Abstract

heterogeneidade intratumoral desafia paradigmas existentes para a terapia anti-câncer. Demonstrámos previamente que as células estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias humanas) -derived microambiente celular em ratinhos imunocomprometidos, permite a distinção funcional de células tumorais heterogéneas, incluindo as células que não crescem em um tumor em uma plataforma convencional xenoenxerto de tumor directa. Foram identificadas e caracterizadas seis sub-populações de células de cancro cada clonalmente expandidas a partir de uma única célula, derivada de carcinoma de células claras do ovário humano de um único tumor, para demonstrar a surpreendente heterogeneidade fenotipica intratumoral que é dinamicamente dependente do microambiente do crescimento do tumor. Estas subpopulações de células de câncer, caracterizados como subpopulações de células-tronco do câncer, fielmente recapitular o espectro completo de heterogeneidade fenotípica histológico conhecido para o carcinoma de células claras de ovário humano. Cada um dos seis subpopulações apresenta um nível diferente de morfológica e diferenciação tumorigénico em que o crescimento no microambiente derivadas de células estaminais embrionárias humanas favorece o crescimento de bolsas positivas CD44 + /aldeído desidrogenase de células auto-renovação que sustentam o crescimento do tumor através de um processo de diferenciação tumorigénico em CD44- /aldeído desidrogenase derivados negativos. Surpreendentemente, estas células derivadas exibir plasticidade dependente do microambiente com a capacidade para restaurar marcadores de auto-renovação e expressão de CD44. No estudo atual, nós delinear a expressão do gene distinto e perfis epigenéticos de duas dessas subpopulações, representando extremos de heterogeneidade fenotípica em termos de dependentes de nicho de auto-renovação e diferenciação tumorigénico. Ao combinar Gene Set Enrichment, Gene Ontologia e Caminho-focalizada analisa matriz com estado de metilação, propomos um conjunto de diferenças robustas em tumor auto-renovação e diferenciação caminhos que estão na base da heterogeneidade fenotípica intratumoral impressionante que caracterizam este e outras doenças malignas de tumores sólidos.

Citation: Abelson S, Shamai Y, Berger L, Skorecki K, Tzukerman M (2013) Nicho-Dependent Gene Expression Perfil intratumoral heterogêneo Ovarian Cancer Stem populações de células. PLoS ONE 8 (12): e83651. doi: 10.1371 /journal.pone.0083651

editor: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de maio de 2013; Aceito: 06 de novembro de 2013; Publicação: 17 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Abelson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Apoio Finnancial para esta pesquisa foi fornecido pelo Charitable Trust Daniel M. Soref, a Fundação Skirball e por uma bolsa de investigação do Israel Science Foundation (concessão No. 453 /06MT e concessão No. 62/10 MT) .As financiadores não tiveram nenhum papel na desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

é agora amplamente apreciado que um único tumor é constituído por populações heterogéneas de células, cada uma das quais exibe uma morfologia celular diversa, expressão fenotípica, capacidades de iniciação do tumor e inerente ou a resistência adquirida a drogas anti-cancro. A pesquisa recentemente publicada descrevendo heterogeneidade intratumoral do cancro colorectal comportamento celular e funcional, que são exibidos pela variação extensa na dinâmica de crescimento, a persistência através de passagens de xenotransplante de série e resposta à terapia enfatiza ainda mais a complexidade de tumores humanos [1].

A agressividade e ingenuidade dos cancros humanos emanam principalmente de tal heterogeneidade intratumoral complexo, que por sua vez tem sido atribuído a alterações genéticas e epigenéticas, juntamente com respostas adaptativas para o microambiente do tumor. O acúmulo de evidências demonstra que o modelo de “câncer de células-tronco” (CSC) e do modelo de evolução clonal, contribuir mutuamente para heterogeneidade intratumoral, como CSC-se submeter a evolução clonal [2-7]. A acumulação de mutações contínua gera heterogeneidade das células dentro de um tumor sólido e suas metástases, e pode reflectir o processo pelo qual certos subconjuntos de células tumorais se tornam mais agressivos do processo de progressão do tumor. A percepção crucial refere-se a compreensão de que a capacidade de auto-renovação das células-tronco do câncer não é um estado durável, mas sim dinâmico e dependente de nicho. sinais de tumor estroma de interacção também regulam a plasticidade de células de cancro epitelial através do epitélio de programas mesenquimal (EMT) que, além de facilitar a invasão e metástases de células cancerosas, permitem a conversão dos não CSCs em CSCs e podem influenciar a alteração do microambiente do tumor, convertendo células cancerosas em estroma de suporte tumor [8-11]. Como tal, a complexidade e a plasticidade de tumores sólidos emana a partir da exigência de um microambiente de suporte que proporciona uma rede de interacções compatível entre as células cancerosas e heterogéneos várias células de suporte de tumor [12-16]. Recrutamento de tumor apoio células estaminais mesenquimais multipotentes acoplados com extensa remodelação de tecidos adjacentes é um processo essencial para proporcionar um microambiente que suporta a proliferação de células de cancro, migração e invasão [17,18]. Os processos específicos que têm sido mais extensivamente estudados incluem neoangiogénese [19], atracção de células inflamatórias [20] e cancro associado fibroblastos [21-23], que em conjunto com a matriz extracelular (ECM) criar a complexidade da massa tumoral [24] .

modelos de xenotransplante para a geração de tumores humanos em ratinhos imunodeficientes são limitadas por diferenças entre o murino e o microambiente humana, especialmente no que diz respeito às propriedades dependentes do nicho de CSC auto-renovação [25,26]. Em muitos casos, esta limitação conduz a diferentes saídas de leitura de subclones tumorais distintos em ensaios de xenotransplante [5,21,27,28]. Por conseguinte, temos estabelecido e validado um modelo microambiente do tumor com base no potencial das células-tronco embrionárias humanas (hESC) para gerar teratomas em camundongos imunodeficientes. Este modelo tem a facilidade de modelos de xenoenxerto padrão, mas a vantagem de que o microambiente do tumor é constituído por uma grande variedade de tecidos não transformadas diferenciadas derivadas de todas as três camadas germinais e estruturas de origem humana [29,30]. Temos anteriormente demonstrado que esta

in vivo

modelo fornece um microambiente tumorigênese preferencial com as seguintes características: a) a viabilidade das células do tumor reforçada; b) a invasão de células de tumor proeminente; c) induzida por tumor vasculogénese; e d) proteção relativa da regressão induzida imunotoxina [29,30].

ovário carcinoma de células claras (OCCC), é caracterizada por impressionantes heterogeneidade morfológica intratumoral, incluindo células com características de variação estrutural de ovário avançado, por um lado, e as células com características de diferenciação tumorigênico (por exemplo, invasão, proliferação) e superfície celular correspondente e heterogeneidade marcador intracelular [31-35]. Temos isolados e caracterizados seis sub-populações de células de cancro diferentes (CCSPs) a partir de um tumor de um paciente individual, e demonstrou nicho dependente capacidades tumorigénicas e fenótipos histológicas quando crescido dentro do tecido teratoma derivadas de células estaminais embrionárias humanas, que cumulativamente recapitular o espectro completo de heterogeneidade tumoral [ ,,,0],36]. Os seis CCSPs foram caracterizados como CSC ovário em virtude de expressão funcional e fenotípica de CD44 + CD24 + EpCAM + e atividade ALDH1 [5,36]. Além disso, estes seis subpopulações distintas foram funcionalmente caracterizados como exibindo as propriedades de células estaminais principais de ambas as capacidades de auto-renovação e diferenciação tumorigénico de um modo dependente nicho. No nicho murino, há suporte limitado para auto-renovação da CSC, juntamente com uma alta taxa de diferenciação tumorigénico, enquanto o nicho derivadas de células estaminais embrionárias humanas com mais destaque mantém CSC auto-renovação em oposição à diferenciação. Assim, o modelo baseado em hESC fornece uma plataforma fundamental

in vivo

tendo em conta o papel essencial da CSC auto-renovação na resistência a terapias anti-cancerosas e na prestação de heterogeneidade intratumoral passíveis de análise biológica, bem como testes de terapia anticancro [5]. Além disso, foi demonstrado recentemente que o modelo baseado em hESC expressar

bona fide

vasos sanguíneos tumorais humanas e melhorar a taxa de enxerto do tumor por câncer de células primárias humanas ovarianos tronco-like (CSC) [37]. Dessa forma, teve como objetivo analisar os respectivos perfis de expressão gênica de dois CCSPs OCCC derivados diferentes que representam os extremos do espectro em termos de dependentes de nicho de auto-renovação em relação diferenciação tumorigénico. Os resultados obtidos vias destaque regem heterogeneidade intratumoral na expressão gênica e níveis epigenéticos, e a importante contribuição do microambiente do tumor para essa heterogeneidade.

Materiais e Métodos

Derivação de subpopulações de células de cancro do ovário

Recolha de fluido ascite foi realizada com um consentimento informado por escrito de um paciente de 64 anos diagnosticado com estágio IV ovário Limpar Carcinoma celular eo protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional revisão do Centro Médico Rambam. Seis subpopulações de células de cancro diferentes, clonalmente expandidas a partir de uma única célula, incluindo ccsp C12 e C13, foram derivadas a partir da ascite maligna do ovário e propagadas em cultura como anteriormente descrito [5,36]. clonalidade ensaios utilizando o método Humara [38] e análise forense STR indicou uma origem monoclonal para todos os seis CCSPs examinados (dados não mostrados). No entanto, a análise de cariótipo de cromossomas em metafase extraídos de cada uma das subpopulações de células de cancro, montadas sobre as lâminas e analisadas por Spectral-Cariotipagem (CÉU), demonstraram um elevado nível de alterações cromossómicas e as variações entre os CCSPs (dados não mostrados). Deve-se notar que, embora mantidas em cultura por mais de 6 anos, culturas de células são repetidamente iniciada a partir de stocks congelados a cada 3-4 meses, e os CCSPs duradoura e consistente manter o “

bona fide

” características de câncer de ovário , características CSC e tumor xenoenxerto fenótipo histológico [5,36].

Animais, teratoma, tumor formação e manipulação de tecidos

SCID camundongos /bege foram adquiridos de Harlan Laboratories Ltd., Jerusalém, Israel. Os ratos foram alojados e mantidos em condições livres de patógenos específicos conforme as instruções do Comité de Supervisão de Experimentação Animal no Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel. Esta foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use do Technion (Protocolo # IL-026-02-12). Os ratos foram observados para teratoma e tumor formação uma vez por semana e sacrificados usando CO

2 inalação. Para a formação de teratoma, células estaminais embrionárias humanas indiferenciadas a partir do clone H9.1 (46XX), foram injectados na musculatura do membro posterior camundongos (~ 5×10

6 células por injecção) [29]. Em 7-8 semanas após a injecção inicial da células estaminais embrionárias humanas, 4X10

6 células cancerígenas foram injectadas na teratoma (i.t tumores) e foram deixadas a crescer durante um período adicional de 20 a 60 dias. Os tumores de controlo derivados de injecção directa (im tumores) de 4×10

6 células para a musculatura dos membros posteriores foram colhidas em 20 a 60 dias após a injecção.

estudos de expressão gênica

Os estudos de expressão eram realizado com três conjuntos de amostras independentes, utilizando a expressão V3.0 beadchip matriz Illumina HumanWG-6. As imagens digitalizadas foram analisados ​​utilizando software de Illumina GenomeStudio V.2009.1 (Illumina Inc. San Diego, CA, EUA) para a extração e controle de qualidade. Os dados brutos obtidos a partir dos três experimentos de microarranjos independentes foram importados para o software genômica (Genomics Suíte; Partek Inc., St Louis, MO), normalizada, e uma remoção de quaisquer não-biológicos, “efeitos de lote”, o que pode interferir com a resultados realizada. Os sinais de expressão de genes foram transformadas pelo cálculo da base de dois logaritmos. Os genes que dada a sua transcrição não foi expresso acima do fundo definidas por sondas de controlo negativo do beadchip Ilumina em todas as amostras foram filtradas para fora. Os dados foram depositados no Centro Nacional de Biotecnologia Informações GEO7, e são acessíveis através GSE43208 adesão GEO Series.

expressão diferencial de genes individuais

Os genes que são regulados diferencialmente em cada grupo, foram seleccionado com base na sua mudança de dobragem. A média dos sinais de genes normalizados entre os diferentes grupos foi comparado e o teste t de Student foi utilizado para avaliar a significância estatística da diferença dobra entre eles. Os genes foram seleccionados com base na mudança de dobragem ( 2), e correspondente p-valor estatisticamente significativo ( 0,05). Para reduzir a possibilidade de falsos positivos, genes que não seguiu o limiar de 2 vezes em cada um dos 3 matrizes de expressão de genes independentes foram omitidos.

analisa Gene Set Enrichment (GSEA)

GSEA foi realizada utilizando o software baseado em Java [39]. A ferramenta de análise de Leading Edge (LEA) foi usado para extrair os membros de genes do núcleo dos conjuntos de genes enriquecidos, a fim de criar listas de genes que fazem a maior contribuição para a pontuação de enriquecimento correspondentes (ES) obtidos para qualquer C12 im, C12-lo, C13 im, e C13 distinções que classe. Um limiar conservadora da taxa de falso Detection (FDR) 0,05 e valor de p 0,05 foi determinada depois de 1.000 permutações aleatórias. genes ponta Apenas principais que foram compartilhados por pelo menos 5 conjuntos de genes estatisticamente enriquecidos foram utilizados posteriormente para o Gene Ontology analisa.

Gene Ontology (GO) análise

A ferramenta baseada na Web Gorilla (http : //cbl-gorilla.cs.technion.ac.il), que utiliza classificados listas gene foi usado para identificar as anotações GO enriquecidos [40]. Como entradas na lista de destino, foram utilizados os membros de genes do núcleo de ferramenta GSEA LEA se correlaciona com C12 ou C13 tumores derivados que se desenvolveram intra-muscular (i.m) ou intra-teratoma (i.t). Os quatro listas de alvos foram usados ​​separadamente, enquanto que uma lista que representa todos os genes testados na plataforma de expressão do gene Ilumina serviu como o fundo de cada uma das análises. Um limiar conservadora valor de p 0,005 foi escolhido após a correção de Bonferroni para comparações múltiplas

critérios de análise restritivas

1) Genes que não seguiram o limiar de 2 vezes em cada um dos 3 independente. matrizes de expressão gênica foram omitidos (critérios altamente restritivas). 2) No GSEA, conservador nominal p-valor 0,05 (NOM p) e FDR Q-valor 0,05 foram escolhidos 3) foi utilizado LEA. 4) Na análise de enriquecimento GO, corte de valor de p . Foi escolhida 0,005

Arrays Focado no Caminho

O Wnt humana, Sonic Hedgehog, e Notch via de sinalização RT

2 matrizes Profiler PCR (SuperArray Bioscience, Frederick, EUA) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, com 1 ug de ARN como material de partida em cada matriz. A análise dos dados foi realizada com matriz PCR baseado na web SABiosciences software de Análise de Dados (https://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php) e software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA).

a extração de RNA a partir de amostras de tumores dissecados-micro a laser, e de

em

vitro

células em crescimento, análises de qRT-PCR e seqüenciamento bissulfito são descritos em Materiais e métodos S1. Genes primers específicos utilizados para qRT-PCR e análises bissulfito são fornecidos nas Tabelas S2 e S3.

Resultados

perfis de expressão de células cancerígenas heterogêneas OCCC derivados

in vitro Comprar e

in vivo

Temos informou recentemente a observação de que a heterogeneidade consistente em propriedades tumorigénicas entre seis CCSPs OCCC derivados diferentes foi o mais impressionante refletida em seu nicho-dependente

in vivo

capacidades tumorigênicos e fenótipos celulares tumorais [36], e que o nicho derivadas de células estaminais embrionárias humanas apoia ainda mais a auto-renovação CSC e expõe seu repertório cheio de fenótipos tumorigênicos [5]. A fim de lançar luz sobre a contribuição microambiente do tumor para essa heterogeneidade, nós nos concentramos em microarrays expressão gênica análises para caracterizar os perfis de expressão genética de duas subpopulações de células de câncer distintas, CCSP C12 e C13 que crescem com sucesso, tanto no xenotransplante e da hESC-based modelos teratoma, e que exibem os extremos de atributos fenotípicos tumorigênicos e capacidade de auto-renovação dependente do nicho [5,36]. tumores C12-derivados são caracterizados por uma abundância das estruturas do ovário altamente diferenciadas, enquanto C13-derivado tumores exibem diferenciação estrutural ovário pobre [36]. Além disso, C13 preserva a sua capacidade de auto-renovação, como demonstrado por

In vivo

perpetuação de células cancerosas tumorigénicas tanto no murino e o tecido celular derivadas de células estaminais embrionárias humanas, enquanto C12 falha para perpetuar células tumorigénicas no tecido murino, mas gera tumores altamente agressivos e invasivos dentro do tecido celular derivada de células estaminais embrionárias humanas [5]. À luz deste efeito marcante, procurou-se traçar o perfil de ccsp C12 e C13 tumores derivados a expressão do gene como um reflexo da interacção entre as células tumorais e o microambiente do tumor. As amostras de RNA foram extraídos a partir de C12-C13 e cultivados em cultura de células, e a partir de tumores gerados i.m e i.t (cada amostra em triplicado) e hibridado para arranjos de expressão do genoma completo (ver Materiais e Métodos). representação esquemática do procedimento de análise é descrito na Figura 1. A matriz análises foram realizadas nos seguintes níveis: C12 contra C13

In vitro

células cultivadas, C12-C13 im contra tumores e contra C12 C13 que tumores (Figura 1A , B). A análise de componentes principais (PCA) para os dados obtidos foi realizada para avaliar a contribuição relativa hierárquica de diferenças na expressão do gene entre as amostras (Figura 2A). agrupamento distinto de C12

in vitro

amostras de células cultivadas e C13

in vitro

foi observada amostras de células cultivadas, no entanto, uma relação óbvia é demonstrado entre C12 im e ele amostras e entre C13 e im amostras, indicando diferenças significativas nos perfis de expressão gênica entre CCSPs C12 e C13. análise de agrupamento hierárquico (HCA) de cada amostra em triplicado mais confirma estes resultados (Figura 2B). genes diferencialmente expressos (DEG) entre C12 e C13

in vitro

células cultivadas e entre tumores im gerado e foram identificados com base na mudança vezes ( 2) e correspondentes valores de p estatisticamente significativas ( 0,05) . Sobreposição de DEG em todas as amostras examinadas revelou 47 genes sobrepostos que foram significativamente alteradas (Figura 1A) que compreendem as diferenças essenciais entre as subpopulações de células de cancro C12 e C13, a partir dos quais, 26 e 21 genes demonstraram expressão elevada em C12 e em C13, respectivamente (Tabelas 1 e 2).

A

, Workflow das análises realizadas para criação de perfis de células de câncer subpopulações (CCSPs) a expressão do gene C12 e C13

em

vitro Comprar e

em

vivo

.

B

, Identificação de genes diferencialmente expressos entre C12 e C13

em

in vitro

células cultivadas e entre tumores intramuscular gerado (im) e intrateratoma (TI), e Ontologia Gene anotações que se correlacionam com tumores gerados im e

A

, Os resultados dessa análise são fornecidos como representações bidimensionais com base em resultados de contribuição para os dois primeiros componentes. A discriminação entre as subpopulações amostras (CCSPs) C12 e C13 de células de cancro é mostrado como indicado na captura de cor.

B

, agrupamento hierárquico das amostras utilizando todos os 48,803 elementos de sonda no chip talão Illumina demonstrado variabilidade entre as amostras CCSPs C12 e C13.

Elevada no CCSP C12

C12 vs células C13

C12 vs C13 im

C12 vs C13-lo

Illumina PROBE_ID

símbolo Gene

Nome Gene

dobrar mudança

valor-p

dobrar mudança

valor-p

dobrar mudança

valor-p

ILMN_1677814ABCC3ATP vinculativo cassete, sub-família C (CFTR /MRP), membro fator 310.030.00212.40010.400.003ILMN_2081070BTCbetacellulin6.380.0012.7103.290ILMN_1677108CAPN13calpain 135.800.01211.070.0015.930.005ILMN_1777190CFDcomplement D (adipsina) 4.370.0013.6803.140.001ILMN_1656560DKFZP564O0823prostate regulada por androgénio mucina-like proteína WNT 15.2503.780.0013.830.004ILMN_1815673DKK3dickkopf inibidor da via de sinalização WNT 32.630.0256.380.0036.270.004ILMN_2398159DKK3dickkopf via de sinalização inibidor 33.210.0098.700.0018.490.001ILMN_1729455EML1echinoderm microtúbulos associados proteína, como 13,150. 0105.680.0035.680ILMN_1743445FAM107Aamily com semelhança de sequência 107, membro do A29.680.00917.21016.300ILMN_1715748FLNCfilamin C, gamma10.7003.750.0064.380.001ILMN_1799744GALCgalactosylceramidase9.140.00112.380.00113.480ILMN_1726666GPX3glutathione peroxidase de 3 (plasma) 169.140409.810368.950ILMN_1696183HBQ1hemoglobin, teta 17.6802.9903.020ILMN_2217329IAH1isoamyl-hidrólise de acetato de esterase de um homólogo (S. cerevisiae) 13.4309.4506.930ILMN_1673521KISS1RKISS1 receptor5.6204.1403.970ILMN_1662358MX1myxovirus (vírus da gripe) uma resistência, p78 proteína do interferão-indutível (rato) domínio da família 17.36039.970.00127.660ILMN_1709814NMRAL1NmrA-like contendo 18.7409.41010.100ILMN_1680339PDGFRLplatelet derivado receptor de fator de crescimento like2.950.0035.200.0015.310.001ILMN_1792506PLA1Aphospholipase A1 membro da família A4.8402.4902.840.003ILMN_1736533RND2Rho GTPase 26.800.0017.360.0016.500.002ILMN_1726928TCEA3transcription factor de alongamento A (SII ), proteína 312.4903.970.0015.620ILMN_1760245TMEM42transmembrane proteína dedo 426.780.0015.260.0015.190ILMN_1713990TRIP6thyroid interagente receptor hormonal 63.370.0016.210.0015.120.004ILMN_1670377ZNF20zinc 203.950.0016.4905.680ILMN_1798533ZNF22zinc proteína dedo 227.7206.7206.570ILMN_2117904ZNF22zinc proteína de dedo de proteína de dedo 227.6906.5107.660ILMN_1728710ZNF816Azinc 8166.510.0017.040.0017.220 proteína de dedo ILMN_1802053ZNF91zinc 914.180.0063.9003.770.001Table 1. genes diferencialmente expressos entre célula cancerosa subpopulações (CCSPs) C12 e C13

em

in vitro

células cultivadas e entre tumores intramuscular gerado (im) e intrateratoma (it).

Valores de zero (0) = menos de 0.001 CSV Baixar CSV elevada no CCSP C13

C13 vs C12 células

C13 vs C12 im

C13 vs C12-lo

nome

Símbolo Gene

Nome Gene

dobrar

mudança valor-p

dobrar mudança

valor-p

dobrar mudança

valor-p

ILMN_1802167ALDH1L1aldehyde desidrogenase 1 família, membro do L15.1103.870.0016.570.001ILMN_1805410C15orf48chromosome fator de 15 leitura aberta 488.380.0073.060.0092.830.002ILMN_1774287CFBcomplement B4.450.0013.500.0015.350ILMN_1810942CYP3A5cytochrome P450, família 3, da subfamília A, polipeptídeo de domínio 54.870.0115.760.0179.230.007ILMN_1725597FXYD4FXYD contendo regulador de transporte de íons 44,570. 0056.080.0056.800.004ILMN_1660973GAD1glutamate descarboxilase 15.440.0012.520.0022.550.001ILMN_1712082GCNT3glucosaminyl (N-acetil) 3-transferase, mucina type5.900.0093.6504.190.002ILMN_1739813HYAL1hyaluronoglucosaminidase 14.030.00815.84014.140ILMN_2314417HYAL1hyaluronoglucosaminidase 12.430.0046.050.0025.650.001ILMN_1778010IL32interleukin 322.870.0096.450.0015.180ILMN_1705814KRT80keratin 803.990.0153.840 .0023.570ILMN_1692223LCN2lipocalin 220.320.0052.500.0023.820.006ILMN_1814270LY6Dlymphocyte 6 antigénio complexo, lócus D10.2909.520.00212.990ILMN_1802780M160CD163 molécula semelhante 13.290.0015.320.0044.830.001ILMN_1651568MUC13mucin 13, à superfície celular associated4.570.0053.980.0027.130ILMN_1709809NHP2L1NHP2 cromossoma proteína não histona-2-like 1 (S. transferência cerevisiae) 11.1407.9505.260.001ILMN_1773389PLTPphospholipid protein6.3803.280.0034.610.006ILMN_1713829PTGESprostaglandin E synthase5.9108.5309.180ILMN_1651429SELMselenoprotein M2.530.0013.510.0023.800.001ILMN_1683670SLC10A2solute família transportador 10 (sódio /bile co-transportador de ácido), cálcio membro 25.650.00115.1105.140.006ILMN_1739001TACSTD2tumor-associado transdutor de sinal 276.1505.310.0125.460.004ILMN_1725387TMEM200Atransmembrane proteína 200A4.540.0047.310.0047.950.003Table 2. genes diferencialmente expressos entre célula cancerosa subpopulações (CCSPs) C13 e C12

em

vitro

células cultivadas e entre tumores gerados intramuscular (im) e intrateratoma (it)

Valores de zero (0) = menos de 0.001 CSV Baixar CSV

Microenvironment -. dependente gene tumor perfil de expressão

Para examinar o perfil de expressão gênica do CCSP C12 e C13 – tumores derivados como um reflexo da interacção entre as células tumorais eo microambiente do tumor (Figura 1B), aplicou-se a análise conjunto de enriquecimento de gene (GSEA) [39] para avaliar se conjuntos de genes distintos foram estatisticamente significativas. Para este efeito, foi utilizado um total de 3279 conjuntos de genes que são publicados no assinaturas moleculares de banco de dados do site oficial GSEA (https://broadinstitute.org/gsea). GSEA detecta enriquecimento de conjuntos inteiros de grupos relacionados com o funcionalmente de genes, comparando dados de expressão de genes com conjuntos selecionados de bancos de dados conjunto de genes disponíveis. Os conjuntos de genes com nominal p-valor 0,05 (NOM P) e FDR Q-valor 0,05 foram utilizadas para minimizar a identificação de falsos positivos na análise GSEA. Os conjuntos de genes de 3279, que foram testadas no C12 i.m contra i.t comparação, 401 conjuntos de genes foram enriquecidas em C12 i.t, e 43 conjuntos de gene enriquecida em C12 i.m. Por outro lado, no contra i.m comparação C13 i.t, 120 conjuntos foram enriquecidos em classe i.t C13, e 43 conjuntos de genes foram correlacionados com a classe i.m C13 (Tabela 3). Para interpretar esta grande quantidade de dados de forma eficaz, usamos a ferramenta LEA do software GSEA, extraindo os membros de genes do núcleo dos conjuntos de genes enriquecidos que mais contribuem para os valores ES correspondentes. Ao tomar em consideração apenas levando genes de ponta, geramos 4 lista de genes que representam os subconjuntos mais significativas para C12 i.m, C12 i.t, C13 i.m e C13 i.t. A Figura 3 mostra classificados por GSEA para C12 e C13 os 100 genes mais diferencialmente expressos

in vitro

células cultivadas (Figura 3A) e para C12 i.m e i.t (Figura 3B) e C13 i.m e i.t. (Figura 3C).

conjuntos de gene enriquecida

Gene Set Nome Ver.2.5

Gene Set Tamanho

ES

NES

NOM p

FDR q

C12 i.m DAC_IFN_BLADDER_UP17-0.755-2.27700GNF2_IGF125-0.667-2.18200.002GNF2_LYN26-0.630-2.15000.003MODULE_345114-0.495-2.22300.003MODULE_436124-0.449-2.08200.006MODULE_7121-0.633-2.01400.01IFN_BETA_UP65-0.477-1.96700.011MODULE_171128-0.428-1.97900.014PROTEASOME17-0.588-1.7620.0060.045ANDROGEN_AND_ESTROGEN_METABOLISM23-0.552-1.7910.010.038 C12 i.tHSA04512_ECM_RECEPTOR_INTERACTION850.7942.65200HSA01430_CELL_COMMUNICATION1350.7082.51600DNA_REPLICATION_REACTOME440.6912.10400.002CANCER_UNDIFFERENTIATED_META_UP680.6412.08300.003HSA04350_TGF_BETA_SIGNALING_PATHWAY880.5721.94500.012CELL_ADHESION1710.5181.86700.022HSA04310_WNT_SIGNALING_PATHWAY1470.5151.82700.03CELL_CYCLE770.5651.8520.0010.024HSA05217_BASAL_CELL_CARCINOMA550.6171.9400.0010.013SRC_ONCOGENIC_SIGNATURE580.5621.7530.0060.044 C13 i.m BECKER_TAMOXIFEN_RESISTANT_UP38-0.487-3.12600DSRNA_UP36-0.436-2.13200CMV_8HRS_UP32-0.451-2.08800MODULE_35528-0.416-2.10900DAC_IFN_BLADDER_UP17-0.535-2.21300.001HPV31_DN48-0.379-2.16700.002CMV_24HRS_UP72-0.263-1.26100.007NF90_UP24-0.487-1.92600.008RIBAVIRIN_RSV_UP22-0.409-1.79800.016ET743_RESIST_UP17-0.385-1.68900.036C13 isto HSA01032_GLYCAN_STRUCTURES_DEGRADATION300.5931.59000.002MYC_ONCOGENIC_SIGNATURE1900.4941.52100.006RAS_ONCOGENIC_SIGNATURE2490.4491.39600.029HSA04910_INSULIN_SIGNALING_PATHWAY1350.4541.3860.0010.032HSA04012_ERBB_SIGNALING_PATHWAY870.4851.4330.0020.019HSA04370_VEGF_SIGNALING_PATHWAY700.4821.4150.0040.023HSA04150_MTOR_SIGNALING_PATHWAY480.5201.4770.0050.011HSA04512_ECM_RECEPTOR_INTERACTION850.4541.3350.0120.052HSA04330_NOTCH_SIGNALING_PATHWAY460.4881.3810.020.033HSA00100_BIOSYNTHESIS_OF_STEROIDS240.5421.4180.0310.022Table 3. Representante enriquecido conjuntos de genes para CCSPs C12 e C13 -derived tumores gerados intramuscular (im) e intrateratoma (TI).

Valores de zero (0) = menos de 0.001MSigDB Ver.2.5ES = Score Enriquecimento NES = Normalizada Enriquecimento Pontuação FDR = False Descoberta Taxa CSV Baixar CSV

Os 100 genes mais diferencialmente expressos entre célula cancerosa subpopulações (CCSPs) C12 e C13

em

vitro

células cultivadas (

a

), tumores CCSP C12 derivadas gerado intramuscular (im) e intrateratoma (it) (

B

) e tumores CCSP C13 derivadas gerado im e (

C

). A expressão diferencial de genes foi calculado de acordo com as métricas de sinal-ruído. Os 50 principais símbolos representam genes que foram elevados em i.t. tumores desenvolvidos Os próximos 50 símbolos representam genes que elevados em tumores desenvolvidos i.m. Os genes que estão localizados mais elevado em cada um dos dois grupos de genes 50 indica um nível de diferença superior a genes localizados nas posições mais baixas. valores de expressão são representados como mostrado na legenda da cor.

Gene Ontology (GO) Análise de enriquecimento

As listas de genes resultantes foram submetidos a análise GO enriquecimento [40], usando o gorila software baseado na web. A entrada para esta análise consistiu em listas de genes de ponta e uma lista de fundo que representa todos os genes testados na plataforma de expressão genética Illumina. Com um critério conservador de Bonferroni ajustado p-valor 0.005, obtivemos duas listas de termos GO enriquecidos por CCSP, representando a sua interacção com os dois microambientes diferentes. É importante notar, no nicho murino, apenas um número limitado de diferenças entre os dois CCSPs foram encontrados (Figura 4A, C). 10 e 7 termos GO foram enriquecidos em CCSP C12 e C13, respectivamente. Todos os 7 termos GO que foram enriquecidos em CCSP C13 i.m também foram enriquecidos em CCSP C12 i.m com pontuação de enriquecimento semelhantes valores (ES). Todos os termos GO designados estão relacionadas com o sistema de resposta imune e envolvido na “resposta celular a um estímulo produzido por um organismo vivo”. O enriquecimento destes termos GO demonstra uma mudança no estado ou a actividade do CCPSs como um resultado da interacção com o ambiente externo heterólogo como seria de esperar. Por outro lado, no microambiente derivadas de células estaminais embrionárias humanas muito maiores diferenças entre os dois CCSPs foram observados (Figura 4B, D). Ccsp C12 apresentaram enriquecimento de vários termos GO relacionadas com ciclo celular, o que pode reflectir o efeito do microambiente derivadas de células estaminais embrionárias humanas como um nicho mais apoio em contraste com o microambiente murino. Além disso, GO termos relacionados com o processo de epitelial para mesenquimal (EMT) foram também enriquecidas em tumores derivados C12 no microambiente derivadas de células estaminais embrionárias humanas. Relativa aos tumores C12, C13 CCSP derivados no microambiente exposições derivadas de células estaminais embrionárias humanas apenas alguns, de baixo valor ES enriquecido termos GO, na sua maioria relacionadas com processos metabólicos. As listas de termos GO enriquecidas em C12 e C13 – tumores derivados i.m gerado e i.t são apresentados na Tabela S1.

estatisticamente significativos conjuntos de genes GSEA foram submetidos a líder análise de borda (LEA) e os genes resultantes foram agrupados em anotações ontológicas de categorias de processos biológicos. Os gráficos de pizza apresentar as anotações enriquecidos ir e suas pontuações de enriquecimento de correspondência (ES) para:

A

, GO anotações regulados positivamente em tumores C12 i.m gerados em comparação com i.t. tumores C12 gerado

B

, GO anotações regulados positivamente em tumores C12 geradas i.t comparação com tumores C12 i.m gerado (as 20 anotações ir com as maiores pontuações de enriquecimento são mostrados).

C

, GO anotações até regulamentada em tumores C13 i.m gerados em comparação com i.t. tumores C13 gerado

D

, GO anotações regulados positivamente em tumores C13 gerou comparação com tumores C13 geradas im

No seu conjunto, esta análise demonstra as diferentes vias de interações entre CCSPs C12 e C13 com o microambiente durante o processo de progressão do tumor. Em contraste com o modelo murino convencional, o modelo baseado em células estaminais embrionárias humanas demonstra uma interacção célula-microambiente cancro mais complexa, que pode proporcionar uma reflexão mais autêntica da relação correspondente entre as células tumorais de um paciente e os tecidos humanos complexas que rodeiam o tumor.