Abstract
Fundo
variantes genéticas podem influenciar interação microRNA-alvo através de modular a sua afinidade de ligação, criar ou destruir locais de ligação de miRNA. Set8, um membro da metiltransferase SET domínio contendo, tem sido implicada numa variedade de processos biológicos variedade
Métodos
Usando o ensaio TaqMan, que genotipados um polimorfismo rs16917496 T . C dentro do local de ligação de miR-502 na região 3 ‘não traduzida dos pacientes in
gene set8
em 576 o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Funções de rs16917496 foram investigados utilizando o ensaio de actividade de luciferase e validado por imunocoloração.
Resultados
Log-rank e regressão de Cox indicaram que o genótipo CC foi associado com uma sobrevivência mais longa e um risco reduzido de morte para NSCLC [58.0 vs. 41.0 meses,
P
= 0,031; taxa de risco = 0,44, 95% de intervalo confidenciais: 0,26-0,74]. Outras análises de regressão sugeriu rs16917496 foi um fator independente favorável para o prognóstico e o efeito protetor mais proeminente em mulheres que nunca fumantes, pacientes sem diabetes e pacientes que receberam quimioterapia. Foi observada uma interação significativa entre rs16917496 e tabagismo em relação à sobrevida NSCLC (
P Art 0,001). Ensaio de actividade de luciferase mostrou um nível de expressão mais baixos para o alelo C, em comparação com o alelo T, e o miR-502 tinha um efeito sobre a modulação de
set8
gene de
In vitro
. O genótipo CC foi associada com a expressão da proteína set8 reduzida com base em imunocoloração de 192 amostra de tecido NSCLC (
P
= 0,007). Níveis mais baixos de set8 foram associados com uma sobrevivência não significativamente maior (55,0 versus 43,1 meses)
Conclusão
Os nossos dados sugerem que a rs16917496 T . C localizado na miR-502 sítio de ligação contribui para a sobrevivência NSCLC alterando expressão set8 através de modulação interação miRNA-alvo
Citation:. Xu J, Yin Z, Gao W, Liu L, Yin Y, Liu P, et al. (2013) variação genética em uma Minding site MicroRNA-502 no
set8
gene atribui evolução clínica de não-pequenas células do cancro do pulmão na população chinesa. PLoS ONE 8 (10): e77024. doi: 10.1371 /journal.pone.0077024
editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Porto Oncology, Portugal |
Recebido: 02 de julho de 2013; Aceito: 27 de agosto de 2013; Publicação: 11 de outubro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (81172140, 81272532), a prioridade Academic Programa de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior Jiangsu (JX10231801) e na província de Jiangsu clínicos projectos científicos e tecnológicos (Centro de Pesquisa Clínica, BL2012008). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo, devido à sua alta incidência, comportamento maligno e falta de grandes avanços na estratégia de tratamento. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por cerca de 80% de todos os casos de cancro do pulmão, com menos de 15% de pacientes que sobreviveram para além de 5 anos [1], [2]. A descoberta e aplicação de biomarcadores prognósticos específicos para além do tumor standard, linfonodos e metástases sistema de estadiamento (TNM) pode melhorar os cuidados médicos de pacientes com NSCLC [3]. Apesar dos esforços intensos [4], [5], [6], ainda há uma falta de biomarcadores específicos para a previsão de prognóstico do câncer de pulmão. Um biomarcador ideal deve ser fácil de detectar, estável e reprodutível. Variações genéticas em pacientes com câncer pode servir como marcadores de prognóstico da evolução clínica.
Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos (~20-22 nt) não-codificante moléculas de RNA que regulam a expressão do gene através da ligação 3 ‘ região -untranslated (3’UTR) de ARNm alvo [7]. Estima-se que cerca de 30% dos genes humanos estão transcrição ou pós-transcricional regulada por miARNs. Como resultado, miARNs estão envolvidas em processos biológicos essenciais, incluindo o desenvolvimento, diferenciação, proliferação e apoptose [8], [9]. Estudos recentes têm demonstrado os padrões desregulados expressão de miRNA em diversos tipos de câncer, indicando um papel importante de miRNAs no início, a progressão e metástase de câncer humano [10], [11]. MiARN perfis de expressão e miARNs específicos têm sido mostrados para associar com a sobrevivência de uma variedade de cancros, incluindo cancro do pulmão [12], [13], [14]. polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) na pré-miRNA ou maduras sequências de miRNA e locais de miRNA-ligação pode modulada as interações miRNA-alvo através de alterar a expressão miRNA, maturação, destruir ou criar os locais miRNA-ligação, resultando na desregulamentação do gene alvo expressão [15], [16], [17]. Este tipo de polimorfismos têm sido implicados na susceptibilidade a cancro, quimioterapia e sensibilidade prognóstico [16], [18], [19], [20]. Entre estes miRNA-vinculativo site de SNPs é aquele encontrado dentro do sítio de ligação de miR-502 na 3’UTR do metiltransferase histona
set8
gene [21].
set8
(também conhecido como PR-SET7 /SETD8 /KMT5A; localizado no cromossoma 12q24.31), um membro da família contendo o domínio metiltransferase SET especialmente dirigidas para H4K20 monomethylation [22], [23], tem sido implicada numa matriz variedade de processos biológicos, tais como a regulação da transcrição [24], [25], a formação de heterocromatina [26], a estabilidade genómica [27], [28], a progressão do ciclo celular e desenvolvimento [28], [29], [30 ], [31], [32]. Recentemente, Shi et al. [33] demonstram uma atividade para set8 como um methylatransferase p53 e Yang et al. [34] revelou um novo papel para set8 na invasão tumoral e metástases. Estudos anteriores sugerem um rs16917496 polimorfismo T C, que está localizado dentro do local de ligação de miR-502 em
set8
3’UTR (Figura 1A), modula a expressão da proteína set8, e, assim, contribui para o cancro da mama e cancro do ovário susceptibilidade, e o resultado clínico do carcinoma hepatocelular [35], [36], [37].
(A) A sequência de complementaridade de has-miR-502 e
set8
3’UTR é mostrado aqui. (B) A sequenciação directa e Desenho esquemático das construções repórter contendo 1650 pb 3’UTR de
set8
com rs16917496 T ou alelo C. (C) a expressão de luciferase de construções que contêm o alelo C rs16917496 T ou em células A549 e 293T. Cada transfecção foi realizada com os plasmídeos de pRL-SV40 como controlos normalizados.
plasmídeos set8
3’UTR luciferase repórter foram cotransfectadas com sintetizados quimicamente madura hsa-miR-502 com ou sem miR-502 inibidores em linhas de células A549 e 293T. 3’UTR, a região 3 ‘não traduzida.
Neste estudo, nós genotipados rs16917496 em pacientes com NSCLC para demonstrar que este SNP é uma importante variante genética para a previsão de sobrevivência. Nós também validado que SNP rs16917496 foi relacionada com a
set8
expressão através afetando miR-502 ligação ao
set8
3’UTR.
Materiais e Métodos
ética Declaração
Este estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da Universidade médica de Nanjing. Todos os participantes foram voluntários e iria completar o consentimento informado por escrito antes de participar nesta pesquisa.
Estudo da População
Todos os indivíduos foram recrutados a partir do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing (Jiangsu, China ) entre Janeiro de 2004 e Setembro de 2012. Todos os pacientes foram recentemente diagnosticados, histologicamente confirmados e sem história prévia de outros tipos de câncer ou quimioterapia ou radioterapia. Todos os indivíduos não estavam relacionados população de etnia chinesa Han. Após consentimento informado foi obtido, um questionário estruturado sobre dados demográficos e história exposição ambiental, tais como idade, sexo e consumo de fumo, foi administrado por meio de entrevistas face-a-face por entrevistadores treinados. Cada paciente doou sangue venoso de 5 ml para extração de DNA genômico. Indivíduos com uma frequência baixa ( 1 cigarro por dia) e duração ( 1 ano) de tabagismo foram definidos como os não fumantes; Todos os outros foram classificados como fumantes. O acompanhamento foi realizado a cada 3 meses a partir do momento da inscrição até a morte ou o último acompanhamento programado (último follow-up em fevereiro de 2013). Nós selecionamos os pacientes com follow-ups completos e amostra de DNA adequada. Como resultado, 576 pacientes com NSCLC foram incluídos e genotipados em nosso estudo. O tempo de seguimento maximun foi de 102 meses (último follow-up em fevereiro de 2013) e do tempo de seguimento médio foi de 18,0 meses.
A genotipagem
O DNA genômico de cada indivíduo foi extraída por um método de rotina [38]. ensaio de discriminação alélica TaqMan foi escolhido para a genotipagem utilizando um sistema ABI 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Primer e sonda são: para a frente, TTTATGATGACAAATAATTTTCAAGTT, reverso, AATGTGAGACACAATGTCTTGATTATA e FAM-TTTATTTCCTTGTTTAAA-MGB, HEX-TTTATTTCCTTATTTAAAT-MGB. O ensaio de genotipagem incluídos dois controlos em branco (água) em cada formato de 384 poços e mais de 10% das amostras foram selecionados aleatoriamente para análise de repetição, obtendo-se 100% de concordância.
Construção de plasmídeos Reporter
uma vez que uma associação significativa foi observada para posterior rs16917496 T C polimorfismo e sobrevivência NSCLC, nós construídos dois plasmídeos repórter contendo rs16917496 C alelo rs16917496 T ou para determinar se este polimorfismo teve qualquer efeito sobre a expressão do gene (Figura 1B). A construção repórter alelo T estava sintética utilizando técnicas de ADN convencional (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O ™ de produtos e PMIR-REPORT (biossistemas appied) vector com Renilla e sequências de genes do vaga-lume luciferase foram clivada usando
Mlu
I e
Sac I (NEB) e, em seguida
ligado por DNA ligase de T4 (NEB). O alelo C de rs16917496 foi gerado com o kit de mutagénese dirigida ao local (Takara, Berkeley, CA, EUA) para a frente com iniciador mutagénico 5′-AAAGAAgAAGGAACTAGGTCAAAAATCTGTCC-3 ‘e o iniciador inverso 5′-mutagénicas TAGAGCAAAAAGAACTTTTACCTCGGCATC-3’ de acordo com o protocolo do fabricante . Todas as construções utilizadas neste estudo foram verificadas por dirigir sequenciamento (Figura 1B)
RNA Interferências, transitórios Transfec�es e luciferase Ensaios
O rs16917496 T . C polimorfismo localizado no sítio de ligação de miR- 502 (Figura 1A). Assim, aplicou-se o mímico e inibidor desta miRNA que sintetizado por GenePharma (Xangai, China) para mostrar seu efeito sobre gene repórter PMIR-set8 in vitro. As células A549 e 293T foram mantidas em RPMI 1640 com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) e 50 ug /ml de estreptomicina (Gibco). As células foram semeadas em placas de 24 poços a 1 × 10
5 células por poço e cultivou-se a uma incubadora a 37 ° C, suplementada com 5% de CO
2 durante 24 h. As células foram depois co-transfectadas transientemente com o
set8
3’UTR plasmídeos de luciferase (alelos diferentes) e miR-502 mimcs com ou sem inibidores de miR-502, utilizando Lipofectamine 2000 de acordo com o protocolo (Invitrogen). O plasmídeo pRL-SV40 (Promega, Madison, WI, EUA), também foi transfectada como um controlo de normalização. Ao fim de 24 h após a transfecção, as células foram recolhidas e analisadas quanto à actividade de luciferase com luciferase dupla Reporter Assay System (Promega). experiências em triplicado independentes foram feitas para cada construção de plasmídeo.
Imunohistoquímica
A expressão de proteínas set8 no câncer de pulmão foi detectado por imuno-histoquímica (IHQ). As lâminas foram preparadas usando um autoimmunostainer Ventana (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) e um anticorpo anti-set8 (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Detecção utilizado polímero-HRP, com 3,3-diaminobenzidina. As lâminas foram visualizados em 40 × com um microscópio Nikon Eclipse.
As secções foram examinadas e avaliadas por dois patologistas que foram cegados para os resultados de genotipagem. casos controversos foram reavaliados em conjunto até que um consenso foi alcançado. Para comparação dos resultados de coloração, as amostras foram marcados semi-quantitativamente usando uma pontuação histológica (H-score). A intensidade da imunorreactividade nuclear de células de tumor (1, nenhuma ou fraca; 2, moderada; e 3, intenso) foi multiplicado pela percentagem de células neoplásicas positivas (1-100), obtendo-se assim valores de 0 a 300. set8 expressão foi categorizada tão elevada (igual ou superior ao valor H-score médio) ou baixa (abaixo do valor de H-score mediana).
Análise estatística
Hardy-Weinberg foi avaliada por um goodness-of -Fit χ
2 de teste. A sobrevida global (OS) foi calculado como o tempo entre o primeiro tratamento e morte ou a última data de acompanhamento. Associação entre a taxa de genótipo e sobrevivência foi estimada pelo método de Kaplan-Meier e teste log-rank. Foi calculado o tempo médio de sobrevivência (MST), e o tempo médio é apresentado quando o tempo médio não pôde ser calculado. Cox modelos de riscos proporcionais foram realizados para estimar as taxas de risco (HR) e seus intervalos confidenciais de 95% (IC) para OS. O
P valor
para o teste de heterogeneidade foi baseada na χ
teste Q 2-based. O poder estatístico foi calculado usando o Software PS (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize). teste t de Student foi utilizado para comparar a diferença nos níveis de expressão do gene repórter da luciferase. A distribuição de IHC graus de expressão para cada
set8
genótipo foi comparado usando um χ
2 de teste. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS 18.0 (SPSS Inc.), e
P Art 0,05 em um teste de dois lados foi considerada estatisticamente significativa
Resultados
características da População do Estudo
as características demográficas e informações clínicas dos pacientes e a associação com oS são apresentados na Tabela 1. a média de idade ao diagnóstico foi de 60 anos (variação, 29-86), e havia 380 homens (66,0%) e 267 fumantes (46,4%). Desses pacientes, 381 (66,2%) eram adenocarcinomas, 166 (28,8%) eram carcinomas de células escamosas, e os outros (29 pacientes, 5,0%) foram de grandes células, indiferenciada e carcinomas de células mista. Durante o período de acompanhamento, 206 pacientes morreram de NSCLC. tabagismo, estadiamento clínico e operação cirúrgica, mas não quimioterapia ou status de terapia-alvo, foram significativamente associados com o tempo de sobrevida (todo o log-rank P 0,001). Curiosamente, os pacientes com diabetes (MST, 54,9 meses) tinha uma 42% redução significativa do risco de morte (HR = 0,58 IC 95%: 0,35-0,97), em comparação com aqueles sem diabetes (MST, 42.0 meses)
Efeito da set8 3’UTR rs16917496 T C Polimorfismo em NSCLC Survival
o genótipo frequências dos rs16917496 estavam em Hardy-Weinberg (
P
= 0,272). Consistente com relatórios anteriores, o alelo C verificou-se ser o alelo menor frequência [21], [35], [36], [37]. Log-rank teste detectou uma associação significativa da rs16917496 com a sobrevivência NSCLC em diferentes modelos genéticos (
P
= 0,006, 0,031 e 0,003 para o modelo codominante, modelo dominante e modelo recessivo, respectivamente. Figura 2A). Os pacientes portadores do genótipo rs16917496 CC tinha um sistema operacional melhorada em comparação com aqueles com genótipo TT (58,0 vs 41,0 meses, HR = CI 0,44, 95%: 0,26-0,74). Univariada Cox análise de regressão mostrou que esta SNP foi um marcador de prognóstico significativo de NSCLC (modelo dominante: HR = 0,74, 95% CI: 0,56-0,98; modelo recessivo: HR = 0,47, 95% CI: 0,28-0,79) (Tabela 1) . A associação permanecem significativa após ajuste para idade, sexo, tabagismo, diabetes mellitus, histologia, estágio clínico, intervenção cirúrgica e o estado do tratamento (modelo dominante: HR = CI 0,70, 95%: 0,53-0,92). Além disso, uma fonte de estudo de 91,7% (teste bilateral, α = 0,05) foi alcançado para detectar um HR de 0,70 para os genótipos C alelo no modelo dominante.
(A)
SET
8 genótipo rs16917496 e sobrevivência NSCLC (log-rank
P
= 0,006) em um modelo de co-dominante. (B) Gráficos de Kaplan-Meier de sobrevida pela combinação de
set8
genótipos e tabagismo na sobrevivência NSCLC (log-rank
P Art 0,001). 0, os pacientes com genótipo comum (TT) e nunca fumar; 1, aqueles com genótipos variantes (TC ou CC) e nunca fumar; 2, aqueles com genótipo comum, mas sem fumar; 3, aqueles com genótipos variantes e sem fumar. (C) baixa expressão; (D) uma expressão elevada. As células com um núcleo marrom com manchas são consideradas positivas. Ampliação original: × 200. NSCLC, cancro do pulmão de células não pequenas.
A fim de encontrar fatores prognósticos independentes, que ainda fez um passo a passo análise multivariada de regressão de Cox com características demográficas selecionadas, características clínicas e o genótipo set8 na sobrevivência NSCLC. Os resultados indicaram que o
set8
rs16917496 polimorfismo (
P
= 0,014) foi permaneceram no modelo preditivo final, juntamente com o tabagismo, diabetes mellitus e operação cirúrgica (
P
= 0,006, 0,018 e. 0,001, respectivamente) (Tabela 2)
Estratificação e Interacção Análise
A associação entre a
set8
rs16917496 polimorfismo e sobrevivência NSCLC foi ainda avaliada por análise estratificada de tabagismo, diabetes mellitus, histologia, estágio clínico, intervenção cirúrgica, quimioterapia e status de terapia-alvo. Como mostrado na Tabela 3, o efeito protetor de genótipos variantes de
set8
rs16917496 foram mais proeminentes em pessoas que nunca fumaram (HR ajustado = 0,54, 95% CI: 0,35-0,83), pacientes sem diabetes (HR ajustado = 0,70 , 95% CI: 0,53-0,94), os pacientes que receberam quimioterapia (HR ajustado = 0,69, 95% CI: 0,51-0,92), mas a terapia não-alvo (HR ajustado = 0,52, 95% CI: 0,24-1,02). teste de heterogeneidade mostrou que a heterogeneidade em cada dois estratos foram significativos para tabagismo (
P
= 0,016). Portanto, uma análise da interação estado do gene fumadores foi realizada (Tabela 4), e houve uma interação multiplicativa estatisticamente significativa entre os genótipos de rs16917496 e tabagismo sobre a sobrevivência NSCLC (
P Compra de interação multiplicativa 0,001 ). Em comparação com os fumantes com rs16917496 genótipo TT, nunca fumantes com genótipos CT CC + teve uma redução significativa do risco de morte (HR ajustado = CI 0,50, 95%: 0,25-0,64). Kaplan-Meier da sobrevivência por combinação de
set8
genótipos e tabagismo na sobrevivência específica do NSCLC são mostrados na figura 2B.
Efeito da set8 3’UTR rs16917496T C no polimorfismo set8 Expressão
o rs16917496 T C polimorfismo localiza-se no local de ligação de miR-502 (Figura 1A). Como previsto usando RNAhybrid [39], miR-502 tem uma energia livre mínima mais elevada (MFE) com o alelo C (| MFE | = 16,2 kcal /mol) de rs16917496 em
set8
do que com o alelo T (| MFE | = 14,5 kcal /mol). Assim, a hipótese do C alelo variante pode levar a uma redução da expressão de
set8
resultou do aumento da repressão miRNA. Para testar esta hipótese, duas construções de gene repórter da luciferase contido rs16917496 alelo T ou C foram gerados para determinar se este SNP poderia afectar a expressão do gene (Figura 1C). A atividade de transcrição do gene repórter com rs16917496 C alelo foi significativamente menor em comparação com o alelo T quando co-transfectado sintetizado quimicamente madura miR-502 em células A549 (
P Art 0,0001) e células 293T (
P
= 0,002). Os inibidores de miR-502 poderia inverter significativamente as atividades do gene repórter com o alelo rs16917496 C (
P Art 0,0001 para ambos A549 e 293T); No entanto, não foi observada nenhuma alteração evidente para o gene repórter com o alelo T tratadas com inibidores de miR-502 (
P
0,05 para ambos). Tomados em conjunto, o forte efeito de miR-502 na modulação
set8
em ambas as linhas A549 e células 293T indicou que o miR-502 especialmente se liga à 3’UTR do
set8
gene com rs16917496 alelo C e suprimir a expressão do
set8
gene
in vitro
Associação da expressão set8 proteína com rs16917496 T . C Polimorfismo e NSCLC Survival
Entre as amostras de sangue NSCLC 576, 192 tinham correspondência suficiente, amostras de cancro do pulmão embebidos em parafina fixadas em formalina. Nós, então, explorada o status de expressão de set8 em NSCLC e sua associação com o polimorfismo rs16917496 utilizando imuno-histoquímica (Figura 2C e 2D). Set8 foi altamente expressa em 50,5% tecidos de câncer de pulmão. Os pacientes com a
set8
CC genótipo tinham níveis significativamente mais baixos de expressão set8 do que aqueles com o genótipo CT ou TT (
P
= 0,007, Tabela S1), que confirmou os resultados do repórter luciferase ensaios. Estes resultados apoiaram uma relação genótipo-fenótipo que o genótipo variante rs16917496 CC confere a uma menor expressão de gene set8 comparação com CT ou TT genótipos. A taxa de sobrevivência de pacientes com NSCLC com níveis de expressão de baixa e alta set8 Foi ainda analisada por meio do teste log-rank. Indivíduos com baixos níveis de set8 exibido mais OS do que aqueles com níveis elevados de set8 (55,0 vs 43,1 meses), embora a diferença não foi estatisticamente significativa (
P
= 0,138).
Discussão
MicroRNAs são uma nova classe de RNAs não-codificantes e foi demonstrado desempenhar um papel importante na regulação de genes codificadores de proteínas. Novas evidências sugerem que os polimorfismos dentro de locais de ligação de miRNA pode afetar a regulação miRNA para direcionar a expressão do gene e, consequentemente, modificar o risco de câncer e resultado. Por exemplo, a variante do alelo A
RAP1A
rs6573 aumentada a capacidade de ligação de miR-196a, levando a um aumento
RAP1A
repressão, e este SNP funcionava como um potencial diagnóstico pessoal mediada por miARN marcador para o carcinoma de células escamosas do esôfago [40]. Um SNP (rs13312986) no local de ligação do miRNA-629 alterou o
expressão NBS1
e contribuiu para o risco de câncer de pulmão [41]. variação alélica de rs3134615 pode destruir a capacidade de miR-1827 para regular
MYCL1
expressão e esta variante foi associada com o risco de câncer de pulmão de pequenas células [42]. Rs7180135 está localizado dentro do local de ligação de miR-197 na 3’UTR de
RAD51
, e o alelo secundário foi relatado para ser associado a uma sobrevivência melhorada específica do cancro de pacientes de cancro da bexiga [43]. Neste estudo, nós examinamos um SNP no sítio de ligação de miR-502 da
set8
3’UTR por seu poder de previsão relacionadas com os resultados NSCLC. Mostrámos que a rs16917496 T C foram associados com a sobrevivência NSCLC numa população chinesa. A variante alelo C pode diminuir a expressão de
set8
através do reforço da capacidade de ligação de miR-502 para direcionar site da 3’UTR do
set8
. O genótipo CC foi associada com a expressão da proteína set8 reduzida, o que era consistente com estudos anteriores em câncer de mama tinham carcinoma hepatocelular [35], [37]. Além disso, níveis mais baixos de set8 foram associados a uma maior sobrevida em NSCLC.
set8 é encontrado para ser sobre-expresso em vários tipos de tumor, incluindo câncer de pulmão [44]. A função de set8 é provável que seja muito ampla e tem sido implicada em processos patológicos tais como a tumorigénese. Tem sido relatado que set8 é necessário para a progressão da fase S normais [26], [29], está envolvida na regulação da transcrição [24], [25], a replicação do genoma e da estabilidade [26], [27], [28] , e modula as funções de captura e proapaptotic do ciclo celular [30], [31], [33]. Set8 tem uma função bem definida na via TP53 por monomethylating p53 na lisina 382 e suprimindo a activação da transcrição mediada por p53 de genes alvo [33]. A função mais notável dos set8 é a modulação dinâmica da cromatina como uma enzima de modificação de histona [45]. Está bem estabelecido que alterações epigenética do código de histona contribuir para a iniciação de várias doenças malignas, tais como linfomas, carcinoma de células escamosas e adenocarcinoma colorrectal [46], [47]. Estas alterações epigenética aparecem numa fase precoce da carcinogénese e se acumulam durante a progressão [47]. Recentemente, Takawa et ai. [44] revelou uma função de set8 para metilação lisina numa proteína PCNA não-histona, que as funções estão relacionadas com os processos celulares vitais. Set8 foi encontrado para promover a carcinogênese através da desregulamentação expressão PCNA. Entretanto, um novo papel para set8 na invasão tumoral e metástase foi estabelecida por Yang et ai. [34]. Eles demonstraram que set8 promove transição epitelial-mesenquimal (EMT) e melhora a capacidade invasiva de células de cancro da mama através de interdependência funcional com uma torção fator de transcrição e através dupla atividade de remodelação da cromatina. Tomados em conjunto, set8 desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão do cancro.
O status de expressão e papel função de miR-502 no cancro do pulmão é em grande parte desconhecida. No entanto, miR-502 foi encontrado a ser reprimidos em amostras de câncer de cólon em comparação com as amostras de controlo normais emparelhados. A expressão ectópica de miR-502 inibiu autofagia, crescimento celular e na progressão do ciclo celular de células de cancro do cólon in vitro. MiR-502 também inibiu o crescimento do cancro do cólon em um modelo de xenoenxertos de tumores do rato [48]. O miR-502 sítio de ligação SNP rs16917496 na 3’UTR de
set8
, identificado pela primeira vez por Yu et al. [21], tem sido relatada a contribuir para a susceptibilidade de câncer de mama e de ovário [35], [36], e o resultado clínico de câncer de pulmão de pequenas células e carcinoma hepatocelular [37], [49]. De acordo com o
in silico
análise utilizando banco de dados RNAhybrid, miR-502 está previsto para ligar fortemente com o site alvo de
set8
abrigar alelo C de rs16917496. ensaio de luciferase indicaram que a actividade de transcrição do gene repórter com o alelo rs16917496 C foi significativamente reduzida do que com o alelo T. O nível de expressão reduzida de set8 pode resultar em um inibidor de tumorigénese e progressão. Este foi consistente com os resultados da associação que o alelo C de rs16917496 foi associada a um melhor prognóstico das NSCLC. Mais aprofundada estudos funcionais são necessários para descobrir o mecanismo exato desta variante.
É bem estudado que o tabagismo é um forte fator de risco de câncer de pulmão. Nós também encontramos que é um fator prognóstico desfavorável para pacientes com NSCLC. Agentes cancerígenos em cigarros pode causar danos no DNA, o que pode conduzir à sobre-expressão de p53 no cancro primário do pulmão [50] e a regulação negativa da expressão set8 [33]. Set8 modula a expressão da p53 por metilação p53 em lisina 382. A exaustão das set8 aumenta as funções de ativação pró-apoptóticos e de ponto de verificação de p53 [33]. Enquanto isso, a rs16917496 C alelo pode diminuir a expressão de
set8
através do reforço da capacidade de ligação de miR-502 para atingir o 3’UTR de
set8
. No presente estudo, foi observada uma interação significativa entre rs16917496 e tabagismo. pacientes portadores de, pelo menos, um alelo C de rs16917496 para não-fumadores têm um sistema operacional significativamente maior do que fumantes ou aqueles com genótipos TT. É plausível que as variações genéticas em
set8
gene pode alterar o desenvolvimento de câncer de pulmão mediada pelo tabagismo.
Além disso, ainda havia algumas limitações neste estudo. Em primeiro lugar, apenas um potencial SNP funcional do
set8
gene foram investigados, o que não cobrem todas as variantes do
uma análise mais aprofundada haplótipo restrito set8 Comprar e. Em segundo lugar, nosso estudo foi baseado em um pequeno tamanho da amostra relativa. Embora tenhamos observado uma associação significativa entre o polimorfismo rs16917496 e sobrevivência NSCLC e um efeito de interação entre este SNP e tabagismo. Os ensaios biológicos demonstraram que rs16917496 é biológico funcional. Por isso, apoio a essa nossa descoberta de que o genótipo variante rs16917496 CC associada com um risco reduzido de morte para NSCLC é improvável de ser alcançada por acaso.
Em resumo, nós confirmou que
set8 Sims 3 ‘ UTR rs16917496 T polimorfismo C pode prever a sobrevida dos pacientes com NSCLC em uma população chinesa. Um ensaio funcional sugere que o rs16917496 variação genética no local de ligação de miR-502 pode modificar resultado NSCLC através de regulação da expressão de
set8
. As conclusões destacam ainda que polimorfismos em sites de miRNA-ligação podem desempenhar um papel importante no cancro do pulmão e pode ter um efeito sobre a evolução clínica dos pacientes.
Informações de Apoio
Tabela S1.
correlação do genótipo rs16917496 e nível de expressão set8
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077024.s001
(DOC)