HPH

construir, que confere resistência à higromicina após re-activação estável. TSA induziu apenas transitória de-repressão do transgene, e não conduziu ao surgimento de células resistentes a higromicina. Em flagrante contraste, a depleção transitória de ADN-metiltransferase-1 em células do clone repórter deu origem a uma população de resistência à higromicina, em que o re-activada

MAGEA1 /HPH

transgene demonstraram não somente marcado hipometilação de DNA, mas também inversão significativa das marcas de histonas, incluindo ganhos de H3ac e H3K4me2 e perdas de H3K9me2. Coletivamente, nossos resultados indicam que a metilação do DNA tem um papel dominante na hierarquia epigenética rege

MAGEA1

expressão

Citation:. Cannuyer J, Loriot A, Parvizi GK, De Smet C (2013) epigenética hierarquia dentro da

MAGEA1

Cancer Gene-da linhagem germinativa: Promotor DNA metilação Dita local histona Modificações. PLoS ONE 8 (3): e58743. doi: 10.1371 /journal.pone.0058743

editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, China

Recebido: 30 de novembro de 2012; Aceito: 05 de fevereiro de 2013; Publicação: 05 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cannuyer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. JC é o beneficiário de uma doação FSR-FNRS-Télévie (https://www2.frs-fnrs.be/). GKP recebeu uma bolsa da FSR-FNRS-FRIA (https://www2.frs-fnrs.be/). Este trabalho foi apoiado por uma bolsa FRSM do FSR-FNRS (ref. 3.4563.11, https://www2.frs-fnrs.be/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a metilação do DNA, que ocorrem principalmente no dinucleótidos CpG, é um mecanismo potente de repressão de genes em células [1] de mamíferos. padrões específicos de tecido de metilação de CpG, os quais são estabelecidos durante o desenvolvimento do embrião, são geralmente bem preservada em células de adultos, mas tornam-se profundamente alterado de células cancerosas [2]. Ambos os ganhos (hipermetilação) e as perdas (hipometilação) de metilação de ADN pode ser detectado dentro da mesma célula do tumor. hipermetilação aberrante em cancro muitas vezes afecta o promotor de genes supressores de tumores, e, portanto, tem sido associada com a perda das funções supressoras de tumor [3]. A hipometilação de DNA, por outro lado, tem sido detectada em uma variedade de sequências dentro do genoma do cancro, incluindo sequências repetitivas [4], e foi mostrado para contribuir para o aumento da instabilidade genómica [5]. Surpreendentemente, a hipometilação do ADN em tumores tem sido associada com a activação da transcrição de apenas um número limitado de genes, a maioria das quais têm o seu local normal da expressão restrita à linha germinal [6]. (CG) genes esse grupo particular de genes foi denominado câncer germinal [7]. Em humanos, os genes CG compreendem cerca de 50 genes ou famílias de genes que exercem uma variedade de funções celulares [8]. A ativação desses genes tem sido relatada em uma ampla gama de tipos de tumor, incluindo câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, e melanoma. Uma consequência importante da activação de genes em tumores CG é a produção de antigénios específicos de tumores, que podem ser reconhecidas por linfócitos T citolíticos [9]. Os ensaios clínicos de vacinação anti-cancro dirigidas contra tais antigénios estão em curso [10]. É concebível, a compreensão dos mecanismos que contribuem para a regulação do gene CG pode facilitar o desenvolvimento de estratégias de gene-indução, o que tornaria as células tumorais mais vulneráveis ​​à imunoterapia.

O processo conducente à hipometilação do ADN e subsequente activação de genes em tumores CG Ainda não está claro [11]. Uma possibilidade é que desmetilação DNA em genes CG é uma consequência de alterações no nível de proteínas histonas, os componentes do núcleo de cromatina. resíduos específicos dentro de caudas de histona submetidos a uma variedade de modificações químicas, incluindo acetilação e metilação, que têm um impacto sobre a estrutura da cromatina e a transcrição [12]. Várias modificações das histonas também aparecem para regular os estados de metilação do DNA [13]. marcas histonas repressivas, como a metilação da histona H3 lisina 9 ou 27 (H3K9 ou H3K27), foram mostrados para ditar deposição de metilação do DNA em loci específicos, favorecendo recrutamento local de metiltransferases de ADN [14], [15]. Por outro lado, activando modificações de histonas, tais como a metilação ou acetilação de histona de histona H3 lisina 4 (H3K4) parece excluir a maquinaria de metilação de ADN [16], [17]. Portanto, era tentador propor que desmetilação DNA em genes CG pode ser uma consequência de alterações no nível de modificações das histonas.

Estudos anteriores revelaram que os promotores de genes de CG são frequentemente associados com H3K9 e H3K27 metilação em não- expressando células. Estas modificações repressores são geralmente perdem-se durante a activação de genes GC em células tumorais, e substituído por marcas histona activas, tais como a acetilação de histona e H3K4 metilação [18], [19]. A questão crucial é se as mudanças no nível de modificações de histonas são uma causa ou uma consequência da CG desmetilação DNA promotor do gene nas células tumorais. Estudos utilizando inibidores de H3K9 e H3K27 metiltransferases mostrou que estes eram por conta própria incapaz de induzir desmetilação DNA significativa e ativação de genes CG [18], [19]. Resultados semelhantes foram obtidos após a inibição da demethylases H3K4 [19]. Em contraste, vários estudos mostraram que a expressão do gene de CG pode ser induzida em células tratadas com um inibidor de histona-desacetilases [20] – [22]. Em um relatório [20], mas não nos outros, o tratamento foi mostrado para induzir a desmetilação de ADN de um promotor do gene da GC. Estas observações levantadas, portanto, a possibilidade de que ganha em acetilação das histonas pode ser um gatilho suficiente para induzir desmetilação DNA e ativação de genes CG em células tumorais.

No presente estudo, avaliou-se o potencial de acetilação das histonas para induzir DNA desmetilação e a activação do gene da

MAGEA1

, um membro bem caracterizado do grupo CG de genes. Esta foi avaliada por testar o efeito de tricostatina A (TSA), um inibidor da desacetilase de histona, em células que não expressam melanoma e em um clone de células albergando um metilado

MAGEA1 /HPH

construção, o que permite a selecção (resistência à higromicina ) de células em que a activação do transgene ocorreram. Além disso, este sistema de células repórter sensível foi utilizado numa experiência inversa, em que foi avaliada a capacidade de um inibidor de metilação de ADN para induzir alterações de marcas de histona no interior da

MAGEA1

promotor.

resultados

mudanças histona associadas a

MAGEA1

ativação em linhas de células de melanoma

a fim de identificar mudanças de modificação das histonas associadas a

MAGEA1

activação, realizamos cromatina imunoprecipitação (chip) em experimentos não expressar e expressar linhas celulares. As experiências foram realizadas em fibroblastos de prepúcio humano imortalizada (HFF2-hTERT) e duas linhas de células de melanoma que não expressam

MAGEA1

(SK-MEL-23 e MEL-EB16), bem como em três linhas de células de melanoma que expressam

MAGEA1

(MZ2-MEL3.1, BB74-MEL e Mi13443-MEL). Como esperado, a avaliação de

MAGEA1

níveis de metilação do DNA promotor por PCR quantitativo MS-nestas linhas celulares, demonstraram níveis elevados de metilação na metilação que não expressam as células, e baixa em células que expressam (Fig. 1A). experimentos Chip, examinando o

MAGEA1

5′-região, revelou enriquecimento preferencial de H3K9 dimetilado (H3K9me2) em

MAGEA1

-negative contra

MAGEA1

linhas celulares -positivas (Fig . 1B). Em contraste impressionante, a acetilação de histona H3 (H3ac) e dimetilação de H3K4 (H3K4me2) dentro do

MAGEA1

5′-região mostraram um aumento acentuado nas três linhas celulares que expressam, em comparação com as células não expressando (Fig. 1B). enriquecimento significativo de H3K27 trimetilada (H3K27me3) dentro do

MAGEA1

foi observada em células HFF2 hTERT-5′-região, mas não em qualquer uma das outras linhas celulares. Em conjunto, os nossos resultados sugerem que a desmetilação de ADN e activação de

MAGEA1

em células de melanoma está associada com a perda de H3K9me2, e ganhos de H3ac e H3K4me2 dentro do 5′-região do gene. Isto foi consistente com um papel potencial da acetilação das histonas na ativação epigenética de

MAGEA1

nas células tumorais.

A

,

MAGEA1

níveis de expressão de mRNA (painel superior) e os níveis de metilação de ADN 5′-região (painel inferior) foram avaliadas em três linhas de células que expressam (não HFF2-hTERT, SK-MEL-23 e EB16-MEL), bem como em três linhas de células que expressam (MZ2 -MEL3.1, BB74-MEL e Mi13443-MEL). Os valores representam a média (± SEM) de duas experiências qRT-PCR ou PCR-qMS independentes, cada um em duplicado.

B

, PCR ChIP-quantitativa foi aplicado às mesmas linhas celulares para avaliar o enriquecimento das modificações das histonas indicados dentro ou o

MAGEA1

5′-região ou o

GAPDH

promotor (representando um promotor activo ubiquamente). Os dados derivam de pelo menos duas experiências Independent Chip, com duas medidas qPCR duplicados em cada caso.

TSA induz a ativação transiente de

MAGEA1

em células de melanoma

para avaliar a contribuição de acetilação das histonas na regulação epigenética da

MAGEA1

, expusemos linhas celulares SK-MEL-23 e EB16-MEL para a histona deacetilase (HDAC) inibidor da TSA, e examinou seu efeito sobre o os níveis de transcrição e de metilação de ADN do gene. Em SK-MEL-23 células, a exposição a TSA foi associado com um aumento de 3,3 vezes na

MAGEA1

nível de mRNA, quando avaliados um dia após o tratamento. No entanto, este efeito foi perdido nos dias 4 e 7 após o tratamento (Fig. 2A). Em EB16-MEL, não fomos capazes de detectar qualquer activação significativa de

MAGEA1

após TSA (Fig. 2A), que era consistente com os dados anteriores mostrando que o efeito da TSA em

MAGEA1

activação é dependente de células do tipo [22]. Para comparação, ambas as linhas celulares foram tratadas com o inibidor de ADN metilação 5-aza-2′-desoxicitidina (5-azadC). Uma vez que esta droga induz desmetilação de ADN dependente de replicação, o tratamento foi mantido durante quatro dias antes da análise. Quantitativas experiências de RT-PCR revelou que 5-azadC (1 uM) induziu significativa

MAGEA1

expressão em ambas as linhas celulares. Em SK-MEL-23 das células, o nível de

MAGEA1

ARNm observados após 4 dias de tratamento com 5-azadC foi 135 vezes mais elevada do que a observada após um dia de tratamento TSA. Além disso, em ambas as linhas de células, a activação induzida por 5-azadC de

MAGEA1

foi ainda detectada nos dias 3 e 6 após a remoção da droga (Fig. 2B).

SK-MEL linhas celulares de -23 e EB16-MEL foram expostas a 300 nM TSA durante 24 h (

Um

), ou 1? M de 5-azadC durante 96h (

B

), e o ARN foi extraído a partir de as células nos dias 1, 4 e 7 após o tratamento TSA ou nos dias 4, 7, 10, após 5-azadC tratamento.

MAGEA1

níveis de expressão foram determinados por RT-PCR quantitativo. Valores, que derivam de três experimentos independentes, foram normalizadas pelo

ACTINB

nível de expressão, e são expressas em relação aos níveis encontrados em células não tratadas (Ctrl). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001.

C

, o efeito de TSA e 5-azadC em

MAGEA1

5′-região desmetilação de ADN foi avaliada pela aplicação de MS-PCR para amostras de ADN extraído de 10 dias após o início dos tratamentos. Os dados (a dobra desmetilação) corresponder à quantidade relativa de sequências não metiladas nas células tratadas relatados para que em células não tratadas (Ctrl). Os valores representam a média (± SEM) de três experiências independentes qMS-PCR. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01

De acordo com os nossos estudos de expressão, quantitativos resultados MS-PCR revelou que TSA não induziu diminuição significativa na

MAGEA1

nível de metilação do promotor, em qualquer SK-MEL-23, ou linhas celulares EB16-MEL (Fig. 2C). desmetilação significativa do

MAGEA1

promotor foi em vez observada em ambas as linhas celulares após tratamento com 5-azadC (Fig. 2C).

No seu conjunto, estes resultados sugerem que, enquanto TSA pode induzir transiente de-repressão de

MAGEA1

em inicialmente não expressando células, não levar a desmetilação de ADN e de longo prazo de ativação da transcrição do gene.

modificações de histonas associadas a um

in vitro

metilado

MAGEA1

transgene

a nossa incapacidade de detectar desmetilação e de longo prazo de ativação induzida por TSA de gene

MAGEA1

, como relatado aqui acima, pode ser devido a limitações experimentais . É possível, de facto, que o impacto epigenética de TSA ao

MAGEA1

ocorreu em apenas uma pequena proporção das células, o que torna muito difícil de detectar alterações significativas activação de genes e metilação do DNA na população de células tratadas. Além disso, a ativação epigenética evidente de

MAGEA1

pela TSA pode exigir a presença de fatores de transcrição apropriados, que não pode estar presente na SK-MEL-23 ou células EB16-MEL linhas. Mostrámos, de facto, que a activação de longo prazo de

MAGEA1

requer não só um processo de desmetilação de ADN, mas também a presença de activadores de transcrição para impedir remetilação subsequente do promotor [23].

Estamos, portanto, decidiu voltar a avaliar o efeito da TSA em um sistema de células previamente estabelecido (MZ2-MEL.TrHM) contendo um selecionável

MAGEA1

construir [24]. células MZ2-MEL.TrHM contêm um transgene (

MAGEA1 /HPH

) que compreende uma grande porção do MAGEA1

locus de (incluindo a região do promotor), seguida pela sequência que codifica a resistência à higromicina (

HPH

; A Fig. 3A). O transgene foi metilado

in vitro

antes de transfecção, e continua a ser metilado e silenciosa em células MZ2-MEL.TrHM, que são, portanto, sensíveis à higromicina. No entanto, mostramos que clones de células resistentes a higromicina (higro

r) emergem quando o

MAGEA1 /HPH

transgene é ativada de forma estável, por exemplo após o tratamento transitório com 5-azadC [24]. Importante, as células MZ2-MEL.TrHM foram derivados a partir de uma

MAGEA1

-expressing linha celular de melanoma. Estas células contêm, portanto, todos os factores de transcrição necessários para assegurar a activação de longo prazo do promotor do gene, tal como evidenciado pela presença de um activa e não metilado endógena

MAGEA1

gene.

A

, representação esquemática do status de estrutura e de metilação do DNA dos não metilados (círculos vazios) ativas

gene MAGEA1

e os inativos metilados (círculos cheios)

MAGEA1 /HPH

transgene em MZ2-MEL células .TrHM. caixas negras correspondem aos

MAGEA1

exons, a caixa cinza escuro dentro do

MAGEA1 /HPH

transgene representa o

unidade de HPH

transcrição, e o asterisco (*) é o local onde foi inserida uma sequência tag de 12 bp (carregando um

Xba

sítio de restrição I). O painel inferior é uma ampliação do fragmento amplificado que foi amplificado em experiências de chip, e indica os tamanhos esperados dos fragmentos seguinte

Xba I

digestão.

B

, experimentos fichas era aplicado a MZ2-MEL.TrHM. A resultante

MAGEA1

amplicons foram digeridos com

Xba

I e separados em gel de agarose, revelando assim o enriquecimento relativo das histonas modificações indicadas dentro ou o

MAGEA1

gene (banda superior ) ou o

MAGEA1 /HPH

transgene (banda inferior).

C

, enriquecimento relativo das marcas histonas no transgene foi deduzida pela quantificação intensidades de banda no gel de eletroforese imagens (software ImageJ) e cálculo do rácio inferior /superior. Os dados, que foram normalizadas pela razão inferior /superior em amostras de entrada, derivam de pelo menos duas experiências independentes ChIP, com duas análises de PCR /Xbal /electroforese em cada caso. *

P Art 0,05, ***

P

. 0,001

Em primeiro lugar, conduziu experimentos chip para identificar modificações de histonas associadas ao silêncio

MAGEA1 /HPH

transgene em células MZ2-MEL.TrHM. A presença de uma sequência tag no

MAGEA1 /HPH

transgene, inserido na posição 158 em relação ao local de início da transcrição e contendo um

Xba

-I sítio de restrição, permitiu-nos distinguir

MAGEA1

amplicões originários de ambos o transgene exógena ou endógena do gene. Assim, MZ2-MEL.TrHM derivados de cromatina

MAGEA1

amplicons foram digeridos com

Xba

-I, produzindo assim uma banda superior (330 bp) decorrente da endógena

MAGEA1

gene e uma banda inferior (269 bp) decorrente da

MAGEA1 /HPH

transgene seguinte eletroforese em agarose (Fig. 3A, B). Ao aplicar este procedimento para a análise de amostras de cromatina derivada-chip, descobrimos que H3ac e H3K4me2 marcas histonas foram fortemente empobrecido dentro do

MAGEA1 /HPH

transgene, em comparação com o endógena

MAGEA1

gene. Em contraste, a marca H3K9me2 repressiva apareceu predominantemente enriquecido dentro do transgene (Fig. 3B e C). Estes resultados indicam que, após a integração no genoma MZ2-MEL.TrHM, o

in vitro

metilado

MAGEA1 /HPH

transgene marcas histonas adotadas tipicamente associados com o estado reprimida do

gene MAGEA1

em células que não expressam.

Falta de ativação de longo prazo da

MAGEA1 /HPH

seguinte TSA tratamento

Como descobrimos baixo acetilação das histonas dentro do silenciosa

MAGEA1 /HPH

transgene, foi testada a capacidade de induzir a activação de TSA para estável do transgene, e, consequentemente, o aparecimento de higro

r clones de entre a população de células MZ2-MEL.TrHM tratada. Em adição ao tratamento convencional 24h TSA, TSA uma exposição de 72h de comprimento foi aplicado a células MZ2-MEL.TrHM, uma vez que foi relatado que o tratamento prolongado com inibidores de HDAC pode em alguns casos ser necessário para induzir a desmetilação de ADN localizada [25]. A concentração de TSA no tratamento 72h foi reduzida para 80 nM, porque as doses mais elevadas foram encontradas para matar a maioria das células durante este período de tempo. Além disso as células tratadas com TSA, que também analisadas células tratadas com uma dose sub-óptima de 5-azadC (20 nM; Fig. 4A). 5-azadC a esta dose foi encontrada para induzir

MAGEA1 /HPH

expressão de ARNm a um nível comparável ao observado no dia 1 após o tratamento com TSA de 24 horas (Fig. 4B). Portanto, o tratamento com a dose sub-óptima de 5-azadC permitiu-nos para verificar se o nosso processo de selecção higromicina ainda era eficaz em condições onde somente a ativação de baixo nível do transgene ocorreu.

A

, esboço esquemático do experimento. células MZ2-MEL.TrHM foram tratados ou não (controle) com 300 nM de TSA por 24h, 80 nM de TSA por 72h, ou com 20 nM de 5-azadC por 72h. Depois de três dias, 10

6 células de cada grupo foram transferidos para dois frascos (75 cm

2) e foram seleccionados num meio contendo higromicina (180 ug /mL) durante 13 dias.

B

, o nível de expressão do

MAGEA1 /HPH

transgene foi quantificado por qRT-PCR no ponto de tempo indicado (D1 D3 ou) em cada grupo de células. Os dados representam a média (± SEM) de ao menos três experiências independentes. ***

P Art 0,001.

C

, o nível de desmetilação de ADN do

MAGEA1 /HPH

5′-região nos diferentes grupos de células foi avaliada por PCR quantitativo MS-, utilizando iniciadores que amplificam especificamente o transgene com etiquetas seqüência. Os dados (a dobra desmetilação de ADN) foram calculados como na figura 2C, e correspondem à média (± SEM) de pelo menos três experiências independentes. *

P Art 0,05.

D

, o número de clones que sobreviveram a selecção higromicina foram contadas no dia 16 nos três grupos de células. Os dados derivam de pelo menos duas experiências independentes, cada uma em duplicado.

experimentos RT-PCR quantitativa revelou que enquanto a baixa, mas significativa,

MAGEA1 /HPH

indução mRNA foi observada no dia 1 seguinte o tratamento TSA 24h, esta indução já estava perdido dois dias mais tarde (Fig. 4B). células MZ2-MEL.TrHM que tinham sido expostas ao tratamento 72h TSA apresentado um aumento muito modesto na

MAGEA1 /HPH

expressão de ARNm (não significativo,

p = 0,1428

), em comparação com as células de controlo (Fig. 4B). Este baixo nível de indução foi provavelmente atribuíveis à concentração reduzida de TSA nesta condição. Além disso, o MS-PCR quantitativa dirigidas especificamente para o transgénico

MAGEA1

5′-região, revelou nenhuma desmetilação desta sequência de ADN em qualquer das populações de células tratadas com TSA, em comparação com células não tratadas (Fig. 4C) . Em contraste, as células tratadas com a dose sub-óptima de 5-azadC exibido moderada, embora significativa desmetilação, o DNA do

MAGEA1 /HPH

transgene.

A fim de detectar células raros em

MAGEA1 /HPH

activação transgene pode ter ocorrido, e que podem ter permanecido invisível em nossa RT-PCR e MS-PCR análise, nós submetemos as populações de células MZ2-MEL.TrHM diferente tratados à seleção em higromicina. Após 13 dias de seleção, higro

colónias de R foram contados. A frequência média de higro

clones r obtida quer após a 24h ou 72h no tratamento TSA (6 × 10

-6 e 5,5 × 10

-6, respectivamente) não foi maior do que a observada para o controle sem tratamento células (9,5 x 10

-6), e, portanto, corresponde ao nível de higro espontaneamente

R células revertentes (Fig. 4D) de fundo. Em comparação, o tratamento com a dose sub-óptima de 5-azadC resultou no aparecimento de um muito maior número de higro

clones r ( 3 x 10

-4). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que TSA não induz desmetilação DNA e ativação estável do

MAGEA1 /HPH

transgene, nem mesmo em uma pequena proporção das células MZ2-MEL.TrHM tratados.

desmetilação DNA induz reversão de marcas histonas no Considerando

MAGEA1 /HPH

estudos anteriores por outros [18], [19] e as observações que aqui descrito acima, parece improvável que as mudanças ao nível das histonas modificações poderão por si própria ser um gatilho suficiente para provocar a desmetilação de ADN e activação de longo prazo do

MAGEA1

gene. Foi, portanto, razoável propor que a reversão das marcas de histonas associadas a

MAGEA1

activação é sim uma consequência da desmetilação DNA. Para testar esta hipótese, recorremos a um higrômetro previamente estabelecido

r sub-população de células MZ2-MEL.TrHM (H

população r, Fig. 5A e [24]), que tinha sido obtido após a exposição transiente das células de oligonucleótidos anti-sentido dirigidos contra o

DNMT1

, a metiltransferase de ADN predominante nestas células [24]. Decidimos realizar experimentos chip na H

população r, a fim de determinar o impacto da desmetilação do DNA em H3ac, H3K4me2 e H3K9me2 marcas histonas dentro do

MAGEA1 /HPH

transgene. As análises foram também realizados em um clone de células (H

r clone 1), que tinha sido isolado a partir do H

população R (Fig. 5A). RT-PCR quantitativa e seqüenciamento bissulfito de sódio confirmou robusta transcricional ativação e DNA desmetilação do

MAGEA1 /HPH

transgene na H

população r e H

clone r 1 (Fig. 5B).

a

, esboço esquemático da derivação do H

população r e H

r clone 1 a partir de células MZ2-MEL.TrHM (ver referência [24] para detalhes) . células MZ2-MEL.TrHM foram repetidamente transfectadas com oligonucleótidos anti-sentido dirigidos contra o

DNMT1

(

DNMT1-AS

) durante 7 dias, e depois foram transferidas para meio contendo higromicina. Após 9 dias de selecção higromicina, uma população resistente emergiu (H

população R), e um clone (H

r clone 1) foi isolado a partir desta população por diluição limitante. O H

população r e H

r clone 1 foram subsequentemente cultivadas sem selecção higromicina.

B

, o nível de expressão de mRNA (razão de 10

4

ACTINB

) e 5′-região de estado de metilação do DNA (% CpGs metilados) do

MAGEA1 /HPH

transgene foram determinados em células MZ2-MEL.TrHM, o H

população r e H

r clone 1 por qRT-PCR e seqüenciamento bissulfito, respectivamente.

C

, Chip-qPCR foi utilizado para avaliar o enriquecimento de H3K9me2 dentro do

MAGEA1 /HPH

transgene nos três grupos de células (ver texto para detalhes). Dobra níveis de enriquecimento foram obtidos por meio de relatórios do

MAGEA1

5′-região valores de enriquecimento ao do

GAPDH

5′-região na mesma amostra. Os dados representam a média (± SEM) de duas a três experiências Chip, com duas medições qPCR duplicados em cada caso. ***

P Art 0,001.

D

, o chip /PCR /

Xba

I procedimento (ver Fig. 3A, B) foi aplicado para avaliar o enriquecimento de H3ac e H3K4me2 dentro do 5′-região do

MAGEA1 /HPH

transgene no grupo de três células.

E

, ImageJ análises de eletroforese em gel imagens foram usadas para quantificar o

relação de transgene /gene MAGEA1

5′-região. Os dados representam a média (± SEM) de duas experiências independentes ChIP, com duas análises de PCR /Xbal /electroforese em cada caso. **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001

Para a análise dos H3K9me2, amostras de chip foram submetidos a PCR quantitativo com primers não distinguindo entre endógeno e transgênico

MAGEA1

sequências. Falta de H3K9me2 dentro do endógena activa

gene MAGEA1

em células MZ2-MEL.TrHM (Fig. 3B, C) implícita, no entanto, que a maioria dos produtos de amplificação derivados de chip daria origem a partir do

MAGEA1 /HPH

transgene. Os resultados, que estão representados na Figura 5C, foram consistentes com uma diminuição de enriquecimento H3K9me2 dentro da região de 5 ‘de

MAGEA1 /HPH

no H

r população e na H

r 1 clone , em comparação com o controlo de células MZ2-MEL.TrHM. Para a análise dos H3ac e H3K4me2, recorremos ao chip-PCR-

Xba

I procedimento descrito acima (Fig. 3A). Os resultados mostraram que enquanto a

MAGEA /HPH

transgene não foi associada com H3ac H3K4me2 e em células de controlo MZ2-MEL.TrHM, é exibido enriquecimento significativo destas duas marcas de activação na forma H

r e população na H

r clone 1 (Fig. 5D, E). Em conjunto, esses resultados indicam que a depleção transitória de DNMT1 em células MZ2-MEL.TrHM, resultou no surgimento de higro

células r, em que o re-ativado

MAGEA1 /HPH

lócus não exibida apenas marcada hipometilação do DNA, mas também uma inversão significativa do seu perfil de modificação da histona para uma configuração ativa.

Discussão

Genome hipometilação é frequentemente observada em células tumorais, e tem sido associada com a progressão maligna. No entanto, os mecanismos subjacentes a esta alteração epigenética ainda são desconhecidos. Considerando a estreita ligação existente entre a metilação do DNA e modificações de histonas, foi razoável propor que hipometilação do DNA em tumores pode ser uma consequência das mudanças que ocorrem no nível das marcas de histonas. Alterações de perfis de modificação das histonas foram efectivamente observada em diferentes tipos de tumores e, em alguns casos foram associados com mutações em enzimas histona modificando [26].

No presente estudo, foi analisada a relação entre a metilação do DNA e histonas modificações dentro do

MAGEA1

gene, uma vez que pertence ao grupo original de genes CG, para os quais promotor hipometilação foi frequentemente observada numa variedade de tumores e foi consistentemente associada com a activação da transcrição [11]. Foi previamente relatado que a desmetilação e a activação de genes em tumores CG está geralmente associada a perdas de marcas de histona repressivas, e ganhos em termos de activação marcas histona [18], [19]. Tal associação foi confirmado em nosso estudo, pois verificou-se que

MAGEA1

desmetilação e ativação em células de melanoma correlacionados com perdas de H3K9me2, e ganhos de H3ac e H3K4me2. Estudos anteriores no entanto, mostrou que a expressão de

MAGEA1

não poderia ser activado por simplesmente modulação dos níveis ou H3K9me2 H3K4me2, sugerindo que estas duas modificações histona desempenham apenas um papel secundário na regulação deste gene epigenético [18], [19]. Inibidores de histona-desacetilases, incluindo TSA, em vez disso foram encontrados para induzir a ativação de

MAGEA1

, o que implica que acetilação das histonas pode contribuir mais activamente para a regulação epigenética deste gene [22], [27]. Nossos dados presentes no entanto, indicam que o tratamento TSA leva à única activação transiente de

MAGEA1

e não induz desmetilação de ADN dentro do gene promotor.

Nosso estudo fornece uma análise em profundidade do efeito da TSA em

MAGEA1

ativação, uma vez que nós testamos o seu impacto não apenas em não expressar linhas de células, mas também no clone de células MZ2-MEL.TrHM, que contém um

in vitro

metilado transgene compreendendo a porção 5 ‘de

MAGEA1

seguida pela sequência que codifica a resistência à higromicina. Este sistema de célula proporciona uma elevada sensibilidade, uma vez que permite a selecção de células (mesmo se eles são raros), em que a activação do

MAGEA1

promotor ocorreu. Além disso, porque as células expressam o endógena

MAGEA1

gene, eles obviamente conter todos os elementos necessários para assegurar a activação da transcrição dos transgênicos

MAGEA1

promotor, uma vez que é desencadeada a partir restrições de cromatina. Importante, nós mostramos que, ao contrário da endógena

MAGEA1

promotor do gene, o exógena

MAGEA1

promotor transgene em células MZ2-MEL.TrHM foi associada com altos níveis de H3K9me2 e baixos níveis de H3ac e H3K4me2. Isto sugere que, mediante a sua integração na cromatina anfitrião, o

in vitro

metilado

MAGEA1

transgene adotou o perfil repressivo modificação da histona tipicamente associada com o

MAGEA1

gene constitutivamente