Abstract

Uma vez que mudanças nas membranas basais são os indicadores críticos para diferenciação normal, pré-cancerosas e tecidos do cólon cancerosas, visualização direta destes sinais é essencial para o diagnóstico precoce e tratamento do cancro do cólon. Aqui, apresentamos que geração de segundo harmônico (SHG) microscopia pode sondar as mudanças de membranas basais em diferentes estágios do câncer de cólon. Nossos resultados também mostram a capacidade de utilizar as análises quantitativas de imagens para quantificar essas mudanças em diferentes estágios do câncer. Estes resultados sugerem que a microscopia SHG tem o potencial na imagiologia etiqueta livremente as mudanças de membranas basais para distinguir entre os tecidos de forma eficaz do cólon normais, pré-cancerosas e cancerosas. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira demonstração da dinâmica de mudanças na membrana basal em diferentes estágios do câncer de cólon usando fonte inteiramente intrínseca de contraste

Citation:. Zhuo S, Yan J, Chen G, Shi H, Zhu X , J Lu, et al. (2012) Imagiologia Label-Livre de Basement Membranas diferencia normais, pré-cancerosas e cancerosas do cólon tecidos por segundo harmônico Geração de Microscopia. PLoS ONE 7 (6): e38655. doi: 10.1371 /journal.pone.0038655

editor: Mitsunobu R. Kano, da Universidade de Tóquio, Japão

Recebido: 13 Janeiro, 2012; Aceito: 08 de maio de 2012; Publicação: 08 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Zhuo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O projeto foi apoiado pelo Programa de Changjiang Estudiosos e Equipe de Pesquisa inovativa em University (Grant No. IRT1115), a National Science Foundation Natural da China (Grant nos. 60908043, 30970783, 81101209), e da Fundação de Ciência Natural da província de Fujian (Grant nos . 2011J01341, 2010J01136, 2010J01321). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de cólon é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em humanos [1]. Em geral, é facilmente tratada se diagnosticada em uma das fases de pré-invasivos [2], [3]. No entanto, a detecção de lesões precoces é ainda um desafio. Com o desenvolvimento do cancro do cólon, células malignas alterar as membranas basais (interfaces de cripta e lâmina), tais como as variações no tamanho da membrana basal e da densidade, a perda da membrana basal [4], [5]. As alterações na membrana basal estão entre os indicadores mais importantes para o desenvolvimento do cancro do cólon [5], [6]. No entanto, esses sinais de alerta até agora têm sido apenas detectável por exame histológico de amostras de biópsia [4], [7]. Assim, o desenvolvimento de novas e não invasivo

in situ

modalidade de imagem para sondar estes sinais de aviso é de grande importância médica.

mucosa do cólon contém a cripta, a membrana basal, ea lâmina própria, como mostrado na Fig. 1. Ele também é visto na Fig.1 que a seção do

en face

da mucosa do cólon pode, simultaneamente, observar a cripta, a membrana basal e da lâmina própria. Desde a cripta consiste principalmente de epitélio colunar e células caliciformes que não é eficaz na geração de sinais de geração de segundo harmônico (SHG) e lâmina própria é composta principalmente de colágeno, que é capaz de emitir sinais de SHG fortes [8] – [10], microscopia SHG podem ser úteis para sondar as alterações de membrana basal que não são acessíveis para outras modalidades de imagem. microscopia de SHG é uma técnica óptica não-linear e tem a vantagem de ser livre de etiqueta, inerente resolução tridimensional, near-infrared de excitação para a penetração óptica superior, inferior photodamage, e capazes de fornecer informações quantitativas [11] – [15]. Até agora, não há relatos de testar o potencial desta técnica para a etiqueta-livremente visualizar as membranas basais como indicadores para a diferenciação normal, pré-cancerosas e cancerosas tecidos do cólon, e é isso que nos motivou a realizar este trabalho usando esta técnica.

resultados

resultados Patologia

dos 72 espécimes de biópsia de cólon fotografada, 20 foram diagnosticados como normal, 28 com adenoma, e 24 com adenocarcinoma. Para a análise estatística, as amostras de tecido foram divididas em caso normal (n = 20), pré-câncer (adenoma, n = 28) e câncer (adenocarcinoma, n = 24).

SHG Images of

para sondar as alterações das membranas basais em diferentes fases do cancro do cólon, o representante en face imagens SHG do normal, pré-cancerosas e cancerosas são tecidos do cólon, respectivamente, mostrados na Fig. 2. Como esperado, técnica de imagem SHG pode também visualizar o contorno das membranas basais (círculos vermelhos). Vê-se na fig. 2 que as grandes diferenças morfológicas no contorno das membranas basais são observados em diferentes estágios do câncer de cólon. No caso normal, um arranjo de favo de mel das membranas basais regulares de forma redonda com tamanho uniforme é observada. Na pré-câncer, as membranas basais em forma tubular com tamanho maior e uma densidade populacional inferior são obtidas em comparação com caixa normal. No câncer, as membranas basais encontrados em casos normais estão ausentes.

Análise Quantitativa das membranas basais

A Tabela 1 mostra a média e SD do comprimento círculo de membrana basal e da população densidade de membranas basais para tecidos cólon normal, pré-cancerosas e cancerosas. Em detalhe, o comprimento do círculo da membrana basal em normal é 342,7 ± 27,2 uM (n = 60 áreas de 20 biópsias), em pré-cancro é 695,8 ± 79,1 uM (n = 84 áreas de 28 biópsias), e no cancro é 1767,8 ± 166,3 ^ M (n = 72 áreas de 24 biópsias). Além disso, a densidade populacional das membranas basais em normal é de 103,2 ± 10,6 /mm

2 (n = 60 áreas de 20 biópsias), em pré-câncer é 27,1 ± 6,3 /mm

2 (n = 84 áreas de 28 biópsias), e no cancro é de 0,3 ± 1,2 /mm

2 (n = 72 áreas de 24 biópsias). Estes resultados representam o comprimento círculo de membrana basal ea densidade populacional de variáveis ​​membranas basais, que mostrou diferenças significativas (

P Art 0,05) entre o normal, pré-cancerosas e cancerosas categorias tecidos com base em testes Rank Sum unparired Wilcoxon .

Discussão

Este trabalho apresenta que a microscopia SHG pode efetivamente sondar as mudanças de membranas basais em diferentes estágios do câncer de cólon. Em particular, SHG microscopia permite a identificação de duas características morfológicas (o comprimento do círculo da membrana basal, a densidade de população de membranas basais), que mostram diferenças significativas em diferentes fases do cancro do cólon. Estas observações são constituídas com resultados imuno-histoquímica (mostrado na Fig. 3), e também confirmam o facto de [4], [16] que, antes de o cancro se tornar invasivo, em fases conhecidas como pré-cancro, as células malignas alterar o contorno da membrana basal, mas não fazer destruir a membrana basal; como o cancro se tornarem células invasoras, malignas (não há sinais de SHG) substituir as fibras de colágeno, levando à perda da membrana basal.

Como se observa, microscopia de SHG é capaz de imagiologia etiqueta livremente as mudanças de membranas basais em diferentes estágios do câncer do cólon e, como tal, pode agir como um

in situ

ferramenta histológica que está livre da obrigação de rotulagem de métodos convencionais. Além disso, com base em análises a imagem, fomos capazes de obter alguma informação quantitativa em diferentes estágios do câncer. Assim, microscopia SHG dá-nos tanto um morfológica, bem como quantitativa, pela qual ferramenta para sondar as alterações das membranas basais em diferentes fases do cancro do cólon. O importante desta capacidade resulta do facto de que as alterações de membrana basal desempenham um papel importante no desenvolvimento do cancro do cólon [5], [6], e estas alterações têm até agora só foi detectável por exame histológico de amostras de biópsia [4], [7]. microscopia SHG torna possível observar estas variações, e mensuração permite o tamanho da membrana basal e densidade populacional, a ser determinado. Estes resultados indicam a promessa de imagiologia SHG para clínicas, e como uma ferramenta de pesquisa biomédica para estudar a dinâmica de mudanças na membrana basal em diferentes estágios do câncer de cólon. Além disso, deve salientar-se que, embora as lesões inflamatórias não foram considerados no presente trabalho, SHG imagem deve ser capaz de distinguir entre lesões cancerosas e inflamatórias devido à perda das membranas basais em tecidos cancerosos. Neste contexto, vê-se que a microscopia SHG tem o potencial na visualização de etiqueta livremente as mudanças de membranas basais como indicadores para diferenciar tecidos cólon normal, pré-cancerosas e cancerosas.

Em conclusão, este trabalho demonstra o potencial de microscopia SHG para rotular-livremente imagem as mudanças de membranas basais, incluindo o tamanho da membrana basal e densidade populacional, os indicadores importantes do desenvolvimento de câncer de cólon. Para nosso conhecimento, esta é a primeira vez para mostrar como a imagiologia de SHG pode ser usado para visualizar quantitativamente a dinâmica das alterações na membrana basal em diferentes fases do cancro do cólon. No trabalho futuro, um estudo em grande escala serão realizados para determinar a sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo, valor preditivo positivo no que diz respeito à análise histológica tradicional. A vantagem desta técnica sobre procedimentos de diagnóstico convencionais é que os tecidos não são obrigados a passar por corte, parafina, ou congelamento-descongelamento processo, reservando assim o potencial de

in vivo

imagem. Com a capacidade de quantificar as mudanças da membrana basal, como mostrado no presente estudo, é previsível que uma endoscopia baseada em SHG [17] – [19] poderia facilitar e beneficiar

in vivo

estudos e diagnósticos nos anos para vir.

Materiais e Métodos

Tissue Specimen

Um total de 72 amostras de biópsia de cólon frescas foram obtidas de trinta e dois pacientes foram submetidos a biópsia endoscópica. Antes de estudar a participação, todos os pacientes assinaram termo de consentimento, e este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Tumor Fujian Provincial Hospital. A amostra da biópsia foi colocado no prato com fundo de vidro (Mattek, lamela: 0,085-0,13 mm) para geração de imagens SHG. Neste trabalho, a preparação de amostras e imagens SHG foram concluídas dentro de 1 hora após a biópsia endoscópica.

Imagem Instrumentação

microscopia SHG foi realizada utilizando um sistema óptico não-linear que tem sido descrito anteriormente [20] . Em breve, as imagens SHG foram adquiridas usando uma varredura a laser sistema de imagem microscópica comercial (Zeiss LSM 510 META, Jena, Alemanha) acoplado a um femtosegundo laser de Ti: safira (Coherent Mira 900-F) operando a 800 nm. O sentido de polarização da luz laser é a polarização horizontal. Uma objectiva de imersão em óleo (× 63 e NA = 1,4) foi utilizado para focar o feixe de excitação em amostras de tecido (potência média inferior a 15 mW) e também foi usado para recolher os sinais de SHG intrínsecas retroespalhadas. As imagens foram obtidas a 2,56 mS por pixel. A incidindo multa fase (HRZ 200 palco, Carl Zeiss) é usado para traduzir as amostras após a varredura xy das amostras para a obtenção de uma imagem de grande área, e para mudar a posição do foco para gravar várias seções ópticas.

histologia Análise

Depois de imagiologia de SHG, as amostras de tecido foram fixadas em formalina a 10% e preparado para exame patológico utilizando protocolos padrão. H seções e seções coradas por anticorpos primários para colágeno IV foram obtidos a partir de cada amostra E-manchado, e revistos por um patologista certificado

Quantificação das membranas basais

Para quantificar ainda mais as mudanças de. membranas basais em diferentes estágios do câncer de cólon, três 415 mm por 490 mm áreas retangulares em cada biópsia foram selecionados para análise quantitativa. Neste trabalho, foram realizadas duas análises. Primeiramente, medimos o comprimento círculo de membrana basal. Além disso, para melhor representar este valor, se houver uma perda de membranas basais, o comprimento do círculo da membrana basal foi definida como o comprimento da circunferência da secção rectangular seleccionado. Em segundo lugar, calculou-se o número total das membranas basais por unidade de área, isto é, a densidade de população de membranas basais. Neste trabalho, cada análise quantitativa foi realizada em todas as biópsias examinadas.

Análises Estatísticas

Os dados quantitativos foram resumidos com a média e desvio padrão (SD), mostrados como “significa ± SD” . as estatísticas de resumo para o comprimento círculo de membrana basal ea densidade populacional das membranas basais (relacionados com a determinação patológica) são provenientes de várias seções de cada uma das 72 amostras de biópsia de cólon retiradas de trinta e dois pacientes. para efeitos de análise estatística, o medições de secções individuais foram assumidas para constituir observações independentes. com os dados deste estudo (caracterizado por uma aparente homogeneidade de valores dentro das categorias de diagnóstico), técnicas estatísticas mais complexas foram consideradas desnecessárias, uma vez que não mudaria as médias amostrais, nem eles levam para maiores desvios padrão da amostra. neste trabalho, os testes de soma de postos de Wilcoxon foram realizados para determinar se existem diferenças significativas na duração círculo de membrana basal ea densidade populacional das membranas basais entre normal, pré-cancerosas e tecidos cancerosos (comparação não pareado ). testes não paramétrico de Wilcoxon foram escolhidos para a comparação não pareado por causa do pequeno tamanho da amostra. Exata

P

-Valores foram computados, e as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando os

P

-Valores foram inferiores a 0,05.

Reconhecimentos

os autores gostariam de agradecer ao editor e dois revisores anônimos por seus comentários construtivos, que eram muito útil para reforçar a apresentação deste documento.