Abstract

Fundo

Gut derivado fatores de lipídios têm sido implicados na lesão sistêmica e inflamação, mas os caminhos precisos envolvidos são desconhecidos. Além disso, a ingestão de gordura e obesidade são fatores de risco independentes para o desenvolvimento de cancro colorectal. Aqui nós estudamos a gravidade da colite experimental eo desenvolvimento de câncer associado a colite (CAC) em ratos com um bloco de inducible na secreção de quilomícrons e má absorção de gordura, após a eliminação específica do intestino de proteína microssómica de transferência de triglicéridos (

MTTP-IKO

).

Metodologia /Principais achados

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ratos exibiram lesão mais grave com mortalidade ~ 90% após sulfato de sódio dextrano (DSS) colite induzida, em comparação com 20% nos controlos. permeabilidade intestinal foi aumentada em

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ratos em comparação com os controles, tanto no início do estudo e após a administração DSS, em associação com o aumento dos níveis circulantes de TNF. tratamento DSS aumento da expressão de mRNA de IL-colónica 1β e IL-17A, bem como a expressão inflamassoma em ambos os genótipos, mas a abundância de TNFa foi aumentada selectivamente em DSS tratados

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ratinhos. Houve um aumento de 2 vezes na carga do tumor do cólon em

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ratos após azoximetano tratamento /DSS, que foi associado com a inflamação do cólon aumentada, bem como alterações na expressão das citocinas. Para examinar as vias pelas quais as alterações na abundância de ácido gordo pode interagir com citocina para regular o crescimento do epitélio do cólon, foi utilizado miofibroblastos murino primários para demonstrar que a expressão de palmitato induzida de anfiregulina e epirregulina e aumentou o aumento em ambos estes mediadores de crescimento quando adicionado a IL-1βor a TNFa.

Conclusões

Estes estudos demonstram que

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ratos, apesar de absorver praticamente nenhuma gordura na dieta, exposição aumentada de ácidos graxos dependente sinalizando que por sua vez exacerba a lesão do cólon e aumenta a formação de tumores

Citation:. Xie Y, Matsumoto H, Nalbantoglu I, Kerr TA, Luo J, Rubin DC, et al. (2013) Intestino-Specific MTTP Supressão aumenta a gravidade da colite Experimental e leva a uma maior Tumor Burden em um modelo de câncer associado a colite. PLoS ONE 8 (6): e67819. doi: 10.1371 /journal.pone.0067819

editor: Josep Bassaganya-Riera, Virginia Tech, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Março, 2013; Aceito: 22 de maio de 2013; Publicação: 21 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Xie et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (HL- 38180, DK-56260 eo Digestive Disease Washington University Research núcleo central DK-52574, em particular o murino e núcleos morfologia) para NOD. DR foi apoiada por doações DK-46122 e DK-61216. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a epidemia de continuação da obesidade e suas comorbidades associadas tem alimentado interesse em compreender as vias e mediadores envolvidos, particularmente em relação à inflamação e câncer. A obesidade e as complicações metabólicas associadas, têm sido demonstrados para desempenhar um papel num número de cancros, incluindo o cancro colo-rectal (CRC) e controlo de peso e consequentemente modificação dietética são vistos como principais factores de risco modificáveis ​​[1]. No entanto, os mecanismos e caminhos precisos pelos quais a obesidade contribui para o risco de CRC são ainda completamente compreendida e é provável que incluem alterações na inflamação sistêmica e sinalização de citocina, a resistência à insulina, bem como os efeitos locais e sistêmicos da absorção de nutrientes alterada, incluindo os ácidos graxos, colesterol e ácidos biliares [2]. Devido à sua importância como fonte de energia, o consumo de gordura na dieta tem sido um alvo para a intervenção como uma estratégia para mitigar os efeitos da obesidade e inflamação no risco CRC [3].

Além do papel para a obesidade e ingestão de gordura na inflamação modulação e risco de CRC, há informações que sugerem que o intestino delgado tem um papel importante como mediador na resposta inflamatória sistêmica da sepse [4] emergentes, [5]. Neste cenário, tem sido sugerido que o intestino delgado segrega produtos da digestão de lípidos derivadas do lúmen, as quais são então transportados em linfáticos mesentéricos, onde induzem a falha do órgão em locais distantes [6], [7]. Outro trabalho reforçou esta hipótese intestino-linfa, demonstrando que a ligação da conduta mesentérica (eliminando, assim, a entrega de quilomicrons a partir do intestino para a circulação sistémica) anula os efeitos sistémicos de choque, as conclusões que apontam para a importância de mediadores lipídicos decorrentes da intestino na patogénese da inflamação sistémica [8], [9]. Outros trabalhos tem implicado lipoproteínas como veículos para o transporte de factores de crescimento e outras proteínas, incluindo Wnt3 mamíferos, sugerindo um papel mais fundamental para o transporte de lipídios na regulação do crescimento epitelial e proliferação [10].

Neste estudo, nós temos examinou o papel da secreção quilomícron intestinal, a fim de compreender o papel do transporte lipídico intestinal na patogênese da inflamação do cólon e colite câncer associado (CAC). Nós recentemente demonstraram que camundongos com deleção específica do intestino condicional de proteína microssómica de transferência de triglicéridos (

MTTP-IKO

) desenvolver bloco virtualmente completa da absorção intestinal [11] e apresentam uma vantagem de sobrevivência quando desafiado com

Pseudomonas aeruginosa

, a causa mais comum de pneumonia gram negativa [12]. Essas descobertas levantaram a possibilidade de que o bloqueio da secreção quilomícron intestinal também pode atenuar os efeitos da química induzida colite experimental e por sua vez revogar o desenvolvimento do cancro colorectal seguinte /sulfato de sódio dextrano azoximetano desafio (/DSS OMA) [13]. Nossos resultados, no entanto, revelou que

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ratinhos desenvolveram pior lesão do cólon e uma maior carga tumoral. Além disso, descobrimos que a sinalização de ácidos graxos alterado pode desempenhar um papel fundamental na promoção destes fenótipos.

Materiais e Métodos

Animais

MTTP

Flox /Flox villin- Cre-ER

T2 (

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) ratos (juntamente com os controles da mesma ninhada) foram utilizados para estes estudos, em um fundo de -75% C57BL /6 e -25% 129 /SvJ. expressão da recombinase Cre em células epiteliais das vilosidades foi induzida por cinco injecções intraperitoneais de 1 mg por dia de tamoxifeno (Sigma), como descrito anteriormente [11]. As experiências foram realizadas em ratinhos que consomem uma baixa gordura Rodent Chow regular. colite experimental foi induzida pela administração de sulfato de dextrano de sódio a 2,5% (DSS) (MW 40.000-50.000, Cat # 9011-18-1, Affymetrix, Inc., Cleveland, Ohio.), durante os tempos indicados nas legendas das figuras e pesados ​​diariamente . CAC foi induzida por injecção de ratinhos com 8 semanas com 10 mg /kg de azoximetano peso corporal (AOM, Sigma) seguido por três ciclos (5 dias) de DSS a partir de 5

th (2%), 26

th (2,5%) e 46

th (2,5%) dias após a injecção AOM, pequenas modificações do protocolo utilizado por outros [14]. Os ratinhos foram sacrificados às 9 semanas após a injecção e AOM tecidos colhidos para análise. Todos os estudos com animais foram aprovados pelos Comitês de estudos com animais da Faculdade de Medicina (# 20.100.146) da Universidade de Washington e foram conduzidos em estrita conformidade com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para o uso de animais de laboratório.

análises histomorfológica

As amostras de intestino delgado e cólon foram fixadas e incluídas para corte e hematoxilina e eosina (H e) coloração. Onde indicado, as secções foram coradas para intestinais gotículas lipídicas utilizando tetróxido de ósmio, como descrito [12] de pontuação histológica da lesão DSS foi realizada e quantificada utilizando os parâmetros descritos [15]. proliferação intestinal foi examinada em ratinhos injectados com 5-bromo-2’desoxiuridina (BrdU) (volume de 200 ul, 5 mg /ml diluído em soro fisiológico normal; Sigma), 2 horas antes do sacrifício. As amostras foram processadas por coloração BrdU como descrito [12]. Análise da carga de tumor de cólon foi realizada utilizando amostras fixadas em formalina a 10% (Sigma) e fixadas para a pontuação por um investigador cego para o genótipo. Cada amostra foi fotografada usando um microscópio de dissecação Nikon SMZ800 e uma câmera fotométricos CooLSNAPcf (Serviço de Processamento de Imagem). A área de cada secção foi determinada e o tamanho dos tumores quantificada utilizando software de Metavue (Molecular Devices). H . Seções E também foram revisadas por um patologista (IN), cego para o genótipo

permeabilidade intestinal e ensaios de citocinas

permeabilidade intestinal foi determinada após a injecção de FITC dextrano (FD-4, MW 4000, Sigma). Controlo e

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ratinhos foram tratadas por gavage com FD-4 (400 mg /kg de peso corporal), antes e 7 dias após o tratamento de 2,5% DSS e os soros foram recolhidas 4 horas mais tarde. Soro FITC foi medida num fluorímetro (Synergy HT, BioTek®) a excitação 485/20, 528/20 emissão. Para as determinações de LPS, os soros foram diluídos a 1:10 e aqueceu-se a 70 ° C durante 15 minutos para inibidores inactivos. LPS foi, em seguida, medida utilizando o kit de endotoxina LAL cromogénico quantificação de acordo com as instruções do fabricante (ThermoScientific, Rockford, IL). Soro de TNFa e IL-1β foram quantificados por ELISA utilizando kits adquiridos na BD Biosciences (San José, CA) ou de R . D systems (Minneapolis, MN) seguindo as instruções dos fabricantes

em tempo real de reacção em cadeia da polimerase quantitativa

o ARN total foi isolado a partir de tecidos intestinais utilizando Trizol quer sob protocolos padrão ou nas amostras tratadas com DSS, utilizando a modificação descrita por Kerr e colegas [16]. RNAs foram quantificados utilizando pares de primers (sequências disponíveis mediante solicitação) concebidos por software expressa Primer (Applied Biosystems). Abundância relativa de mRNA é expresso em relação a ratinhos de controlo sem tratamento com DSS, normalizadas para GAPDH.

teor de lípidos do cólon, o conteúdo lipídico fecal e a expressão da proteína

Os lipídios totais foram extraídos a partir de fezes, bem como a partir proximal cólon, como previamente descrito [11]. Triglicérides (TG), colesterol total (CT) e de ácidos gordos livres (FFA) foram medidos enzimaticamente utilizando kits Wako (Wako Chemicals, Richmond, VA). Western blotting foi realizado em anticorpos de moda usando padrão cuja fonte é indicado na legenda da figura correspondente. Para as amostras o conteúdo do cólon de TNFa e IL1β de cólon descendente foram homogeneizados em tampão contendo Tris 20 mM (pH 7,4), 1 ortovanadato de sódio mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton, fluoreto de sódio 50 mM, 50 β-glicerofosfato mM e 1 × Mini cocktail inibidor de protease completo (Roche, Mannheim, Alemanha). Os níveis de TNFa e IL1β foram medidos em sobrenadantes clarificados utilizando os kits de ELISA descrito acima e normalizada para a concentração de proteína.

primária murinos miofibroblastos intestinais

miofibroblastos foram isolados a partir de /6 ratinhos de tipo selvagem C57BL como descrito [ ,,,0],17] e 1 × 10

5 células por poço, foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas durante a noite. O fenótipo destas células foi verificada por coloração positiva para a actina do músculo liso e vimentina e desmina coloração negativa para citoqueratina e [13], [17]. Estas células miofibroblastos foram então cultivadas durante 12 horas em DMEM contendo 0,25% FBA e 0,6% ácido gordo de albumina de soro bovino livre (BSA, A8806, Sigma), suplementado ou com tampão sozinho (BSA, controlo), 200 uM Palmitato-BSA (PAL ), TNFa a 100 ng /ml (TNF?) (R D), IL1β a 10 ng /ml (IL1β) (R D) ou combinações de 200 uM Palmitato-BSA mais TNFa 100 ng /ml (TNFa + PAL) ou 200? M Palmitate BSA e IL1β 10 ng /ml (IL1β + PAL), como indicado na legenda. Estes estudos foram todos realizados em miofibroblastos na passagem 6-8. palmitato de sódio foi conjugado com BSA isento de ácido gordo na proporção de 02:01 (Palmitato: BSA), para fazer uma solução estoque palmitato-BSA a 3 mm. O ARN total foi extraído a partir de amostras individuais e mRNAs quantificada como descrito acima.

Análise estatística

As comparações múltiplas de conjuntos de dados de grupo contínuas foram realizadas usando análise de uma via da variância, seguida por teste post-hoc t -test utilizando Prism 4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) e o Microsoft Excel. Os dados são apresentados como médias ± SEM. estudos de sobrevivência foram analisados ​​através do teste log-rank. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

O aumento da gravidade da colite DSS em camundongos MTTP-IKO

Nós administrados de 2,5% DSS na água potável. por 12 dias, a fim de avaliar o impacto sobre a sobrevida global pelo genótipo. Nossos resultados revelaram que

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ratos exibem morte acelerada e sobrevivência muito reduzida (1/10), em comparação com ratinhos de controlo (9/11) Figura 1A. O fenótipo aumentada lesão no

MTTP-IKO

ratos foi associada a uma maior perda de peso em mais curtos (7 dias) experimentos (Figura 1C) e um retorno adiado para peso inicial (Figura 1B), juntamente com o comprimento do cólon reduzido ( Figura 1D, E). Houve lesão histológica também mais grave como evidenciado pelo aumento da inflamação da lâmina própria e cripta drop-out no cólon descendente em

MTTP-IKO

ratos em ambos os 5 dias (Figura 2A, B, E) e aos 7 dias (Figura 2C, D, e) e reduziu a proliferação celular como evidenciado pela diminuição da incorporação de BrdU (Figura 2F).

. Diminuição da sobrevivência do

MTTP-IKO

(n = 10) em comparação com controlos da mesma ninhada (n = 12). 8-10 semanas os ratos foram alimentados com 2,5% DSS na água potável durante 12 dias e seguiu até 25 dias. ** P 0,01. B. Peso curva de recuperação depois de um ciclo de DSS. Os ratos (n = 4 ratos por grupo) foram alimentados com 2,5% DSS por 7 dias e pesados ​​a cada 1-3 dias até 25 dias após o

1º dia de tratamento DSS. * P 0,05. perda de peso após o tratamento C. 7 dias DSS, n = 10-12 ratos por genótipo. Os dados são apresentados como média ± EPM% do peso inicial. * P 0,05, ** p 0,01 imagens D. representativos de aparência bruta de cólon de controle e

MTTP IKO

ratos após 7 dias de tratamento DSS. E. comprimento Colon a 0, 5 e 7 dias em 2,5% DSS. Os dados são média ± SE de 4-9 ratos por grupo * p .. 0,05

A. e B. Representante imagens histológicos de regiões comparáveis ​​de cólon distal de controle (A.) e

MTTP-IKO

ratos (B.) após 5 dias de tratamento DSS. Os painéis A e B mostram aumento lesão da mucosa no

MTTP-IKO

ratos caracterizadas pelo aumento da inflamação da lâmina própria estendendo-se até a submucosa com perda de criptas. C. e D. Representante imagens histológicos de regiões comparáveis ​​de cólon descendente de controle (C) e

MTTP-IKO

ratos (D.) após 7 dias de tratamento DSS. Painéis C e D mostram um aumento na inflamação da lâmina própria, criptite focal caracterizada por infiltração de neutrófilos e focal cripta drop-out em

MTTP-IKO

ratos. As barras indicam a 100 uM. E. estimativa quantitativa de lesões histológicas (N = 5-7 ratinhos por grupo). F. BrdU células positivas cripta na mucosa retal. Os dados foram a média ± SEM de n = 5-6 ratinhos por grupo. * P . 0,05

administração DSS não induz lesão pequena intestinal macroscópico em ratos MTTP-IKO e não está associada com cólon lipídico acumulação

Os nossos estudos anteriores demonstraram que o bloqueio da secreção quilomícron a partir do intestino de

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ratos resulta em ingurgitamento lipídico maciça com vilosidades distorção [11], levantando a possibilidade de que a alta mortalidade encontrada após a administração DSS pode refletir dano grave no intestino delgado destes ratos. No entanto, este não foi o caso. Como pode ser visto na Figura 3 AD, observou-se a acumulação de lípidos esperada em pequenas vilosidades intestinais em

MTTP-IKO

ratos, mas não havia evidência histológica grosseira ou de ulceração em qualquer região do intestino delgado após 7 dias de DSS tratamento. Além disso, uma vez que MTTP é expresso no cólon de ratos (embora em níveis baixos [18], [19]), exploramos a possibilidade de que a acumulação de lípidos do cólon pode contribuir para o fenótipo observado na

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murganhos . No entanto, isso também não foi o caso. Como visto na Figura 3E-H, enquanto nós detectada acumulação de gotículas de gordura abundante no intestino delgado de

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ratos (como observado anteriormente [11]) havia apenas raros, ósmio dispersos gotículas lipídicas coloração visto em o cólon de

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ratos e não houve acúmulo de triglicerídeos, colesterol ou o ácido gordo livre dentro mucosa do cólon como detectável por ensaio enzimático (Figura 3I).

AD. Representante H E coloração do intestino delgado de Controle e

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ratos quer sem tratamento DSS (A. Controle-0 e B. MTTP-IKO-0) ou após 7 dias de tratamento DSS (C. Controlo -7 e D. MTTP-IKO-7). Intestino delgado a partir de

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ratinhos (B e D) mostra a acumulação das vilosidades lípido (estrutura vacuolar em H E de coloração), mas nenhuma lesão significativa ou inflamação após 7 dias de tratamento DSS (D vs B). EH. coloração tetróxido de ósmio representante da gotículas lipídicas no intestino delgado (E e F) e Colon (G e H) sem tratamento DSS. gotículas lipídicas aparecem como imagens marrons (setas). Observe as gotículas de lipídios abundantes em

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pequenas enterócitos intestinais (F), em contraste com gotículas lipídicas única espalhadas em

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células epiteliais do cólon (H). lipídios I. cólon foram extraídos de controle e

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ratos sem tratamento DSS e lipídios espécies (TG, CT e FFA) medido. Os dados são apresentados como a média ± SEM de 4-5 ratos por grupo.

O aumento da permeabilidade intestinal em camundongos MTTP-IKO e o papel de uma resposta ao estresse adaptativa

Enquanto o resultados acima implica que não há alterações grosseiras na integridade das vilosidades em

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ratos, nós exploramos a possibilidade de que alterações mais sutis pode estar associado a disfunção da barreira. Para abordar esta possibilidade, administrou-dextrano marcado com FITC por gavagem a ratinhos de ambos os genótipos, quer antes ou depois de 7 dias de administração de DSS. Nossos resultados revelaram que os níveis séricos de FITC foram significativamente maiores no

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ratos sob ambas as condições (Figura 4A). Estes resultados sugerem que há uma alteração na função de barreira na linha de base no

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ratos que se torna ainda mais prejudicada no cenário de lesão DSS. A seguir considerada a possibilidade de que o aumento da permeabilidade intestinal no fenótipo

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ratinhos pode em parte reflectir alterações na expressão de proteínas de membrana integrais envolvidas na manutenção junção estanque e cuja expressão alterada tem sido associada a defeitos na humana doença inflamatória intestinal [20], [21]. Descobrimos que a expressão de HNF4α, ZO-1 e foi diminuído LAMB1 na linha de base no intestino delgado de

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ratinhos e foi diminuída após o tratamento com DSS, particularmente em ratinhos de controlo (Figura 4B). Houve uma diminuição correspondente na ZO-1 expressão no cólon após tratamento DSS com respostas semelhantes em controle e

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ratos (Figura 4C).

A.

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e ratinhos de controlo, quer antes DSS ou 7 dias após o tratamento com DSS foram administrados por via oral, níveis de FITC-dextrano no soro medidos e 4 horas mais tarde. Os dados são a média ± SEM de 7-8 ratos por grupo * P . 0.05. B. e C. ARNm expressão de genes relacionados com o stress e ER functioin barreira epitelial no intestino delgado e cólon. expressão de mRNA foi medido por qPCR e expressa como alteração vezes em comparação com não-DSS ratinhos tratados de controle após normalizado para controle interno GAPDH. Os dados são apresentados como a média ± SEM de 4-5 ratos por grupo. D. O efeito da TUDCA na proporção sobrevivência de Controle e

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ratos em DSS. ratos velhos 8-10 semanas foram tratados com solução salina ou TAUDC intraperitonealmente durante a administração simultânea de DSS (2,5%) em água potável durante 12 dias. n = 5-9 cada grupo. * P . 0,05

Nós também analisou os parâmetros da resposta desdobrado proteína (UPR) e as vias de resposta ao estresse integrados no intestino delgado e cólon de ambos os genótipos e o impacto da exposição DSS. Esses resultados demonstraram aumento da expressão de linha de base de Grp78 and Chop no intestino delgado de

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ratos (Figura 4B), como observado anteriormente [22]. No entanto, o tratamento com DSS não conseguiu produzir um aumento adicional em qualquer destes marcadores de stress, mas sim tendem a reduzir a expressão de Grp78 e costeleta no intestino delgado de

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ratinhos (Figura 4B). Em contraste, não houve alterações da linha de base em UPR ARNm no cólon de

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ratos, mas o tratamento DSS resultou num aumento da abundância de XBP-1 s em ambos os genótipos (Figura 4C). Estes resultados sugerem que não há resposta UPR base no cólon de

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ratos. Para examinar a possibilidade de que uma resposta ER estresse adaptativa pode influenciar o fenótipo prejuízo observado no

MTTP-IKO

ratos, que ratinhos tratados com o ácido tauroursodeoxycholic chaperona química (TUDCA) uma vez que estudos anteriores mostraram que esta estratégia atenua o UPR em condições de estresse metabólico em ratos [22], [23]. Estes resultados revelam que o tratamento TUDCA não conseguiu resgatar o fenótipo grave de DSS tratados

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ratos e se alguma coisa levou à morte acelerada nestes animais (Figura 4D). Estas descobertas juntos nos levam a concluir que as características de estresse ER ea UPR observado no intestino delgado de

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ratos são adaptáveis ​​na natureza e que a revogação desta resposta leva à lesão pior.

inflamação do cólon avançado em camundongos MTTP-IKO em resposta ao DSS lesão

observamos o aumento esperado na expressão de vários mRNAs de citocinas no cólon de DSS ratinhos tratados, incluindo IL-1β, IL-17A e Nlrp3, com indução comparável em ambos os genótipos (Figura 5A). No entanto, observou-se um maior aumento na expressão de TNF no cólon de DSS tratados

MTTP-IKO

ratos em comparação com os controles (Figura 5A). Examinámos também os níveis séricos de LPS, IL-1β e TNFa, os quais foram previamente associados com a lesão intestinal nos ratos tratados com DSS [14], [24]. Esses resultados revelaram que os níveis séricos de TNFa foram consistentemente elevados em

MTTP-IKO

ratos, tanto no início do estudo e após o tratamento DSS enquanto os níveis séricos de LPS e IL-1β foram mais variável (Figura 5B-D).

A. expressão de mRNA de genes relacionados com a inflamação no cólon descendente de controle e

MTTP-IKO

ratos antes e após 7 dias de tratamento DSS. ARNm foi medido por qPCR e expressos como mudanças de dobragem em comparação com ratinhos de controlo não tratados com DSS depois normalizadas para GAPDH. Os dados são apresentados como a média ± SEM de 5-9 ratos por grupo. * P 0,05. B.-D. citocinas séricas em controle e

MTTP-IKO

ratos. O sangue foi coletado de controle e

MTTP-IKO

ratos antes ou 7 dias após o tratamento DSS. LPS os níveis séricos de TNFa (D) (B), IL1β (C) e foram medidas como descrito em Métodos. Os dados são a média ± SEM de 8-10 ratos por grupo. * P . 0,05

lesão do cólon e inflamação está associada com aumento da susceptibilidade a CAC em camundongos MTTP-IKO

Um corpo substancial de dados sugere que a inflamação é um dos principais motores de desenvolvimento de neoplasias e o trabalho sugere uma ligação causal mediada através de vias que envolvem citocina sinalização inflamatória [25], [26]. Dada a propensão de

MTTP-IKO

ratinhos de manifestar um fenótipo mais grave em resposta a lesão mediada por SCD, foi perguntado se este aumento da inflamação do cólon foi associado com um tumor do cólon carga alterados após a administração de azoximetano seguido por três ciclos de DSS (Figura 6A). Os resultados revelam uma maior multiplicidade tumoral (Figura 6B) e a carga geral do tumor (Figura 6C, D) (verificado por exame patológico por um patologista cego para o genótipo) em

MTTP-IKO

ratos em associação com aumento da proliferação celular, evidenciado pela incorporação de BrdU (Figura 6E, F).

A. Painel superior: Visão esquemática do protocolo OMA /DSS (detalhe em Métodos). Os ratinhos foram sacrificados 12 dias após o último ciclo de DSS. n = 13-15 ratos de cada grupo. painel inferior: mudança de peso por cento durante o tratamento AOM-DSS. B. representativos fotos do cólon. C. Número de tumores colo-rectais por ratinho induzida por tratamento AOM-DSS. D. Carga tumoral em AOM-DSS tratada controle e

MTTP-IKO

ratos. Dados a partir de painéis D. são expressos como médias ± SEM de área do tumor normalizada para a área total de cólon, n = 9-10 ratinhos de cada grupo. E. F. e aumento da proliferação de pólipos por coloração BrdU. (E) é uma foto representativa, painel superior é um pólipo controle, painel inferior é de um

MTTP-IKO

pólipo. (F) é o gráfico de barras da média ± EPM (n = 5-6 ratinhos por grupo). * P . 0,05

sinais inflamatórios juntamente com sinalização de ácidos gordos alterada impulsionar o crescimento secreção de mediador em camundongos MTTP-IKO

A fim de compreender com mais profundidade os mecanismos subjacentes ao fenótipo proliferativo observada no cólon de

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ratos em resposta a AOM /DSS, mais uma vez examinou os padrões de IL-1β e TNF expressão. Observamos aumento mRNA abundância de IL-1β em

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ratinhos (Figura 7a) e uma tendência para o aumento da expressão da proteína IL-1β (Figura 7B). A expressão de mRNA de TNFa foi comparável por genótipo, mas observou-se um aumento significativo nos níveis de proteína de TNFa em tecido colónico da

MTTP-IKO

ratinhos (Figura 7B). Estes achados novamente apoiar a hipótese de que uma resposta inflamatória alterada provavelmente contribui para a carga tumoral aumento observado em

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ratos.

A. a expressão de ARNm alterada de genes relacionados com a inflamação e crescimento. expressão gênica em AOM /DSS-tratados cólon descendente foi medido por qPCR e expressa como alteração vezes em comparação com ratinhos de controlo após a normalização para GAPDH. Os dados são média ± SEM (n = 4 cada grupo). * P 0,05. B. O teor de proteína de IL1β e TNFa em homogeneizados de cólon descendente de AOM /controlo tratados com DSS e

MTTP-IKO

ratos foi medida por ELISA. Os dados são média ± SEM (n = 4 cada grupo). * P 0,05. C. análise de mancha ocidental de anfirregulina (Areg), (1:1000 diluição de anticorpo primário a partir de Thermo Fisher Scientific, Cat # RB-258); Akt (1:1000 do anticorpo primário de sinalização celular, Cat # 9272); p-Akt (1:1000 do anticorpo primário de sinalização celular, Cat # 9271) em homogeneizados de amostras preparadas (métodos) a partir de tecidos mencionados acima no B. D. de Western blot foi quantificado pela Kodak estação de imagem 440 e software Carestream MI SE. Gráfico de barras reflecte a média ± SEM de expressão relativa em relação ao controle após a normalização para GAPDH. E. Fecal espécies de lipídios no controle chow-alimentados e camundongos

MTTP-IK

S. Total de lipídios fecais foram extraídos e colesterol (Chol), triglicerídeos (TG), fosfolipídios (PL) e de ácidos gordos livres (FFA) quantificada por via enzimática. teor de lípido é apresentado como pg /g de fezes e conteúdo de FFA é também apresentado como nmol /g de fezes (inset). Os dados são média ± EPM (n = 4-5 por grupo) ** p 0,01. F. mRNA abundância de Areg e Ereg em miofibroblastos intestinais primárias após a estimulação indicada. Miofibroblastos foram estimuladas com factores indicados por 12 horas. Gene expressão (ARNm) foi medida por qPCR e expressa como alteração vezes, em comparação com células de controlo após normalização para GAPDH. As experiências foram efectuadas duas vezes com triplicados para cada experimento. Os dados são apresentados como média ± SEM. A diferença entre os valores por grupo é indicado por uma letra diferente para indicam significância estatística (p 0,05 ou mais). análise de mancha G. ocidental da expressão da proteína Areg em homogeneizados de mucosa intestinal de controle e

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ratos na dieta ocidental durante 2 semanas.

Para explorar os mecanismos em jogo nessa resposta, realizamos um exame de possíveis mediadores deste fenótipo pró-proliferativa. Transcrição perfis não revelou alterações significativas na expressão de ARNm de vários mediadores candidatos (Figura 7A), mas havia uma tendência para o aumento da expressão da proteína anfiregulina e um aumento na abundância de fosfo-Akt (Figura 7C e D). Estas descobertas sugerem-nos que a secreção de mediadores de miofibroblastos intestinais podem desempenhar um papel na modulação do crescimento por meio das vias parácrinos. Em apoio a esta possibilidade existe trabalho mostrando um papel para a produção de miofibroblastos do estroma da anfiregulina e epirregulina na promoção do crescimento do tumor do cólon na definição de cólon humano inflamado [27]. A nossa abordagem foi orientada por resultados anteriores demonstram que as pequenas células do epitélio intestinal de

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ratos submetidos a lesão lipotoxic seguinte rica em gordura curto prazo alimentar [22]. Com base nessas observações, nós suspeitamos que o crescimento sustentado promovendo efeitos do intestinal

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exclusão foram potencialmente mediadas por miofibroblastos.

Para explorar esta possibilidade em mais detalhe, nós nos voltamos para murino primário miofibroblastos intestinais, a fim de examinar amphiregulin e regulação epirregulina. Nós estabelecido pela primeira vez que o conteúdo lipídico fecal foi aumentado como resultado da má absorção de gordura no

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ratos, como documentado [11]. Em particular, demonstrámos em ácidos gordos livres fecal abundância aumentada (FFA), bem como aumentou o teor de colesterol e fosfolípido

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ratinhos (Figura 7E). Determinou-se que a concentração de FFA fecal em ratinhos de controlo (-60 mmol /g) foi semelhante à relatada recentemente [28]. Nós concentramos nossa atenção sobre os ácidos graxos saturados abundantes, a seleção de ácido palmítico como um alvo inicial para examinar a regulação de ambos amphiregulin e epirregulina [29]. Os nossos resultados demonstram upregulation marcante da anfiregulina e epirregulina ARNm em miofibroblastos intestinal murino primários por palmitato 200 uM (Figura 7E). Além disso, a indução conhecida de anfiregulina e epirregulina por TNFa e IL-1β [30] foi ainda aumentada pela inclusão de palmitato (Figura 7E). Estes achados sugerem que os ácidos gordos têm um papel na modificação de respostas de crescimento em conjunto com outros mediadores conhecidos. Em linha com esta sugestão que demonstrou aumento pequena expressão intestinal de expressão amphiregulin em

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ratos após a exposição a uma alta dieta ocidental de gordura (Figura 7F, G). Tomados em conjunto, os resultados sugerem fortemente que o aumento da disponibilidade de ácidos graxos do cólon, produzido pela montagem quilomícron defeito intestino delgado eo consequente bloqueio na absorção normal lipídico, exacerba vias inflamatórias e outras adaptativas que aumentam a proliferação do cólon.

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