Abstract

Temos realizado o primeiro estudo para determinar o potencial diagnóstico dos + monócitos intermediários CD14 ++ CD16, em comparação ao subconjunto pró-angiogênico do CD14 ++ CD16 + TIE2 + TIE2-expressando monócitos (ETM) em câncer. Estas populações de monócitos foram investigados por citometria de fluxo em voluntários saudáveis ​​(n = 32) e pacientes de carcinoma colorretal em com doença localizada (N = 24) ou metastático (N = 37). Nós ainda determinado níveis sanguíneos de citocinas associados à regulação de monócitos. Os resultados revelaram o subconjunto de monócitos intermediário a ser significativamente elevados em pacientes com câncer colorretal e mostrar as freqüências mais elevadas em doença localizada. A análise de regressão multivariada identificou monócitos intermediários como uma variável independente significativa na previsão de câncer. Com um valor de corte de 0,37% (monócitos intermediários de leucócitos totais) a sensibilidade e especificidade diagnóstica variou de 69% e 81%, respectivamente. Em contraste, os níveis de MET foram elevados no cancro localizada, mas não diferiu significativamente entre os grupos e nenhuma das citocinas correlacionadas com sub-populações de monócitos. De interesse,

in vitro

análises apoiou a observação de que os monócitos intermediários foram mais potente induzida pela principal em oposição às células cancerosas metastáticas que podem estar relacionados com o ambiente imunossupressor estabelecido no estágio avançado da doença metastática. Em conclusão, os monócitos intermediários em comparação com TIE2-expressando os monócitos são um indicador de diagnóstico mais sensível do cancro colorectal

Citation:. Schauer D, Starlinger P, Reiter C, Jahn N, Zajc P, Buchberger E, et al . (2012) Os monócitos Intermediário mas não TIE2-Expressando Os monócitos são um indicador de diagnóstico sensível para o cancro colorectal. PLoS ONE 7 (9): e44450. doi: 10.1371 /journal.pone.0044450

editor: Isaac Yang, UCLA, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de fevereiro de 2012; Aceito: 07 de agosto de 2012; Publicação: 04 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Schauer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Médico-Científico do prefeito da Cidade de Viena (https://www.wien.gv.at/gesundheit/einrichtungen/med-wiss-fonds/) de nenhuma concessão. 8064 emitida a T. Gruenberger. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os monócitos são considerados jogadores-chave na imunidade inata ; eles são responsáveis ​​por aproximadamente 8-10% dos leucócitos humanos e são caracterizados pela expressão do CD14 co-receptor para o receptor de tipo Toll 4 (RST4) [1]. Um pequeno subconjunto de monócitos do sangue periférico humano que co-expressa CD16 (receptor de Fcy III) foi identificado em 1988, [2] e verificou-se responsáveis ​​por cerca de 10% do total de monócitos do sangue [3]. Heterogeneidade dentro deste CD16 + população foi reconhecida posteriormente [4]. A existência de sub-populações de monócitos 3 com base na expressão diferencial de CD14 e CD16 foi recentemente implementada para a nova nomenclatura de monócitos que distingue entre o CD14 ++ CD16- “clássica”, o CD16 ++ CD14 + “intermediária” e CD14 + CD16 ++ “não clássica” de monócitos subconjunto [5]

estudos recentes sobre o gene perfis de expressão apontam para uma relação de desenvolvimento entre os três subgrupos com mudanças graduais na marcadores de superfície durante a maturação [6] -. [7]. Em comparação,

In vitro

cultura e maturação de monócitos do sangue resulta num aumento gradual na expressão de CD16 [8] – [9], que é desencadeada por citocinas, tais como MCP-1 (monócitos proteína quimioatractiva 1), TGF -β (factor de crescimento transformante beta), ou M-CSF (factor de estimulação de colónias de macrófagos) [10] – [12]. Além disso, as três subpopulações exibem diferenças funcionais distintos, com monócitos clássicos que mostram o maior potencial de fagocitose [6]. Em contraste, os monócitos não-clássicos têm uma baixa capacidade de fagocitose, mostram um comportamento patrulhamento ao longo das paredes dos vasos e reagir fortemente contra ácidos nucléicos e vírus [13]. O perfil de monócitos intermédios a expressão do gene foi ligado a eles ao antigénio processamento e apresentação, com respostas inflamatória a infecções bacterianas e lipopolissacarídeo (LPS) [6], [14]. De interesse, marcadores pró-angiogénicos tais como endoglina, receptor do factor de crescimento vascular endotelial 2 (VEGFR-2) e o receptor de TIE2 angiopoietina são sobre-expressos selectivamente no subconjunto de monócitos intermediário [6], [15].

ETMs (TIE2-expressando monócitos) ter sido inicialmente descrita no ratinho, para compreender uma população de monócitos pró-angiogénico que pode favorecer o crescimento do tumor por secreção parácrina de factores angiogénicos, tais como VEGF e factor de crescimento de fibroblastos básico [16]. ETMs circulantes são detectados no sangue periférico de seres humanos saudáveis ​​e em doentes com cancro, e são predominantemente encontrados na monócitos subconjunto intermédio [15], [17]. Eles respondem a angiopoietina-2 (Ang-2), uma proteína altamente expressa em tumores, através do receptor de TIE2 de superfície e o seu co-receptor Tie1 que pode promover a sinalização através do derramamento um fragmento solúvel Tie1 [18] – [19]. Assim, ETMs preferencialmente se acumulam nos locais de tumores, incluindo carcinoma colorectal, mas parecem estar ausente do tecido normal [17].

subgrupos de monócitos foram monitorados no sangue humano no contexto de doenças. No entanto, a maioria dos estudos não discriminar entre monócitos não-clássicas e intermediários, mas centrou-se na distinção entre CD16 subpopulações positivos e negativos. Os níveis elevados de CD16 + circulantes monócitos têm sido relatados para as condições patológicas, tais como sepsia [20], hepatite B crónica [21], doença arterial coronária [22], e cancro [23]. Assim, CD16 + monócitos mostraram potencial diagnóstico e prognóstico de doença inflamatória e maligno. Investigações mais recentes ilustram que a distinção adicional entre os monócitos não-clássicas e intermediários podem oferecer melhor informação. Em particular, os monócitos intermédios opostos aos monócitos não clássicos foram mostrados para ser elevado selectivamente em pacientes asmáticos graves [24] e para prever o resultado negativo nos doentes em elevado risco cardiovascular [25]. análises comparáveis ​​em pacientes com câncer estão em falta até à data.

Dada a visão nova para as propriedades distintas de monócitos intermédios e do fenótipo pró-angiogénico (pro-tumor) de ETMs a hipótese de que essas populações de monócitos pode possuir potencial diagnóstico no cancro colorectal (CRC). Nós esperado ETM e monócitos intermédios para ser significativamente elevados no sangue periférico de pacientes com CCR e para ser ainda mais aumentado na doença avançada. Para abordar este assunto foi realizado um estudo exploratório em 93 participantes, incluindo voluntários saudáveis, os pacientes CRC estágio I-III (câncer localizado colorretal) e CRC fase IV pacientes (cancro colorectal metastizado, mCRC). Foram caracterizados os sub-populações de monócitos intermédios e ETMs no sangue periférico em relação aos parâmetros clínicos, bem como para as citocinas associadas de monócitos, incluindo PQM-1, Ang-2, Tie1 solúvel (sTIE1), e vasculares factor de crescimento endotelial A (VEGF-A ). O subconjunto de monócitos intermediário em oposição a ETM foi encontrado para ser preferencialmente induzida nas fases iniciais da doença e constituir um romance, marcador sensível para o cancro colorectal.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Esta investigação não-intervencionista, clínico foi realizado de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. A análise das amostras de sangue foi aprovado pela “Comissão de Ética da Universidade Médica de Viena” institucional (# 331/2010 e nº 791/2010); todos os pacientes e voluntários saudáveis ​​Foi obtido consentimento

Paciente Collective

As amostras de sangue foram coletadas de três grupos de indivíduos:. voluntários saudáveis ​​(n = 32), doentes com cancro colorectal localizada (n = 24 ) e pacientes com câncer colorretal metastático (N = 37). A maioria dos pacientes com CCRm teve seu tumor primário ressecado e apresentado com metástases hepáticas por câncer colorretal. O sangue foi retirada antes do tratamento do paciente, isto é, em geral, um dia antes da cirurgia, ou imediatamente antes da quimioterapia neoadjuvante. O estágio da doença de acordo com a União de Controle do Câncer Internacional (UICC) foi determinada para todos os pacientes de CRC seguintes tomografia computadorizada e ressecção do tumor. voluntários saudáveis ​​foram aparentemente livres de doenças crônicas e inflamatórias.

Análise de monócitos Populações

ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) sangue total tratado foi processado à temperatura ambiente. A expressão de superfície de CD14, CD16 e TIE2 foi avaliada aplicando coloração de imunofluorescência direta seguido por um procedimento de lise-no-lavagem. Em resumo, 100 mL de sangue total foram incubadas com os seguintes anticorpos em concentrações saturantes durante 20 minutos: CD14-FITC (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EUA), CD16-PC5 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA) e de TIE2-PE (R D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EUA). Para eliminar os eritrócitos, foi adicionada uma solução de Versa Lyse (Beckman Coulter) durante 20 minutos. A citometria de fluxo foi realizada imediatamente com um citómetro FC500 e software CXP (Beckman Coulter). gating parâmetros de fluorescência foram estabelecidas utilizando os controlos de isotipo de anticorpo, e os valores acima do limiar de coloração negativa de 99% foram considerados positivos. Foram analisados ​​um total de 300.000 leucócitos. Intermediário monócitos (CD14 ++ CD16 +) foram identificados por expressão de alto nível de CD14 e foram distinguidos mais dos monócitos clássicos (++ CD16- CD14) por co-expressão de CD16. ETMs foram identificados dentro do subconjunto intermédio pela expressão concomitante de TIE2 (CD14 ++ CD16 + de TIE2 + células). estratégias de propagação são documentados na Figura S1. Os dados são apresentados na frequência% dos leucócitos do sangue e intensidade média de fluorescência (MFI). Conversão para contagens de células absolutas por ml de sangue foi baseado nas concentrações de leucócitos estabelecidos com um contador de células de sangue automatizado (Sysmex Corporation, Kobe, Japão).

Análise dos parâmetros sanguíneos Solúvel

Para a preparação de plasma , recolheu-se sangue em tubos pré-arrefecidos contendo citrato, teofilina, adenosina e dipiridamol, e foi processada em gelo dentro de 30 minutos, como previamente descrito [26]. As amostras de soro foram mantidos à temperatura ambiente durante 2 h para permitir a coagulação do sangue eficiente, seguido por centrifugação. As amostras de plasma e de soro foram armazenadas em alíquotas a -80 ° C para análise subsequente. Para a medição de Ang-2, sTIE1, MCP-1 (R D Sytems, Inc., Minneapolis, MN, EUA) e VEGF-A (Invitrogen Corp., Camarillo, CA, EUA) comercialmente kits ELISA disponíveis foram aplicados de acordo com a as instruções do fabricante. As amostras foram ensaiadas em duplicado, com um leitor de microplacas Varioskan (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA).

Cultura celular tumoral

linhas celulares de tumor SW480, SW620 e HT-29 foram obtidas a partir de American Type Culture Collection (LGC Standards, Bury, RU). As células foram semeadas a uma densidade de 4×10

5 por cm

2 em meio de crescimento com soro fetal de vitelo 10% (FCS). Após 24 horas, o meio foi mudado para meio basal endotelial 2 (Lonza, Walkersville, MD) com albumina de 0,1% de soro de bovino (BSA), e os sobrenadantes de células de tumor foram recolhidas depois de mais 24 horas em cultura. Os sobrenadantes foram centrifugados para remover detritos celulares e armazenado em alíquotas a -20 ° C.

In vitro

Estimulação de PBMCs

Sangue de voluntários saudáveis ​​foi desenhada em tubos de EDTA e As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas com Ficoll Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). As PBMC foram lavadas extensivamente para permitir a um mínimo de contaminação de plaquetas. 2×10

6 PBMC foram semeadas em cada poço de uma placa de 12 poços (Corning Inc., Corning, NY, EUA) e as células foram expostas ao sobrenadante da cultura de tumor. Uma vez que factores derivados do soro desencadear a indução da expressão de CD16 em monócitos de cultura, a adição de FCS foi mantido a um mínimo de 1% de monócitos suporte da sobrevivência. Após 24 horas de incubação, a fracção de células não-aderentes foi removido e as células aderentes foram colhidas por raspagem. As células foram coradas para CD14 e CD16 e fixados em formol para análise de citometria de fluxo.

Análise Estatística

Os cálculos estatísticos foram baseadas em testes não paramétricos utilizando o software SPSS versão 17 (SPSS Inc., Chicago , IL, EUA). As diferenças entre os três grupos de estudo foram avaliados por aplicação do teste de Wilcoxon-Mann-Whitney-U. Correlações entre os parâmetros investigados foram determinados por Spearman coeficiente de correlação. previsão de cancro por variáveis ​​independentes foi avaliada em análise uni e multivariada com regressão logística binária. A curva receiver operating characteristic (ROC) serviu para definir o valor de corte para o diagnóstico CRC. O P-valores apresentados são resultados de testes de dois lados. valores P ≤0.5 são considerados estatisticamente significativos. Boxplots são retratados sem valores extremos para melhorar a resolução.

Resultados

Intermediário monócitos são significativamente aumentados em pacientes CRC

Nós aplicamos citometria de fluxo para investigar a freqüência de subpopulações de monócitos na saúde indivíduos e pacientes com câncer colorretal. Os três coletivos de indivíduos saudáveis ​​(n = 32), pacientes com doença localizada de estágios I a III (n = 24) e pacientes com doença metastática em estágio IV (N = 37) mostrou distribuição por sexo comparáveis, mas diferenças na sua faixa etária ( tabela 1).

a população predominante de) monócitos clássicos (CD14 ++ CD16- eo total (CD14 contagem positivo) de monócitos não diferiu entre os grupos (Fig. 1). Em contraste, o intermediário (CD14 ++ CD16 +) monócitos eram 2,6 vezes aumentada em pacientes com CRC localizada em comparação com voluntários saudáveis ​​(p 0,001), variando a um nível mediano de 0,66% contra 0,25% do total de leucócitos de sangue, respectivamente. Em doença avançada, monócitos intermédios diminuiu novamente resultando em uma frequência média de 0,40% em pacientes de CRC metastáticos, mas manteve-se níveis significativamente mais elevados do que em controlos saudáveis ​​(p = 0,003). Ao avaliar os monócitos intermédios nas contagens de células do sangue periférico por ml ou em percentagem de monócitos no total, foram obtidos resultados comparáveis ​​(dados não mostrados).

subpopulações de monócitos foram determinados por citometria de fluxo e são dadas em% das contagens totais de leucócitos em indivíduos saudáveis, os pacientes com CRC localizada e pacientes com mCRC. A frequência do total de monócitos (CD14 positivas) (A) foi comparada com monócitos clássicos CD14 ++ CD16- (B), CD14 ++ CD16 + intermediária monócitos (C), e CD14 ++ CD16 + de TIE2 ETMs + (D).

da mesma forma, o (CD14 ++ CD16 + TIE2 +) subconjunto TEM de monócitos mostraram uma tendência não significativa a subir no local da doença (p = 0,055), com uma frequência média de 0,05%, 0,07% e 0,05% no total de leucócitos do sangue para saudáveis, locais coletivos CRC e CCRm, respectivamente. Avaliação da ETM com base na co-expressão de CD14 + + TIE2 em oposição à propagação triplo para CD14 ++ CD16 + de TIE2 + não alterou os resultados (dados não mostrados).

os níveis sanguíneos de Intermediário Os monócitos são um indicador de diagnóstico do CRC

Foram avaliados ainda mais o desempenho dos monócitos intermediários no diagnóstico CRC independentemente do estágio da doença. análise ROC foi aplicado para determinar o poder de diagnóstico através da área sob a curva (AUC = 0,785, p 0,001) e para estabelecer um limiar para a detecção de cancro (Fig. 2). Com um valor de corte de 0,37% de monócitos intermediários de leucócitos totais a sensibilidade e especificidade diagnóstica variou de 69% e 81%, respectivamente.

O saldo da sensibilidade e especificidade diagnóstica dos níveis de monócitos intermediários foi avaliada por ROC gráfico e a área sob a curva.

os monócitos do CRC pacientes apresentam níveis de expressão alterada de CD14 e CD16

a intensidade média de fluorescência (MFI) das medições de citometria de fluxo reflete a expressão média nível das moléculas de superfície sobre células investigadas e está ligada à função dos monócitos. Enquanto a expressão de CD14 se correlaciona com a capacidade de resposta dos monócitos e a secreção de citocinas [27], os seus níveis de CD16 está relacionado com a sua capacidade para a citotoxicidade celular dependente de anticorpo [28].

Descobrimos que os monócitos totais mostraram uma perda significativa de CD14 em o estágio avançado de CRC metastática (Fig. 3). Esta redução CD14 também foi observado quando avaliados separadamente para os monócitos clássicos e intermédios. Dentro da subpopulação de ETMs mais elevados níveis de expressão de CD14 foram registados no local da doença. monócitos intermediários e ETMs adicionalmente revelaram níveis de expressão aumentados de forma significativa de CD16 em pacientes com câncer em comparação com voluntários saudáveis ​​(Fig. 4), enquanto TIE2 níveis de ETMs expressão não foram alterados na doença.

níveis de expressão de CD14 em indivíduos saudáveis, em pacientes com localizada CRC ou CCRm foram avaliados por intensidade de fluorescência média (IFM) de coloração de CD14-FITC em total (CD14 positivo) de monócitos (a) ou sobre os subconjuntos de monócitos CD14 ++ CD16- clássicas (B), CD14 + intermediária + CD16 + monócitos (C), e CD14 ++ CD16 + TIE2 + ETMs (D).

O nível de expressão de CD16 e TIE2 em subgrupos de monócitos foi determinada para os indivíduos saudáveis ​​e pacientes com colorectal localizada ou metastática Câncer. intensidade da fluorescência (IMF) de coloração de CD16-PC5 média foi avaliada por intermédio CD14 ++ CD16 + monócitos (A), e CD14 ++ CD16 + de TIE2 ETMs + (B). Os níveis de expressão de TIE2 são refletidos pela MFI do anticorpo TIE2-PE obrigado a ETM (C).

Intermediário monócitos são um preditor independente de Câncer Colorretal

Para avaliar se as alterações relacionadas com o cancro em subpopulações de monócitos pode ser associada com factores conhecidos para regular o recrutamento e activação dos monócitos e intermediários ETM, investigamos os níveis sanguíneos de MCP-1, Ang-2, sTIE1 e VEGF-a em voluntários saudáveis ​​e em pacientes com CCR. A análise de parâmetros solúvel no plasma mostraram um forte aumento no VEGF-A (p 0,001) e Ang-2 (p = 0,004) em pacientes com doença de metástase (Fig. 5), enquanto que os níveis de Tie1 solúveis não diferiram significativamente entre os grupos ( dados não mostrados). As concentrações de MCP-1 foram determinadas no plasma (Fig. 5) e num subconjunto de amostras de soro (dados não mostrados), mas não deu quaisquer diferenças significativas entre os três colectivos investigados. Para comparação, o marcador tumoral CEA (tal como estabelecido pela análise de rotina do hospital) foi avaliada em pacientes e revelou um aumento significativo dos níveis sanguíneos de CEA CCRm em comparação com cancro localizado documentando assim o estádio avançado da doença. É de notar que nenhum dos parâmetros do plasma investigados apresentaram uma correlação significativa com sub-populações de monócitos.

parâmetros solúveis incluindo VEGF-A (A), a MCP-1 (B) e Ang-2 (C) foram medidos no plasma amostras de indivíduos saudáveis, pacientes com localizada CRC ou mCRC. concentrações sanguíneas do CEA marcador tumoral (D) estavam disponíveis a partir de análises de rotina do hospital de pacientes com câncer, mas não foram determinados (ND) para a coletiva de controle saudável.

A análise de regressão logística foi ainda realizada para avaliar a significância dos parâmetros disponíveis na previsão câncer. A Tabela 2 especifica os respectivos níveis de significância e odds ratio com intervalo de confiança de 95%. Nas análises univariadas, idade, plasma, VEGF-A e os níveis sanguíneos de CD14 ++ CD16 + monócitos intermediários (p = 0,004, odds ratio = 22) como preditores para o câncer colorretal. Na análise multivariada, a idade do paciente e monócitos intermediários (p = 0,024, odds ratio = 83) prevaleceu variáveis ​​independentes como significativas na previsão de câncer.

CD16 expressão em monócitos é induzida por cancro do cólon Células

in vitro

Uma vez que nenhum dos parâmetros do plasma investigados correlacionados com a indução de monócitos intermediários em pacientes com câncer, que teve como objetivo analisar por

in vitro

experimentos se estímulos derivados do tumor pode, efectivamente, desencadear expressão CD16 nos monócitos do sangue e aumentar a frequência do subconjunto intermediária. PBMC foram isolados a partir de voluntários saudáveis ​​e analisadas para a expressão de CD14 e CD16, após 24 h de incubação com sobrenadantes de células de tumor. Nós comparamos a estimulação com sobrenadantes derivados de primário (SW480 e HT-29) metastático (SW620) linhas de cancro do cólon e. No início do estudo, os monócitos intermédias constituídas 22% de células CD14 ++ (Fig. 6). Após 24 horas de

In vitro

incubação com o sobrenadante a partir de células primárias derivadas de CRC (SW480 e HT-29), a frequência intermédia de CD14 ++ CD16 + monócitos foi significativamente aumentada para 71-87%. Curiosamente, incubação de PBMC com o sobrenadante da linha de cancro do cólon metastático SW620 resultou num aumento moderado a 37% de monócitos CD14 ++ intermédios entre as células após 24 h.

PBMC foram isolados a partir de voluntários saudáveis ​​e incubadas durante 24 horas com sobrenadante de culturas de células de tumor derivadas de linhas CRC HT-29, SW480 e SW620. As células aderentes foram colhidas e coradas com anticorpos CD14-FITC e CD16-PC5; mIgG

1-PC5 foi usado para controle de isotipo. dados de citometria de fluxo de uma experiência representativa são ilustrados para controlo do isotipo (O) em comparação com a coloração CD16-PC5 de SW480 (B), e SW620 (C) estimulada culturas de CMSP. Média e desvio padrão de três experiências independentes, com diferentes dadores de sangue são dadas em um diagrama de barras (D) ilustrando a percentagem de CD16 + (intermediário) versus células CD16- (clássicos) dentro do CD14 ++ população de monócitos.

Discussão

Monitoramento de subpopulações de monócitos do sangue periférico foi originalmente baseado no simples detecção de CD14 e CD16 marcadores de superfície [10], [23], [29]. Isto levou à conclusão de que CD16 + monócitos constituem cerca de 10% do total de monócitos do sangue e a quantidade de 50 células por microlitro de sangue total [30]. Um aumento de duas vezes neste subconjunto de monócitos inflamatória é observada durante as infecções sistémicas, correlaciona-se com a gravidade da doença e é restaurada por tratamento do paciente e recuperação [31] – [33].

Um protocolo avançada para a avaliação de monócitos subconjuntos foi lançado em 2010 [34], com base na detecção concomitante de HLA-DR, CD14, CD16 e para evitar interferência pelos granulócitos e populações de células assassinas naturais. Em nosso estudo, optamos por concentrar-se na intermediária CD14 ++ CD16 + e os TIE2-expressando populações de monócitos com a associação marcador de CD14, CD16, e TIE2. Deve notar-se que esta abordagem de detecção de não permitir a detecção inequívoca dos monócitos não clássicos que possam ser “contaminado” por células assassinas naturais e que têm, portanto, sido omitidas a partir dessa análise. Uma estratégia de coloração comparáveis ​​foi previamente relatado para a detecção de ETM bem sucedido dentro do subconjunto de monócitos intermédio [35]. Foram avaliados a concentração dessas populações de monócitos no sangue de voluntários saudáveis ​​e detectado um nível médio de 16 (intervalo interquartil 11-30) intermediária CD14 ++ CD16 + monócitos e 3 (intervalo interquartil 2-6) ETMs por microlitro de sangue periférico. Quando calculada em porcentagem, os subconjuntos intermediários e TEM ascendeu a 0,25% e 0,05% do total de leucócitos no sangue e para 3,39% e 0,63% de monócitos, respectivamente.

O objetivo do nosso estudo era determinar se esses monócitos subpopulações são elevados em pacientes com carcinoma colorectal e tem um potencial marcador de diagnóstico. Encontrámos o subconjunto de monócitos intermediário a ser 2,2 vezes elevada em doenças a um nível mediano de 0,55% dos leucócitos do sangue em pacientes de CRC (0,66% em doença localizada e 0,40% em doença metastática). análise ROC conduziu à selecção de um ponto de corte de 0,37%, o que resultou numa sensibilidade de diagnóstico de 69% e especificidade de 81%. O valor preditivo deste subconjunto de monócitos foi ainda confirmada por análise de regressão multivariada, incluindo todos os parâmetros disponíveis. Além de a idade do paciente, monócitos intermediários eram a única variável independente significativo para a previsão do câncer. Neste contexto, deve-se notar, que os coletivos recrutados de indivíduos saudáveis ​​e pacientes com câncer diferiam na idade média (56 e 68 anos, respectivamente) – uma tendência que é contabilizado de análise multivariada

A limitação. Uma população de monócitos no diagnóstico do cancro é dada pelo facto de as flutuações das contagens de monócitos no sangue são também observadas para outras condições, nas doenças inflamatórias particulares [20], [22]. O perfil de sangue de subgrupos de monócitos pode, portanto, reflectir um epifenómeno não relacionado com o tumor. Para resolver este problema, comparamos o número de leucócitos entre os grupos em estudo, uma vez que um aumento na concentração de leucócitos é geralmente associado a condições inflamatórias e infecciosas. Não houve diferença significativa entre os indivíduos saudáveis ​​e pacientes com câncer colorretal investigados em nosso estudo (Fig. S2). Além disso, os níveis sanguíneos do marcador inflamatório proteína C-reactiva (CRP) estavam disponíveis a partir de análises de rotina do hospital de doentes com cancro. Enquanto os níveis de PCR correlacionou com contagem de leucócitos (P 0,001; k = 0,474), não houve correlação entre os níveis de PCR ou concentrações de leucócitos com contagem de monócitos intermediários. Estes resultados suportam a noção de que o aumento do nível de monócitos intermediários em pacientes com câncer não foi induzido por condições inflamatórias não descobertas do nosso estudo.

análises anteriormente publicados de pacientes com câncer foram focados na simples discriminação entre CD16 monócitos positivos ou negativos , ou seja, foram combinando as populações de células não clássicos e intermediários na sua estratégia de detecção. O subconjunto de CD16 + de monócitos foi relatado para ser significativamente elevados em doentes com doença maligna [36]. Em particular, um estudo recente sobre o cancro da mama mostraram que CD16 + monócitos foram 1,7 vezes maior em pacientes, em comparação com controles saudáveis. Os autores observaram que os níveis foram maiores na fase I do que a doença II-IV fase [10]. Comparativamente, encontramos o CD14 intermediária ++ CD16 + monócitos subconjunto a ser significativamente elevados em pacientes com câncer colorretal, mas para mostrar números mais elevados no local do que a doença metastática. Além da frequência de monócitos intermédios, a sua expressão de CD16 aumento significativo, potencialmente aumentando a sua capacidade para a citotoxicidade celular dependente de anticorpo [28].

A expressão de CD16 em monócitos pode ser induzida por citocinas, tais como MCP -1 [10], TGF-β [37], ou FEC-M [11]. Por outro lado, este efeito pode ser bloqueado por citocinas do tipo Th2, como a IL-4 [12] e por GM-CSF [37]. Assim, é concebível que o aumento em monócitos intermediários (CD14 ++ CD16 +) é mais activamente desencadeada pelo tumor primário, ao passo que a progressão do tumor no resultado de doença metastática em um ambiente de citocinas de tipo Th2 com efeitos contrários. Quando o rastreio nossos coletivos paciente para MCP-1 níveis sanguíneos não se detectou qualquer aumento ou correlação com a freqüência de monócitos intermediários. No entanto, outros factores derivados do tumor podem ser responsáveis ​​pelo aumento do número de monócitos intermediários (CD14 ++ CD16 +) foi observada em pacientes com cancro. Em consonância, o nosso

in vitro

análises mostraram que a incubação de PBMC com cultura de células de tumor sobrenadantes resulta na rápida indução de CD14 ++ CD16 + monócitos. Notavelmente, este aumento foi menos pronunciado em resposta ao sobrenadante da cultura da linha de células metastática SW620 derivadas do mesmo paciente como a linha celular SW480 carcinoma primário ou a linha não relacionada CRC primária HT-29. Enquanto estes

in vitro

experimentos não identificam a origem da indução CD16 + monócitos CD14 ++

in vivo

, eles apoiam a noção de que os monócitos intermediários podem ser mais eficazmente induzida nas fases iniciais da doença.

CD16 + monócitos são alegadamente a população principal de monócitos na resposta anti-cancro e segregam níveis elevados de TNF-α e IL-12 após interacção de células de tumor [38]. No entanto, a distinção funcional entre monócitos não clássicos e intermediários está ausente neste contexto. O fato de que os monócitos intermediários podem expressar fatores (pró-tumorais e, portanto, potencialmente) pró-angiogénicos tais como TIE2, endoglin ou VEGFR-2 nos levou a investigar um subconjunto específico de monócitos intermediários, a ++ CD16 CD14 + TIE2 + tems. Embora os efeitos promotores de tumor potentes têm sido demonstrados para ETMs em experiências com ratos [16], [39], estudos clínicos sobre o seu potencial marcador em pacientes com câncer são em grande parte em falta [17]. De acordo com um relatório muito recente em frequências TEM no carcinoma colorectal [40], descobrimos que ETMs não foram significativamente elevados no sangue de pacientes com câncer colorretal e não mostrou correlação com a angiogênese circulando fatores ANG-2, sTIE1 e VEGF-A conhecido para regular o recrutamento MET ou actividade [18]. Apesar de não detectar uma diferença significativa na TEM conta entre indivíduos saudáveis ​​e pacientes com câncer, observou-se uma tendência para os níveis mais elevados de TEM em doença localizada. A conclusão de que circulam ETMs constituem um marcador de diagnóstico pobres para o cancro colorectal, por conseguinte, pode ser devido a um menor aumento dos níveis de MET, em comparação com a contagem de monócitos intermediários na doença. Um coletivo maior de participantes do estudo seriam necessários para determinar se esta diferença é de significância estatística.

Em resumo, quando se comparam intermediária CD14 ++ CD16 + monócitos e CD14 ++ CD16 + TIE2 + ETMs no sangue de 32 saudável sujeitos e 61 pacientes de CRC, verificou-se que os monócitos intermédios em oposição a ETM foram significativamente elevados na doença. A maior freqüência de contagem de células CD14 ++ CD16 + foi, curiosamente, gravado para localizada em oposição à doença metastática que pode refletir a indução preferencial de monócitos intermediários nos estágios iniciais de câncer – um conceito que foi apoiado por

in vitro

estudos. A freqüência de monócitos intermediários foi encontrada para ser um preditor independente de cancro colo-rectal. Ao tomar em consideração que os monócitos intermediários podem também ser aumentados em outras condições inflamatórias, este parâmetro pode ser um valioso complemento aos marcadores de diagnóstico estabelecidos pela CRC que reflecte a resposta imunológica contra o tumor no início. Representa uma opção de triagem menos invasiva que deve ainda ser avaliada em um coletivo maior de pacientes em suporte de testes de diagnóstico colonoscopia e outros, em especial para detectar os primeiros estágios da doença.

Informações de Apoio

Figura S1.