Abstract

espontânea CD4 respostas

+ de células T para o antigénio específico de tumor NY-ESO-1 (ESO) são frequentemente encontradas em pacientes com câncer epitelial de ovário (EOC). Se estas respostas são de efector e /ou o tipo de Treg, no entanto, permaneceu obscuro. Aqui, usamos abordagens funcionais juntamente com recentemente desenvolvido MHC classe II /ESO tetrâmeros para avaliar a frequência, fenótipo e função de células específicas do ESO em linfócitos circulantes de pacientes EOC. Descobrimos que circula

+ células T CD4 + específicas do ESO em pacientes EOC com respostas imunitárias espontâneas para o antigénio são prevalentemente

células do tipo H1 T que segregam IFN-γ mas sem IL-17 ou IL-10 e não estão supressora . Detectamos tetrâmero

células +

ex vivo

, com uma frequência média de 1:25000 células de memória, ou seja, significativamente menor do que em pacientes imunizados com uma vacina contra o ESO. ESO tetrâmero

+ células foram principalmente as células de memória efetoras em estágios avançados da diferenciação e não foram detectados na circulação CD25

+ FOXP3

+ Treg. Assim, CD4 espontânea respostas

+ de células T para o ESO em pacientes com câncer são predominantemente de T

tipo H1 e não Treg. A sua frequência relativamente baixa e estágio de diferenciação avançada, no entanto, pode limitar a sua eficácia, que podem ser impulsionado pelas vacinas ESO imunogênicas

Citation:. Redjimi N, Duperrier-Amouriaux K, Raimbaud I, Luescher I, Dojcinovic D, Classe JM, et ai. (2011) NY-ESO-1-específico em circulação CD4

+ células T em ovarianos pacientes com câncer são predominantemente T

Tipo H1 Cells indetectáveis ​​na CD25

+ FOXP3

+ Treg Compartimento. PLoS ONE 6 (7): e22845. doi: 10.1371 /journal.pone.0022845

editor: George Kassiotis, Instituto Nacional MRC para a Investigação Médica, Reino Unido

Recebido: 25 Março, 2011; Aceite: 30 de Junho de 2011; Publicação: 29 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Redjimi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Fondation de France, do Instituto de Pesquisa do Câncer e do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

subconjuntos CD4

+ de células T desempenham papéis importantes e potencialmente opostos na vigilância imunológica tumor [1], [2]. Tipo I auxiliar (T

H1) células T, que segrega o assinatura citoquina IFN-γ, favorecer o desenvolvimento de células CD8

+ efectores citolíticos (CTL), e medeiam respostas anti-tumor eficazes. Em contraste, células reguladoras /supressoras T (Treg), caracterizado

ex vivo

por alta expressão da cadeia α IL-2R (CD25) e do factor de transcrição Foxp3 de linhagem específica e baixa expressão da IL -7R de cadeia α (CD127), acredita-se que inibe as respostas anti-tumorais [3], [4], [5], [6], [7]. Treg, que falham a secretar IFN-γ ou IL-2, foram relatados para estar presente em proporções maiores em doentes com cancro, em comparação com indivíduos saudáveis ​​[8], [9]. Uma vez que a especificidade para o antigénio de Treg é em grande parte desconhecida, não é claro se a capacidade de Treg para inibir respostas anti-tumorais está relacionada ou não com a presença /prevalência entre eles de tumor-antigene específico de CD4

+ células T.

NY-ESO-1 (ESO), um antigénio específico de tumor do grupo de cancro /testículo frequentemente expresso em tumores humanos de diferentes tipos histológicos, incluindo cancros do ovário, mas não em tecidos somáticos normais [10], [11 ], é um candidato para o desenvolvimento de vacinas anti-cancro genéricos [12]. ESO é altamente imunogênica e provoca humoral espontânea, CD4

+ e CD8 respostas

+ de células T em pacientes com tumores que expressam antígenos [11], [13], [14], [15]. Além disso, as respostas de anticorpo específico ESO-, CD4

+ e CD8

+ de células T pode ser induzida através da imunização com vacinas baseadas-ESO [16].

+ células Temos anteriormente identificadas regiões imunodominantes reconhecidos pelo ESO-específica CD4

+ e CD8 T [16] e têm gerado solúvel fluorescente MHC de classe I e, recentemente, MHC classe II tetrâmeros peptídicas /ESO, permitindo a detecção directa , a fenotipagem e o isolamento de células T específicas do ESO [17], [18]. Usando MHC de classe II /ESO tetrâmeros de péptidos para avaliar específicas

+ células T CD4 + em pacientes imunizados com uma proteína ESO recombinante administrado com Montanide ™ ISA 51 e GpG 7909, que demonstraram que a induzida pela vacina específica-ESO CD4

+ As células T são

células H1 T predominantemente, são detectados

ex vivo

entre memória (CD45RA

-) células, incluem tanto a memória central (CCR7

+) e memória efetoras (CCR7

-) populações e não incluem proporções significativas de Treg [16], [17], [18]. Estudos recentes, contudo, sugerem que, em contraste com o ESO-específica CD4

+ células T activadas por meio da vacinação, o ESO-específica CD4

+ de células T em pacientes com respostas imunitárias espontâneas pode conter proporções significativas de Treg [19 ] e que as proporções elevadas de circulando Treg em pacientes com câncer pode prejudicar a sua capacidade de resposta ao ESO vacinas [20]. Para responder a estas preocupações, neste estudo, utilizamos abordagens funcionais, juntamente com MHC Classe II /tetramers peptídicas ESO para avaliar células específicas-ESO entre convencional e Treg CD4

subconjuntos + de células T em linfócitos de câncer epitelial de ovário em circulação pacientes (EOC), com respostas imunitárias espontâneas detectáveis ​​a ESO

resultados

Avaliação de memória convencional CD25

-. e CD25 regulamentar

+ FOXP3

+ CD4

+ subconjuntos de células T em linfócitos de dadores saudáveis ​​e pacientes EOC

Entre memória CD4

+ células T de vários subgrupos podem ser distinguidos com base na expressão de CD25 e CD127 circulantes. Considerando convencional CD4

células + T são CD25

-CD127

+, Treg são CD25

+ CD127

– e FOXP3

+ (Figura 1A). Uma terceira população, CD25

-CD127

-, contém recentemente activado e-IL-10 produzindo CD4

+ células T [21]. Considerando CD25

-CD127

+ células são a maioria da memória

células CD4 + T circulantes, Treg e CD25

-CD127

– populações estão presentes em proporções muito menores e mais ou menos equivalentes, o que representa cada um cerca de 5%. Como os relatórios anteriores indicaram que populações Treg podem ser aumentadas em linfócitos de doentes com cancro em circulação, em comparação com indivíduos saudáveis, comparou-se a proporção de células T CD4 subconjuntos

+ de células T em linfócitos circulantes de pacientes EOC de dadores saudáveis. Nós não, no entanto, para detectar quaisquer diferenças significativas na proporção de Treg circulante em pacientes, em comparação com dadores saudáveis ​​(Figura 1B). Da mesma forma, a proporção de CD25

-CD127

– CD4

+ T células não diferiram significativamente entre pacientes e doadores saudáveis. Para caracterizar ainda mais CD4 subconjuntos

+ de células T no sangue circulante de pacientes EOC, foram isoladas los

ex vivo

, por citometria de fluxo separação de células, estimuladas los

in vitro

e avaliou a 12 dias mais tarde, as culturas quanto à sua capacidade para secretar citocinas diferentes. Como esperado, em ambos os pacientes e dadores saudáveis, CD25

– populações continham proporções significativamente maior de células que segregam IFN-γ em comparação com Treg (Figura 2). CD127

+ populações continha proporções mais elevadas de IFN-y secretoras de células do que CD127

– populações. Curiosamente, em comparação com dadores saudáveis, CD25

-CD127

– populações de doentes de cancro contidos proporções mais elevadas de IFN-y secretoras de células. Em contraste, a proporção de IL-17 ou células secretoras de IL-10-não foi significativamente diferente entre os doadores saudáveis ​​e pacientes de qualquer das populações.

. células T +

CD4 foram coradas com anti-FOXP3, -CD25, -CD45RA e anticorpos CD127 e analisadas por citometria de fluxo. A expressão de CD25 e CD127 define 3 populações de memória (CD45RA

-)

+ células T CD4: CD25 convencional

-CD127

+ e CD25

-CD127

– e Treg CD25

+ CD127

– (gráfico de pontos à esquerda, números correspondem à proporção de cada subconjunto entre memória CD4

+ células T). Os histogramas mostram a expressão de FOXP3 na memória definido subconjuntos CD4

+ T-cell. B. A proporção de CD25 convencional

-CD127

+ e CD25

-CD127

– e Treg CD25

+ CD127

– subconjuntos, definido em A, entre memória CD4

+ células T de dadores saudáveis ​​(HD, n = 27) e pacientes (P, n = 18).

Ex vivo

memória -sorted convencional, CD25

-CD127

+ e CD25

-CD127

– e Treg, CD25

+ CD127

-, as populações de dadores saudáveis ​​(HD, n = 12) e pacientes (P, n = 12) foram estimuladas

in vitro

e 12 dias as culturas foram avaliadas quanto a IFN-γ, IL-10 e IL-17, após a estimulação com PMA e ionomicina, num ensaio de secreção de citoquina intracelular 4-h, e analisadas por citometria de fluxo. gráficos de pontos para um doador são mostrados em A e dados para todos os doadores saudáveis ​​e pacientes estão resumidos na B. As análises estatísticas foram realizadas utilizando um bicaudal

t

-teste.

circulantes específicos ESO-CD4

+ células T de pacientes Edc com respostas imunitárias espontâneas são encontrados em CD25

-CD127

+ e CD25

-CD127

– populações, mas não no CD25

+ CD127

-FOXP3

+ Treg e secretar IFN-γ mas não de IL-17 ou IL-10

de acordo com estudos anteriores, cerca de 40% de tumores ovarianos expressar ESO e cerca de 30% dos pacientes portadores de tumores EOC ESO-expressando desenvolver respostas específicas espontânea de anticorpos (Ab) [22]. Foram avaliadas as respostas AB para ESO em uma coorte de 110 pacientes EOC (Tabela 1) no soro dos pacientes por ELISA como descrito [14]. Detectámos respostas significativas ao Ab ESO em 8 (7%) dos pacientes (Figura 3A) com títulos que variam entre 1:500 e 1:50000 (Figura 3B). Pacientes com detectável ESO Ab apresentados com alto grau (II, III) tumores em estádio III ou IV e com histologia serosa (Tabela 1). Para 6 pacientes, as PBMC estavam disponíveis para análise. Para avaliar células ESO específicos de dentro memória de circulação definido CD4

+ subconjuntos de células T destes pacientes, foram isoladas los

ex vivo

por citometria de fluxo de células de triagem, e estimulou-os com um pool de péptidos sobrepostos longos abrangendo a sequência ESO, como descrito [16]. Doze dias depois, estimuladas aliquotas das culturas com o conjunto de peptídeos ESO e avaliada a produção de citocinas específicas por coloração intracelular. Detectamos proporções significativas de células produtoras de IFN-γ em resposta ao ESO em culturas de circular CD25

-CD127

+ e CD25

-CD127

– populações CD4

+ de células T, mas não de Treg (Figura 4A e 4B). Em contraste, foi encontrado apenas baixas proporções de células que secretam IL-10 ou IL-17 em resposta ao ESO em qualquer das populações. Juntos, estes resultados indicam que a grande maioria dos circulante

+ células T CD4 + específicas-ESO nestes pacientes eram t

tipo H1 células IFN-γ secretoras, CD25

-, tanto CD127

+ e CD127

-, e não eram detectáveis ​​em CD25

+ FOXP3

+ Treg

a.. A presença de Ab-ESO específica nos soros dos pacientes foi avaliada por ELISA. Os soros foram inicialmente avaliados numa diluição 1:100 em reso-revestidos ou não revestidos em placas de controle. Os soros foram classificados como ESO Ab

+ Se a densidade óptica valores (DO) obtidos em placas de reso-revestidos foram ambos, pelo menos, três dobras maiores do que os obtidos para a mesma amostra em placas não revestidas e mais elevada do que a média + 6xSD de OD Os valores obtidos com o soro de indivíduos saudáveis ​​em placas de reso-revestido (n = 53, média + 6xSD = 750, dados não mostrados). B. diluições em série de ESO Ab

+ soros foram testados em placas reso-revestidos. título do soro foi calculada como a diluição do soro produzindo 50% do OD máxima

Memória convencional, CD25

-CD127

+ e CD25

-CD127

-., e Treg, CD25

+ CD127

-, populações foram classificadas

ex vivo

de CD4

+ células T do ESO Ab

+ pacientes e estimulou

in vitro

com um conjunto de péptidos que se sobrepõem de comprimento abrangendo a sequência de comprimento completo ESO. culturas A e B. Dia 12 foram avaliadas para o IFN-γ, IL-10 e IL-17, a produção num ensaio de coloração de citocinas intracelulares 4-h a seguir à estimulação na ausência ou na presença do péptido piscina ESO. gráficos de pontos para um paciente são apresentados em A e os dados obtidos para todos os pacientes estão resumidos na B. C e D. Dia 12 culturas foram coradas com DR52b /ESO

119-143 (NA017, NA093 e NA097) ou DR4 /ESO

119-143 (NA304) tetrâmeros e anti-CD4 mAb e analisados ​​por citometria de fluxo. Os gráficos de pontos para um paciente são apresentados na C e de dados para todos os doentes estão resumidos na D.

Avaliação das células T específicas em células CD4-ESO

+ subconjuntos utilizando MHC de classe II /tetrâmeros peptídicas ESO

Uma ressalva da configuração experimental utilizado acima foi a de que, enquanto as células específicas do ESO foram detectadas com base na sua capacidade para secretar especificamente IFN-γ em resposta a ESO, Treg secretado pouco IFN-γ, mesmo após a estimulação com PMA /ionomicina (Figura 2). Para ultrapassar as limitações impostas pela detecção de ESO-específica CD4

+ células T com base em ensaios funcionais, nós desenvolvemos recentemente fluorescente solúvel de MHC de classe II tetrâmeros que incorporem um epitopo imunodominante do ESO, correspondente ao péptido 119-143 [17 ], [18]. Mostrámos que a MHC de classe II /ESO

119-143 tetrâmeros manchar

+ células T CD4 + específicas-ESO em linfócitos de pacientes imunizados com uma vacina recombinante ESO com alta eficiência e especificidade circulantes, permitindo a sua visualização directa entre poliespecífico CD4 culturas

+ T-cell. Porque 4 pacientes com respostas imunitárias espontâneas para ESO expressa MHC class alelos II para os quais os tetrâmeros adequados estavam disponíveis (DR52b e DR4), avaliamos células específicas-ESO T nestas culturas por coloração tetrâmero (Figura 4C e 4D). Detectamos proporções significativas de ESO tetrâmero

+ células em culturas de CD25

-CD127

+ populações de todos os pacientes, bem como naqueles do CD25

-CD127

– populações (em 3 pacientes em frequência significativamente aumentada em comparação com o CD25

-CD127

+ fracções). No entanto, em todos os casos, não conseguimos detectar proporções significativas de tetrâmeros

+ células em culturas Treg. Além de CD25

+ CD127

-FOXP3

+ Treg, supressiva CD4

+ T células também foram descritas em alguns estudos, entre outras populações [21]. Para avaliar se, independentemente do seu fenótipo, ESO-específica CD4

+ células T exibida funções supressoras, foram isoladas a partir deles as culturas por tetramer- ou triagem celular de IFN-γ-guiada e avaliada de forma funcional num ensaio de supressão conforme descrito [23], [24]. Como esperado, as populações FOXP3

+ Treg avaliada simultaneamente como controlos internos suprimido eficazmente o crescimento de células de resposta. Em contraste, as células específicas do ESO isolado de ambos CD25

-CD127

+ e CD25

-CD127

+ culturas foram FOXP3

-. E não foram supressora (Figura 5)

células específicas-ESO foram isolados a partir de CD25 estimulada por péptido

-CD127

+ e CD25

-CD127

– culturas de células CD4

+ de células T (Figura 4) por tetramer- guiada (NA017) ou-IFN-γ guiada (NA114) citometria de fluxo de células de triagem e expandiu

in vitro

. As culturas policlonais resultantes continham 80% de células específicas-ESO. culturas policlonais específicos-ESO A., bem como culturas policlonais do ESO

– fração de controle e culturas de

in vitro

-expanded memória convencional CD4

+ células T (M) e memória Treg ( MTreg), isolado

ex vivo

de indivíduos saudáveis, foram coradas com mAb e analisados ​​por citometria de fluxo específicos de FOXP3. Os números em gráficos de pontos corresponde à intensidade média da fluorescência (IMF) de coloração FOXP3. B. A actividade supressora de-ESO específica e controlar populações policlonais foi avaliada por co-cultura com CFSE marcado convencional CD4

+ células T, a um respondedor: rácio supressor de 01:01, na presença de monócitos e irradiados PHA. Os gráficos de pontos mostram o perfil CFSE-diluição na ausência da população de teste (à esquerda) e na presença das populações de ensaio indicados. Os números em histogramas correspondem a porcentagem de células não divididas. Os resultados correspondentes à supressão calculados% são apresentados para todas as populações testadas.

Ex vivo

avaliação do ESO-específico em circulação

células CD4 + T utilizando MHC classe II /ESO tetrâmeros

Para confirmar a distribuição de células específicas do ESO em CD4 subconjuntos

+ de células T em pacientes com respostas imunitárias espontâneas e mais avaliar as suas proporções e fenótipo, nós manchado total circulante CD4

+ T células de DR52b

+ pacientes

ex vivo

com tetrâmeros ESO em combinação com mAb dirigidos contra marcadores que identificam os estágios de diferenciação distintas de CD4

células + T. Como mostrado anteriormente [17], o ESO tetrâmero

+ células não foram detectáveis ​​em células CD4

+ células T de dadores saudáveis. Em contrapartida, eles foram claramente detectadas

ex vivo

na circulação de memória CD4

+ células T dos pacientes (Figura 6A). Tetrâmero

+ células circulantes

+ células T CD4 dos pacientes foram uniformemente CD25

– e foram encontrados entre ambos CD127

+ e CD127

– populações, mas não eram detectáveis ​​entre CD25

+ CD127

– Treg (Figura 6B). Assim, à semelhança do que já anteriormente observada em pacientes imunizados com uma vacina recombinante ESO, direta

ex vivo

coloração com tetrâmeros ESO confirmou a falta de proporções significativas de ESO-específica CD4

+ células T na circulação Treg de pacientes com respostas imunológicas espontâneas para o antigénio. A frequência de circulação de tetrâmeros ESO

+ células nos pacientes com respostas espontâneas, foi, em média, de 1:25000, cinco dobras menor que a encontrada em pacientes vacinados (Figura 6A) [17]. No entanto, o ESO tetrâmero

+ células em pacientes com respostas espontâneas continham proporções inferiores de CD127

– células, em comparação com os de pacientes vacinados (Figura 6B). Além disso, em contraste com o último, que continha, em média, proporções, mais ou menos comparáveis ​​de CCR7

+ e CCR7

– células, bem como uma grande maioria de CD27

+ células, ESO tetrâmero

+ células em pacientes com respostas espontâneas foram principalmente CCR7

– e continha aumento da proporção do CD27

– células, de acordo com um fenótipo mais diferenciado (Figura 6C). Finalmente, para excluir a possibilidade de que a seleção de ESO Ab

+ pacientes pode ter selecionado para pacientes com baixa ou ausente Treg específicas do ESO, avaliou + células T

ex vivo

CD4 do ESO Ab

– DR52b

+ pacientes (n = 23). No entanto, não conseguimos detectar níveis significativos de ESO tetrâmero

+ nestes doentes (dados não mostrados).

CD4

+ células T de DR52b

+ dadores saudáveis ​​(HD) e pacientes foram coradas

ex vivo

com DR52b /ESO

119-143 tetrâmeros e mAb específico para CD45RA, CD25, CD127, CCR7 e CD27 e analisadas por citometria de fluxo. parcelas A. Dot para um HD e um paciente EOC são mostrados. Os números em gráficos de pontos correspondem ao percentual de tetrâmero

+ células entre CD45RA

– células de memória. Os dados para todas as doentes do EOC com respostas imunitárias espontâneas de ESO (S) são mostradas em comparação com a frequência (média ± SD) de ESO tetrâmero

+ células em amostras pós-vacinais de pacientes que receberam uma vacina ESO recombinante (V) [17]. parcelas B. Dot mostrar a expressão de CD25 e CD127 em células de memória totais e em tetrâmero

+ células de um paciente EOC. Os dados correspondentes à proporção do convencional, CD25

-CD127

+ e CD25

-CD127

– e Treg, CD25

+ CD127

-, populações dentro tetrâmero

+ células para todos os pacientes EOC (S) encontram-se resumidos e comparados com a proporção (média ± SD) de estas populações em tetrâmero induzida pela vacina

+ células (V). parcelas C. Dot mostrar a expressão de CCR7 e CD27 em células de memória totais e em tetrâmero

+ células de um paciente EOC. Os dados correspondentes à proporção de CCR7

+, CCR7

-CD27

+ e CCR7

-CD27

– populações dentro tetrâmero

+ células para todos os pacientes EOC (s) estão resumidos e comparada com a percentagem (média ± SD) de estas populações em tetrâmero induzida pela vacina

+ células (V). As análises estatísticas foram realizadas utilizando um padrão de duas caudas

t

-teste.

Discussão

respostas imunes fortes a tecidos cancerosos são potencialmente capazes de prevenir a progressão da doença. Uma vez que estas respostas, muitas vezes dirigidos contra antigénios não exclusivamente específicos de tumores, mas também contra a diferenciação ou outros auto-antigénios, têm o potencial de prejudicar consideravelmente tecidos normais, as redes imunorreguladoras sólidas estão no local [25]. Em particular, CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg, envolvido na manutenção da homeostase do tecido e auto-tolerância, acredita-se desempenhar um papel importante na imunidade anti-cancro de amortecimento. Estudos anteriores relataram aumento proporções de Treg na circulação de pelo menos parte dos doentes com tumores sólidos [8], [9], bem como acúmulo de CD25

+ FOXP3

+ Treg em locais de tumor [8], [26], especialmente em estágios avançados da doença, e estabeleceram uma correlação entre a sua frequência e os resultados clínicos [3]. Na base destes resultados, abordagens para eliminar Treg foram concebidos, e que já estão a ser avaliados em ambientes clínicos, embora eles estão relacionados com o risco de desencadear auto-reactividade [27], [28], [29].

neste estudo, abordámos a presença e distribuição de CD4

+ células T específicas para o ESO antígeno do tumor, do grupo do câncer /testículo [10], [30], [31], no prazo de circulação CD4

+ subconjuntos de células T de pacientes EOC. Usamos uma combinação de abordagens funcionais e MHC classe II tetrâmeros incorporando um peptídeo imunodominante, ESO

119-143, que recentemente desenvolvido [17], [18]. Não foram encontradas diferenças significativas na proporção de Treg entre os linfócitos de pacientes EOC circulando em comparação com os doadores saudáveis. Da mesma forma, não houve aumento significativo na proporção do total em circulação CD4

+ CD25

-CD127

– as células T, uma população que contém recentemente activada

células CD4 + T e tem sido proposto para conter IL-10 secretoras de células Tr1 em dadores saudáveis ​​[21], mas não foram avaliados em doentes com cancro anteriores a este estudo. Assim, enquanto alterações no compartimento Treg circulante pode de fato ocorrer em alguns pacientes com câncer, não encontramos grandes alterações em nosso grupo de pacientes EOC. É digno de nota, no entanto, que os pacientes avaliados no presente estudo tinham recebido quimioterapia de primeira linha, que podem reduzir temporariamente Treg [32], apesar de terem sido avaliado em vários tempos, mas pelo menos um mês, após a cessação do tratamento. No entanto, a avaliação do estado imunológico desta população, no que diz respeito às respostas anti-tumorais, é mais relevante para a concepção de tratamentos de base imunológica.

Ao avaliar as respostas específicas do ESO em fazer circular CD4

+ subpopulações de células T de pacientes Edc com respostas imunitárias espontâneas, classificado

ex vivo

e estimulado

in vitro

com peptídeos do ESO, detectamos proporções significativas de células produtoras de IFN-γ em resposta a ESO, mas não há células IL-10 ou IL-17, secretoras, indicando que a maioria das ESO específico para CD4

+ células T foram sub T

H1 efectores. Como este estudo especificamente dirigida T

células H1 e Treg no EOC, que limitou a análise de citocinas mais relevantes, nomeadamente IFN-γ, IL-10 e, por causa da relação relatada entre Treg e T

H17 células , a IL-17. Será no entanto de interesse, em estudos futuros, para dirigir a produção de citocinas adicionais, tais como IL-4 ou IL-13, pelo ESO específico de CD4

+ células T. Em conformidade com a conclusão de que as células específicas ESO-CD4

+ T isolados a partir das culturas são células efectoras, eles não exibem funções supressoras significativas. Além disso, não se detectou células específicas-ESO em fazer circular Treg de pacientes com respostas imunitárias espontâneas ao antigénio através de coloração, com classe II do MHC /ESO tetrâmeros, de definido convencional e subpopulações + de células T

Treg CD4 isolado

ex vivo

por citometria de fluxo separação de células, bem como pela

ex vivo

coloração direto com tetrâmeros. Em desacordo com os nossos dados, estudos anteriores têm relatado o isolamento de específico-ESO CD4

células + T com funções supressoras de linfócitos de pacientes circulando com melanoma avançado [19], [33]. Assim, enquanto nossos dados não exclui a existência de Treg específicas do ESO, que implicam que o último não são comumente encontrados na circulação de CD4

+ células T de pacientes EOC. É também digno de nota que, consistente com os nossos resultados, estudos em modelos de ratinho foram examinados na presença de Treg em células T específicas para o antigénio com tetrâmeros e não conseguiu detectar a ligação de Treg-tetrâmero [34], [35].

Usando MHC classe II /ESO

119-143 tetramers

ex vivo

, poderíamos comparar diretamente

+ células T CD4 específicas-ESO surgindo espontaneamente em pacientes com aqueles induzidos pela vacinação com um recombinante proteína ESO (Reso) administrado com Montanide ™ e CpG [16]. Vale ressaltar que, até o recente desenvolvimento de MHC Classe tetramers /péptido II, tem sido difícil avaliar antígeno-específica CD4

+ T células

ex vivo

devido à sua geralmente de baixa frequência. Este é realmente o primeiro relatório caracterizando + células T

CD4 específico para um antígeno do câncer /testículo, em pacientes com câncer e respostas imunes espontâneas

ex vivo.

Descobrimos que a frequência de CD4

+ células T específica para ESO foi significativamente mais baixa em pacientes com respostas imunitárias espontâneas em relação ao encontrado em pacientes vacinados. Além disso, o fenótipo de naturalmente decorrente tetrâmero ESO

+ células era mais diferenciada, em comparação com os seus homólogos induzidos pela vacina, contendo proporções maiores de CCR7

– e CD27

– células. Estudos anteriores explorando a correlação entre a qualidade da memória CD4

+ respostas das células T induzidas por agentes patogénicos ou vacinas e seu fenótipo, sugeriram que a resposta de memória de proteção deve incluir não só efetores (CCR7

-) mas as células de memória em estágios de diferenciação anteriores, ou seja, a memória central (CCR7

+) e memória de transição (CCR7

-CD27

+) células T [36], [37]. Com base neste conceito, os nossos resultados sugerem que

+ T células específicas-ESO CD4 induzida através da imunização de pacientes com câncer com a vacina Reso são susceptíveis de ser não apenas quantitativamente mas também qualitativamente superiores aos que surgem durante as respostas imunitárias espontâneas, que ainda incentiva o uso de vacinas baseadas-ESO em pacientes com tumores ESO-expressam.

em conjunto, estes resultados sublinham o potencial de MHC classe II /ESO tetrâmeros para a detecção inequívoca, quantificação e fenotipagem de ESO-específica CD4

+ células T, não só após a vacinação, mas também para avaliar as respostas imunitárias que surgem naturalmente em pacientes com tumores que expressam o antigénio. A continuação da aplicação desta abordagem para a caracterização de células T CD4

+ células T específicas para o ESO e outros antigénios tumorais em circulação e em locais de tumores de pacientes com cancro, tanto ao longo do curso natural da doença e durante o tratamento, provavelmente contribuem para promover significativamente a nossa compreensão do seu papel e contribuição na imunidade ao câncer.

Materiais e Métodos

amostras

pacientes e doadores saudáveis ​​e avaliação do específico do ESO respostas de anticorpos

Sera e as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram coletadas de pacientes atendidos no EOC CLCC René Gauducheau e de indivíduos saudáveis ​​mediante consentimento informado por escrito e aprovação pelo Institutional Review Board (Comité de Protecção das Personnes Ouest IV – Nantes). O anticorpo (Ab) respostas a ESO foram avaliadas por ELISA, tal como descrito anteriormente [14], [16], utilizando proteína recombinante ESO (reso) produzida em E. coli.

ex vivo

avaliação fenotípica de CD4

+ subconjuntos de células T e citometria de fluxo de células de triagem

+ células T

CD4 foram enriquecidas por selecção positiva a partir de PBMC de indivíduos saudáveis ​​e pacientes EOC por célula magnética triagem (Miltenyi Biotec ), coradas com anticorpos monoclonais (mAb) específicos para CD4 (BD Biosciences), CD8 (BD Biosciences), CD45RA (BD Biosciences), CD25 (Beckman Coulter), CD127 (eBioscience) e FOXP3 (eBioscience), como indicado, e analisados por citometria de fluxo utilizando um LSRII (BD Biosciences). Para

ex vivo

citometria de fluxo de células de triagem, enriquecida CD4

células + T foram coradas com anti-CD4, -CD8, -CD45RA, -CD25 e -CD127 mAb. Depois de gating em CD4

+ CD8

-CD45RA

– linfócitos, as células foram separadas em CD25 memória

-CD127

+, CD25

-CD127

– e CD25

+ CD127

-Treg populações a alta pureza ( 97%). utilizando um FACSAria (BD Biosciences)

In vitro

estímulo e avaliação funcional de CD4

+ subpopulações de células T

total de CD4

+ células T ou

ex vivo

ordenadas de memória convencional e Treg CD4

+ populações de células T foram estimuladas

in vitro

com um pool de péptidos sobrepostos cobrindo a sequência de comprimento ESO [16] ou com o anti-CD2 /3 micropérolas /28-revestidas (Miltenyi Biotec), na presença de APC autólogas irradiadas e foram cultivadas na presença de IL-humano recombinante 2 (Chiron). Dia 12 a 14 culturas foram avaliadas num ensaio de coloração de citocinas intracelulares 4-h utilizando mAb específico para o IFN-γ (BD Biosciences), IL-10 (BD Biosciences) e IL-17 (eBioscience), após a estimulação com ambos o péptido ESO piscina ou PMA (100 ng /mL, Sigma Aldrich) e ionomicina (1? g /mL, Sigma Aldrich), como indicado, e analisadas por citometria de fluxo (LSRII).

de MHC de classe II /péptido ESO tetrâmero coloração

fluorescente a HLA-DR52b /e HLA-DR4 /ESO

tetrâmeros 119-143 foram geradas como previamente descrito [17], [18]. ESO-CD4 estimulada

+ culturas de células T foram incubadas com tetrâmeros a uma concentração final de 3 ng /mL durante 1 h a 37 ° C e em seguida coradas com mAb específico para CD4 e analisadas por citometria de fluxo (LSRII). Para

ex vivo

enumeração e fenotipagem de células específicas, o total de CD4

T + células enriquecidos a partir de PBMC por célula magnética triagem foram descansado durante a noite, incubadas com tetrâmeros (3 ug /ml) durante 2 h a 37 °