Abstract
Antecedentes e Objectivos
Prostate câncer (PCA) é um dos cancros mais comuns e principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos homens. Triagem de massa tem sido realizado desde os anos 1990, utilizando antígeno específico da próstata (PSA) níveis no soro como um biomarcador CaP. No entanto, apesar de PSA é um excelente marcador específico do órgão, que não é um marcador específico para o cancro. Portanto, o objetivo deste estudo foi descobrir novos biomarcadores para o diagnóstico de CaP.
Materiais e Métodos
Estamos focados em amostras de urina anulada após a massagem da próstata (toque retal [DRE]) e realizou uma análise peptidomic destas amostras usando laser de dessorção /ionização espectrometria assistida por matriz de tempo-de-voo de massa (MALDI-TOF /MS
n). biomateriais urinários foram concentradas e dessalinizadas utilizando CM-Sepharose antes para as seguintes análises serem realizadas por MALDI-TOF /MS
N: 1) análise diferencial de espectros de massa; 2) a determinação das sequências de aminoácidos; e 3) análises quantitativas utilizando um padrão interno marcada com isótopo estável.
Resultados
A análise multivariada do espectro de massa MALDI-TOF /MS de extratos urinário revelou um peptídeo 2331 Da em amostras de urina seguinte DRE. Este péptido foi identificado como um fragmento C-terminal de PSA composta por 19 resíduos de aminoácidos. Além disso, a análise quantitativa da relação entre os péptidos sintéticos e intactos marcados com isótopos usando MALDI-TOF /MS revelou que este péptido pode ser um novo biomarcador candidato patognomónica que pode diferenciar pacientes com CaP de indivíduos não-cancerosas.
Conclusão
os resultados do presente estudo indicam que a da fragmento de 2331 peptídeo de PSA pode tornar-se um novo biomarcador patognomônico para o diagnóstico de CaP. A posterior investigação em larga escala está em andamento para avaliar a possibilidade de uso desse peptídeo na detecção precoce de CaP
Citation:. Nakayama K, Inoue T, Sekiya S, Terada N, Miyazaki Y, Goto T, et ai. (2014) O C-Terminal Fragmento de Antígeno Prostático Específico, a 2.331 Da Peptide, como candidato New urinária patognomônico biomarcador para o diagnóstico do cancro da próstata. PLoS ONE 9 (9): e107234. doi: 10.1371 /journal.pone.0107234
editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria
Recebido: 12 de junho de 2014; Aceito: 08 de agosto de 2014; Publicação: 18 de setembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Nakayama et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Esta pesquisa foi concedido pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência através do “Programa de Financiamento para o World-líder inovador R D em Ciência e Tecnologia (primeiro programa) “, iniciado pelo Conselho de política de Ciência e Tecnologia. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Shimadzu Corporation forneceu apoio sob a forma de salários para os autores, Sadanori Sekiya, Shigeki Kajihara, Shin-Ichiro Kawabata, Shinichi Iwamoto e Koichi Tanaka, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar, ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção autor contribuições ‘
Conflito de interesses:. Sadanori Sekiya, Shigeki Kajihara, Shin-Ichiro Kawabata, Shinichi Iwamoto e Koichi Tanaka são empregados por Shimadzu Corporation. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.
Introdução
O câncer de próstata (PCA) é um dos os cancros mais comuns e a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em homens [1]. Os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de CaP ainda não foi determinada devido à sua heterogeneidade clínica e histológica. A incidência de CaP aumentou acentuadamente no Japão recentemente [2], [3]. A detecção clínico em grande escala de níveis de antigénio específico da próstata (PSA) no soro como um biomarcador CaP foi levada a cabo desde a década de 1990 [3] – [7]. Embora os benefícios e os riscos de rastreio PSA população para câncer de próstata globais continuam a ser avaliada [8], a PSA é conhecido por ser um excelente específicas do órgão, mas não um marcador específico do cancro [9], que continua a ser um problema clínico . Isso é agravado pelo maior de estar, população e níveis elevados de PSA associados com o aumento da idade [3], [10].
Embora a sensibilidade do PSA na detecção de câncer é alta, sua especificidade é o envelhecimento limitadas, e de rastreio homens saudáveis, muitas vezes faz com que os alarmes falsos de câncer (por exemplo, devido a inflamação ou hiperplasia benigna) e desnecessárias biópsias da próstata [3], [11]. Vários problemas foram identificados em relação à sensibilidade sub-óptima dos testes de PSA para a triagem APC, que levar a biópsias desnecessárias, overdiagnoses e overtreatments [12] – [17]. Uma quantidade significativa de esforço na pesquisa está sendo direcionada para melhorar a precisão da triagem CaP [12]. Além disso, uma ênfase tem sido colocada sobre a necessidade de identificar novos biomarcadores para o diagnóstico de CaP.
técnicas proteômicas aplicados a soro, plasma, urina, e pode fornecer informações valiosas sobre biomarcadores e padrões de marcadores, que pode ser utilizado para melhorar a detecção de cancro [18]. No presente estudo, nós nos concentramos em amostras de urina anulada após a massagem da próstata (toque retal [DRE]), que eram esperados para conter muitos peptídeos e fragmentos de proteínas secretadas a partir de microambientes da próstata que poderiam permitir a detecção de produtos da próstata secretadas como fontes potenciais de biomarcadores CaP específicas-[18], [19]. Portanto, realizamos análises peptidomic e proteômica de amostras de urina usando laser de dessorção /ionização espectrometria assistida por matriz de tempo-de-voo de massa (MALDI-TOF /MS
n), a fim de descobrir novos potenciais candidatos biomarcadores patognomônicos para o diagnóstico de CaP.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Este estudo foi realizado com a aprovação da Comissão da Escola de Pós-graduação Universidade de Kyoto de Medicina de Ética. O consentimento informado foi obtido de todos os casos para os exames e experimentos realizados. materiais clínicos foram utilizadas após foi obtido consentimento informado por escrito, de acordo com protocolos aprovados pelo Conselho do Hospital Universitário de Kyoto Institutional Review.
Os pacientes
Os indivíduos a partir do qual as amostras de urina foram coletadas após a massagem da próstata ( exame de toque retal [DRE]) foram classificados em 2 grupos; ou seja, os pacientes APC e indivíduos não-cancerosas. A confirmação do diagnóstico do CaP foi feita por um diagnóstico histológico de amostras de biópsia da próstata ou glândulas próstata removida após a cirurgia, quando realizada. Cinquenta amostras foram colhidas a partir de pacientes com CaP, e as suas características clínicas foram mostradas na Tabela 1. As características clínicas dos pacientes não-cancerosas foram mostrados na Tabela 2. Todas as amostras de urina a partir do grupo de não-cancro foram recolhidos antes da enucleação laser de Hólmio do próstata (HoLEP), ressecção transuretral da próstata (RTU) e biópsia de agulha da próstata, quando realizada. O diagnóstico de indivíduos não-cancerosas foram definidos como não-malignas por diagnósticos histológicos de glândulas da próstata removidos por HoLEP e TURP e espécimes de próstata obtidas por biópsia de agulha, excepto dois casos (# 14 e 15) que não receberam biópsia de agulha por causa da muito baixo PSA e DRE normal. Dezenove amostras não-cancerosas foram recolhidos. Todos os diagnósticos histológicos foram confirmados por patologistas geniturinárias em nosso hospital.
produtos químicos e reagentes
Tris [hidroximetil] aminometano (Tris), Triton X-100 e ureia eram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Molecular Biology grau 3 – [(colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulfonato (CHAPS) foi adquirido de Calbiochem (San Diego, CA, EUA). Toda a água utilizada nesta experiência, excepto para o sistema de HPLC, foi preparado utilizando um sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EUA). Acetonitrilo (ACN) com e sem 0,1% de ácido fórmico (FA), e água com e sem 0,1% de FA para LC-MS Chromasolv foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Todos os outros reagentes foram da mais alta qualidade disponível no mercado
coleta de amostras de urina
As amostras de urina foram coletadas as seguintes:. Um urologista realizada DRE por massageando suavemente cada lado da próstata em três vezes, o que estimulou a circulação e a libertação de fluidos da próstata para a uretra. Estes fluidos da próstata foram coletadas quando os assuntos anulado urina após a massagem. As amostras de urina recolhidas foram filtradas com filtros de células de nylon de 100 ^ m (BD Falcon, San Jose, CA, EUA) e centrifugada a 2000 × g durante 10 min a 20 ° C para excluir detritos urinária. Após centrifugação, os sobrenadantes foram filtrados de novo com os filtros de células. O sobrenadante foi filtrado das amostras de urina foi armazenada a -80 ° C até análise posterior.
preparação de amostras de urina
No presente estudo, os péptidos e fragmentos de proteínas urinárias capturados pela resina de Sepharose de troca iónica foram analisados utilizando MALDI-TOF /MS
n. CM-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) foi utilizada como uma resina de permuta iónica para capturar e concentrar os péptidos e fragmentos de proteína na amostra de urina, assim como para dessalinizar amostras concentradas. Um in-house construído MALDI ion trap digitais (DIT) TOF /MS
n fabricado pela Shimadzu Corporation (Kyoto, Japão) foi utilizado para a análise de espectro de massa. analisa diferencial dos dados do espectro de massa urinário entre 2 grupos de sujeitos (não-câncer e PCA) foram realizados usando o modo reflectrão ion-trap de MALDI-DIT-TOF /MS. identificações de pico, também foram realizadas no modo de reflectrão ion-trap. listas de pico obtidos a partir MS
2 espectros foram utilizados para identificar a sequência de aminoácidos com a mascote MS
2 motor de pesquisa (científica Matrix, London, UK).
amostras de urina congelada (1,0 mL) foram descongeladas por centrifugação a 1000 × g durante 15 min a 20 ° C. Quatrocentos mL de tampão de lise (ureia 9 M, CHAPS a 2%, Tris 50 mM, pH 9) foi adicionado a cada amostra de urina e as misturas foram incubadas durante 30 min a 4 ° C com rotação. As amostras de urina desnaturadas foram adicionados a 3,6 tampões de ligação ml (acetato de amónio 100 mM, pH 4, 0,05% de Triton-X). Noventa uL de 30% de CM-Sepharose activada foi adicionada a cada uma das misturas acima tampão de ligação e submetido a vórtice extensamente. Os tubos foram incubados durante 30 min a 4 ° C com rotação. Depois de serem incubados, os tubos foram centrifugados a 1000 × g durante 10 min a 20 ° C. Os sobrenadantes foram descartados utilizando uma Finnpipette de 5 mL F1 (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlândia). Os precipitados, péptidos CM-Sepharose-capturados e fragmentos de proteínas, foram transferidas para microtubos de 1,5 mL.
As resinas foram lavadas três vezes com tampão de ligação e água destilada para a LC-MS. Lavar envolvido centrifugação (3000 x g durante 3 min a 20 ° C com tampão e 5000 × g de ligação durante 3 min a 20 ° C com água destilada), descartando o sobrenadante, e a adição de soluções de lavagem. No passo de lavagem final, os tubos foram centrifugados a 10000 x g durante 5 min a 20 ° C e o máximo de lavagem com água destilada possível foi retirado. Vinte e cinco ul de solução 1% de ácido trif luoroacético (TFA) foi adicionado à resina de CM-Sepharose para eluir os péptidos capturados e fragmentos de proteínas, e pipetado bem durante 2 minutos. Os tubos foram centrifugados a 12000 x g durante 5 min a 20 ° C. Apenas os sobrenadantes foram retirados e transferidos para outras microtubos. Os tubos foram centrifugados a 14000 x g durante 5 min a 20 ° C e os sobrenadantes foram transferidos para outros microtubos. Estes sobrenadantes serviu como os extractos de amostra de urina.
alvo péptidos intactos e fragmentos de proteínas, entre 1000 e 5000 Da em amostras de urina, porque as suas sequências de aminoácidos pode ser directamente confirmada por MALDI-TOF-DIT /MS
2 nesta gama de peso molecular.
matriz DHB e solução de matriz MALDI placa
DHB (ácido 2,5-di-hidroxibenzóico) foi preparada por dissolução de 5 mg de DHB (LaserBio Labs, Sophia Antipolis Cedex, França) em 500 ul de 50% de acetonitrilo /0,1% de TFA. Na análise da matriz de DHB, uma alíquota de 0,5 ul do eluato foi misturado com um volume igual de solução de matriz DHB. As amostras foram pré-misturados os seguintes manchados em placas e à temperatura ambiente, secou-se ao ar; placa μFocus MALDI 900 mícrons (384 círculos, HST, Inc., Newark, NJ, EUA) para o diferencial de análises de espectros de massa ou de uma chapa de aço inoxidável-alvo de 384 posições (Shimadzu Biotech, Kyoto, Japão) para as análises quantitativas de um potencial biomarcador para o diagnóstico da do CaP.
medições de massa Espectrométricos
Em MALDI-DIT-TOF /MS
n, gás argônio foi usado para fragmentação dissociação induzida por colisão e gás hélio foi utilizado para o arrefecimento de iões. MS e MS
n análises foram realizadas no modo de ião positivo extracção. Todas as análises foram realizadas sob uma condição de vácuo elevado (5 × 10
-5 Pa ou menos).
Os espectros de massa foram calibrados externamente com um preparado manualmente 7-peptídeo padrão, consistindo de angiotensina II ([M + H]
1.046,54), a angiotensina I ([M + H]
1.296,69), Glu-fibrinopeptide B ([M + H]
1.570,68), substrato N-acetil renina ([M + H]
1.800,94), ACTH (1-17) ([M + H]
2.093,09), ACTH (18-39) ([M + H]
2.465,20) e ACTH ( 7-38) ([M + H]
3657,93)
as condições de medição do diferencial das análises de espectros de massa foram fixados como segue:. 1) uma placa μFocus foi utilizada como a placa de destino, dois ) o laser de irradiação posições foram focado manualmente para a amostra de matriz-mistura de cada poço, 3) o número de pontos de irradiação foi de 100, 4) o número de disparos de irradiação foi de 64, e 5) a potência do laser foi fixada em 85 unidades arbitrárias. Um total de 6400 espectros foram medidos por poço. As análises foram realizadas em duplicado e extraiu-se uma aliquota foi colocado em 2 poços. Por conseguinte, os dados de uma amostra de urina foram compostas de 4 pontos de dados em bruto com 6400 espectros. O coeficiente de variação da intensidade em vários picos principais, especialmente em um pico biomarcador candidato, tornou-se menos do que 10% sob estas condições analíticas (dados não mostrados).
O processamento de dados de dados do espectro de MS e análise multivariada
dados brutos do espectro de massa foram exportadas através DIT-FP Console software (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão) para MALDI-DIT-TOF /MS como arquivos mzXML e importados para o software MATLAB versão 7.11 (The Mathworks Inc., Natick, MA, EUA). MATLAB foi apoiada por Bioinformatics Toolbox e Estatística Toolbox. O processamento de dados seguinte foi realizada utilizando as funções de caixa de ferramentas, a fim de detectar e alinhar picos de espectros múltipla. 1) Um espectro lisa foi obtido utilizando gráfico de dispersão ponderada localmente suavização (função mslowess [20]). 2) A linha de base foi subtraído a partir do espectro utilizando uma aproximação de spline (função msbackadj [21]). 3) O espectro foi normalizado dividindo por a corrente total de iões. 4) Os picos foram detectados por filtragem de ruído com a wavelet discreta undecimated transformar (função mspeaks [22]). 5) as listas de pico foram gerados a partir de espectros de múltiplos repetindo o processamento de 1) a 4). 6) listas de pico foram alinhados para coincidir com picos em todo espectros (função mspalign [23]). listas de pico CSV-formatado foram então exportados do MATLAB e importados para um software de análise multivariada, isto é, SIMCA 13.0.3 (Umetrics AB, Umeå, na Suécia; [24], [25]). Todos os dados importados foram Pareto escalado antes da análise multivariada. Análise de Componentes Principais (PCA) foi utilizado para análises multivariadas sem supervisão, e ortogonais mínimos quadrados parciais análise discriminante (OPLS-DA) foi utilizado para análises multivariadas supervisionado. modelos PCA e OPLS-DA foram descritos como parcelas de pontuação (componente principal [PC1, PC2]), que exibiu qualquer agrupamento intrínseca das amostras com base nas variações espectrais. Na análise OPLS-DA, biomarcadores potenciais foram seleccionados com base no S-trama. O enredo da covariância em relação a correlação em conjunto com os gráficos de tendência de variáveis resultou na visualização mais fácil dos dados. As variáveis que mudaram mais foram plotados na parte superior ou inferior do “S” em forma de enredo, e aqueles que não variou significativamente foram plotados no meio.
purificação Peptide e Edman degradação
na análise de degradação de Edman da sequência de aminoácidos N-terminal de
m /z 2332
péptido, a purificação do péptido por HPLC de fase inversa foi realizada utilizando um sistema de HPLC Shimadzu série LC-20AD equipado com um SPD-M20A detector por arranjo de diodos (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão). A Luna C-18 de coluna (5 ^ M de tamanho de partícula; ID de 4,6 milímetros x 250 mm; Phenomenex, Torrance, CA, EUA) foi utilizado para o processo de purificação. As condições de HPLC utilizadas foram como se segue: a temperatura do forno da coluna foi de 40 ° C, a taxa de fluxo foi de 1,0 mL /min, água com 0,1% de FA e ACN com 0,1% de FA foram utilizados como solventes A e B, respectivamente, a condição gradiente foi mantida a 10%, como dissolvente B, durante 2 min, após uma injecção de amostra de 20 mL e foi linear de 10% a 80% durante 15 min. péptidos eluídos foram monitorizados a 276 nm. O peptídeo eluiu entre 6,6 min e 6,9 min foi reunido para um microtubo.
A degradação de Edman automatizada da sequência de aminoácidos N-terminal foi realizada em péptidos purificados RP-HPLC utilizando um sequenciador Procise Modelo 491 (Applied Biosystems , Inc., Foster City, CA, EUA).
peptídeos Aqua e análises quantitativas
Foram obtidos peptídeos sintéticos não marcados e peptídeos sintéticos marcados com isótopos estáveis da Sigma-Aldrich Japão (Ishikari , Japão). Um péptido AQUA personalizado definido para a espectrometria de massa foi sintetizado por Sigma-Aldrich Japão até mais de 95% de pureza, foi repartido em 1,0 nmol, e foi armazenado como pó liofilizado a -30 ° C até à sua utilização. A sequência de aminoácidos do péptido-AQUA isótopo marcado foi YTKVVHY [R-
13C
6, –
15N
4] KWIKDT [I-
13C
6, –
15N] VANP. Subsequentemente, o incremento de peso molecular no péptido marcado com isótopo (em relação ao péptido não marcado) foi de 17 Da. Este péptido foi utilizado como um padrão interno (ISTD) para as análises quantitativas de um potencial candidato biomarcador para o diagnóstico de CaP. Os péptidos foram dissolvidos AQUA a 1,0 pmol /ul usando 1000 mL de 10% (v /v) de ácido acético de grau LC-MS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). A solução-mãe era (100 mL) foi colocado em 500 uL microtubos e foi armazenada em -30 ° C até à sua utilização.
Vinte pmol (20 pmol) do péptido ISTD (solução a 20 ul) foi misturado para a solução de mistura do tampão de amostra de urina e de lise, e, em seguida, incubadas durante 30 min a 4 ° C com rotação. Os seguintes procedimentos foram realizados de acordo com o método de preparação da amostra de urina. As análises quantitativas foram realizadas utilizando MALDI-TOF-DIT /MS. Em análises quantitativas utilizando MALDI-dit-TOF /MS, as condições de medição foram fixados como segue: 1) uma placa-alvo de aço inoxidável foi utilizada, 2) as posições de irradiação com laser foi focalizado manualmente para a amostra de matriz-mistura de cada poço, 3) o número de pontos de irradiação foi de 200, 4) o número de disparos de irradiação foi de 16, e 5) potência do laser foi fixada em 85 unidades arbitrárias. Um total de 3200 espectros foram medidos por poço. As análises foram realizadas em duplicado e extraiu-se uma aliquota foi colocado em 2 poços. Por conseguinte, os dados de uma amostra de urina foram feitos de 12800 espectros. Este método foi referido e modificado a partir dos métodos descritos por K. Sogawa et ai. [26] e Tyan YC., Et ai. [27]. As concentrações do candidato biomarcador foram calculados com base na proporção de área de pico-a a
m /z 2332
contra que a
m /z 2349.
estatísticas
Todas as análises estatísticas do presente estudo foram realizadas utilizando JMP 10.0.2 software estatístico (SAS Institute Japan Inc., Tóquio, Japão). O teste de Mann-Whitney-Wilcoxon, também chamado o teste de Mann-Whitney, o teste foi utilizado para identificar uma diferença significativa não paramétrica entre dois grupos. Diferenças com
foram considerados valores p
de menos de 0,05 a ser significativo. operating characteristic (ROC) Receptor estimados pelo software estatístico foram utilizados para avaliar a precisão de testes de diagnóstico que renderam resultados dos testes contínuos. Além disso, as curvas ROC foram utilizados para avaliar o poder preditivo do biomarcador pathognomonic identificados no presente estudo [28].
Resultados
níveis
Idade e séricos de PSA não são significativamente diferentes entre non-cancer assuntos e pacientes CaP usado como uma descoberta set Online
a fim de avaliar as diferenças de espectro de massa entre as amostras de urina de 12 indivíduos não-cancerosas e 15 pacientes APC, as seguintes análises foram realizadas como um conjunto de descoberta. Como mostrado na Figura 1a e b, não foram observadas diferenças significativas nas distribuições de idade ou séricos de PSA entre os grupos CaP não-câncer e. Estes resultados indicaram que as amostras de urina da mesma idade poderia ser usado em análises subsequentes.
Idade (a) e PSA sérico (b) distribuições entre indivíduos não-câncer e pacientes de câncer de próstata (PCA) foram mostrados. Não foram observadas diferenças significativas na idade ou PSA no soro entre indivíduos não-cancerosas (n = 12) e pacientes PCA (n = 15). Seus
P valores
foram 0,255 e 0,464, respectivamente.
Os espectros de massa utilizando MALDI-DIT-TOF /MS analisa
de alta resolução e alta sensibilidade MALDI -DIT-TOF /MS
n foi utilizada para analisar peptídeos urinários e fragmentos de proteínas no presente estudo. Os espectros de massa típico dos péptidos urinários e fragmentos de proteína analisados utilizando o modo de reflectrão por captura de iões de MALDI-TOF-DIT /MS são mostrados na Figura 2. Após a concentração e a dessalinização de amostras de urina por CM-Sepharose, o eluente foi extraída com uma solução de TFA a 1,0%. DHB foi usado como matriz MALDI. Os espectros de massa de amostras extraídas a partir de a) indivíduos não-cancerosas e b) pacientes com CaP foram comparados. Vários foram detectadas diferenças nesses espectros de massa entre os dois grupos. O pico mais pronunciado foi detectada a
m /z 2332,3
.
Depois de se concentrar e amostras de urina de dessalinização por CM-Sepharose, o eluente foi extraída com solução de TFA a 1,0%. DHB foi usado como matriz MALDI. Figura 2A e 2B mostram os resultados analíticos de extractos de urina de indivíduos não-cancerosas e pacientes APC, respectivamente.
A análise multivariada do espectro de massa de extratos urinário utilizando software SIMCA
A exportados arquivos pico de matriz por MATLAB foram importados para um software de análise multivariada, ou seja, SIMCA 13.0.3. Todos os dados importados foram Pareto escalado para as análises multivariadas. A análise de componentes principais (PCA) foi inicialmente conduzida nos espectros das amostras de urina para determinar se as diferenças de espectro de massa existia entre os grupos CaP não-câncer e. Uma análise discriminante parcial ortogonal dos mínimos quadrados (OPLS-DA) foi então utilizado para maximizar a covariância entre os dados medidos (posições de pico e intensidades de pico) e classificação da doença. Uma S-enredo foi usado para selecionar e indicar os candidatos potenciais biomarcadores de biomateriais significativos relacionados com a separação do grupo.
O PCA marcar parcelas em PC1 (R
2 = 0,217) e PC2 (R
2 = 0,148) mostraram agrupamentos pouco claras entre os grupos CaP não-câncer e (R
2X [cum]: 0,556 e Q
2 [cum]: 0,271; Figura 3a). Em contraste, as parcelas de pontuação OPLS-DA distinguiu o grupo CaP do grupo não-câncer (R
2X [cum]: 0,309, R
2A [cum]: 0,722 e Q
2 [cum] : 0,058; Figura 3b). O OPLS-DA foi um modelo adequado para distinguir do grupo de CaP de entre o grupo não-cancro. Uma análise S-trama com base no modelo de DA-OPLS em relação com a proporção das intensidades de pico de espectros de massa relativa à APC e não cancerosa é mostrado na Figura 3c. As intensidades de pico em torno de
m /z
2.332,3 foram isolados da S-enredo como novos biomarcadores potenciais patognomônicos de distinção entre os grupos CaP não-câncer e.
(a) enredo pontuação PCA indicando a discriminação entre não-câncer e PCA no conjunto de descoberta. (B) parcela pontuação OPLS-DA mostrando uma clara discriminação entre não-câncer e PCA. (C) S-enredo correspondente à parcela pontuação OPLS-DA mostrado na Figura 3B. Um candidato potencial biomarcador urinário foi extraído em um pico por volta de
m /z
2332,3 para o diagnóstico de pacientes APC.
Identificação de fragmentos de peptídeos em m /z 2332,3
O espectro de massa de uma amostra de urina de um doente de PCA por MALDI-TOF-DIT /MS
2 análise é mostrado na Figura 4a. O mascote MS
2 motor de busca do
espectro de massa MS 2 indicaram que o
m /z
2332 peptídeo era um fragmento C-terminal de PSA. Este resultado sugeriu que o fragmento de PSA foi composto por 19 resíduos de ácidos aminados as seguintes: YTKVVHYRKWIKDTIVANP. A MALDI-TOF-DIT /MS
2 Espectro de massa do péptido sintetizado (Medical Biological Laboratories Co., Ltd, Nagoya, Japão) coincidiu com a do urinária
m /z 2332
peptídeo (Figura 4b), que confirmaram que ambos os péptidos consistia na mesma sequência de aminoácidos: YTKVVHYRKWIKDTIVANP. Além disso, a sua sequência de aminoácidos, a qual foi determinada por degradação de Edman, confirmou que era um fragmento C-terminal de PSA que consistiu nos resíduos de aminoácidos 19 (dados não mostrados). No presente estudo, nós nos concentramos em amostras de urina anulada após a massagem da próstata, ou seja, o exame de toque retal (DRE). A origem do péptido a
m /z 2332
foi investigada, e os espectros de massa foram comparados com as fracções extraídas de amostras de urina antes e depois DRE (Figura 5). O pico em
m /z
2332 foi detectado exclusivamente após DRE. Estes resultados suportam fragmentos peptídicos 2331 Da a ser segregada a partir das glândulas prostáticas de DRE.
(a) a sequência de aminoácidos de
m /z
2332 foi identificado nas amostras de urina de pacientes com CaP e estima usando o MS
2 análises ea mascote MS
2 motor de busca. As sequências de aminoácidos N-terminais do péptido foram confirmados completamente com base em dados obtidos pela degradação de Edman do péptido purificado. A sequência foi confirmada como se segue: YTKVVHYRKWIKDTIVANP. (B) MS
2 comparações espectro do
m /z 2332
péptido entre um material sintetizado (1) e biomaterial extraído das amostras de urina de pacientes com CaP (2). O 2 MS resultante
2 espectros do
m /z
2332 peptídeos combinados completamente.
análises quantitativas de um novo potencial biomarcador pathognomonic utilizando MALDI-DIT- TOF /MS
como anteriormente foi mostrado, a intensidade do pico a
m /z 2332,3
foi isolado a partir do S-trama como um potencial candidato biomarcador para distinguir entre os grupos CaP e não-cancro . Assim, a 2.331 peptídeo Da urinária foi avaliada quantitativamente utilizando 50 amostras de urina de pacientes anuladas PCA (Tabela 1) e 19 de indivíduos não-cancerosas (Tabela 2) após massagem da próstata. Uma parte de cada conjunto de dados também tinha sido utilizado no passo de descoberta.
As distribuições de idade e de PSA de todos os sujeitos estão apresentados na Figura 6a e b. Não foram observadas diferenças significativas na idade ou distribuição de PSA entre o não-câncer (n = 19) e PCA (n = 50) grupos.
Idade (a) e PSA sérico (b) distribuições entre non-cancer assuntos e pacientes CaP nos conjuntos de validação. Não foram observadas diferenças significativas na idade ou PSA no soro entre indivíduos não-cancerosas (n = 19) e pacientes PCA (n = 50). Seus
P
valores foram de 0,364 e 0,076, respectivamente.
Uma amostra de urina analisadas representativo com a adição do padrão interno (ISTD) foi usada para estimar a razão entre as áreas dos picos em
m /z
2332 para um péptido não marcado sintético e em
m /z
2348 para um estábulo péptido sintético marcado com isótopo (YTKVVHY [R-
13 C
6, –
15 N
4] KWIKDT [I-
13 C
6, –
15N] VANP), respectivamente. O conteúdo adição do ISTD (2348 Da quantidade peptídeo marcado com isótopo estável) foram fixados em 20 pmol /1,0 ml de urina. Uma curva padrão para a quantidades adicionais do péptido 2.331 Da é mostrado na Figura 7a. Observou-se uma forte correlação entre a relação de área de pico entre
m /z
2332 e 2349 e as 2331 quantidades de peptídeos Da adicionais, com uma equação de regressão de y = 0.0243x + 0,0722 (eixo-x: os montantes adicionais de o 2331 peptídeo da; relação de área de pico da
m /z
2332 /
m /z
2349 [ISTD];; eixo y R
2 = 0,996). Obteve-se uma curva padrão linear
(a) relação entre a razão entre a área do pico
m /z 2332 e 2349
(estável marcada com isótopo péptido sintético; padrão interno [ISTD])., e adicional de 2331 Da (sintética não marcado) quantidades de peptídeos. O conteúdo adicionais da ISTD foram fixados em 20 pmol /1,0 mL de urina. Uma curva padrão sobre os montantes adicionais do peptídeo 2331 Da é mostrado. correlações adequadas foram observadas nas análises quantitativas do péptido 2331 Da utilizando MALDI-TOF-DIT /MS. (B) Uma comparação entre as categorias patológicas e 2331 as concentrações de peptídeos Da urinário. Foi observada uma diferença significativa (
p = 0,0016
) entre os grupos não-câncer (n = 19) e PCA (= 50 n). (C) As curvas ROC foram calculadas a partir dos resultados quantitativos dos dois grupos (isto é, o PCA não-cancro e). As AUCs do nível sérico de PSA e urinária 2.331 concentração de peptídeo Da foram 0,639 e 0,747, respectivamente. Em relação PSA no soro, o nível de corte de 3,82 ng /mL apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 36,9%. Em relação urinária 2331 peptídeo Da, o nível de corte de 40,6 ng /mL apresentou sensibilidade de 86,0% e especificidade de 57,9%.
Foi observada uma diferença significativa em 2331 as concentrações de peptídeos Da urinário entre o não-câncer e grupos CaP (Figura 7b). As medianas da concentração de peptídeo 2331 Da nos grupos CaP não-câncer e foram 36,8 e 117 ng /mL, respectivamente. Este resultado indicou que poderia ser possível distinguir pacientes CaP de indivíduos não-cancerosas.
As curvas ROC calculados a partir destes resultados de dois grupos são apresentados na Figura 7c. Em relação de PSA no soro, uma área sob a curva (AUC) foi de 0,639. O nível de corte de 3,82 ng /mL apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 36,9%. Por outro lado, uma AUC foi de 0,747 em relação urinária 2331 Da péptido. O nível de corte de 40,6 ng /mL apresentou sensibilidade de 86,0% e especificidade de 57,9%.
Não foram observadas correlações entre as 2.331 Da concentração de peptídeo e os níveis séricos de PSA ou estágios CaP ou a pontuação de Gleason pacientes (dados não mostrados)
Discussão
O diagnóstico de câncer representa um grande desafio para a pesquisa e tratamento clínico.; extensa genômica, transcriptomic, e os estudos de proteômica estão sendo realizados para descobrir e identificar candidatos biomarcadores para uso em sistemas de alto rendimento capazes de grande rastreio da população [29].