Abstract

população lado Câncer (SP) células, que são muitas vezes referidos como células-tronco cancerosas, são: PLOS ONE pensado para ser responsável por câncer de pulmão resistência à quimioterapia e, atualmente, nenhuma droga pode visam especificamente estas células. Nós supomos heparina de peso molecular baixo (HBPM) podem afectar as propriedades biológicas das células SP e pode ser utilizado clinicamente como alvo estas células. Para testar isto, células SP foram isolados a partir de cisplatina (DDP) A549 células resistentes ao adenocarcinoma do pulmão /DDP por triagem de citometria de fluxo. Em comparação com células não-SP, células SP formado aumento do número de colónias

in vitro

, e teve um aumento de 1000 vezes na tumorigenicidade

in vivo

. Os ensaios de proliferação e apoptose demonstrado HBPM não teve nenhum efeito significativo na proliferação de células do pulmão de SP ou apoptose. No entanto, a LMWH reduzida capacidade pulmonar SP formação de colónias de células e expressão de proteína do transportador de múltiplas drogas, ABCG2, por FACS e análises de Western blot, sem afectar os seus níveis de ARNm por RT-PCR. Consistentemente, colorações imuno-histoquímica de ABCG2 em tecidos tumorais tratadas com LMWH foram significativamente reduzidos em comparação com os de controlos. Além disso, encontramos MG132 inibidor proteossómica, mas não lisossômico inibidores leupeptina e pepstatina A, poderia restaurar os níveis de proteína ABCG2 em células SP tratados com HBPM. Estes sugerem LMWH ablates chemoresistance células pulmonares SP por redução mediada por proteassoma dos níveis de proteína ABCG2 sem afetar seus níveis de mRNA. Nós também determinou LMWH combinado com cisplatina poderiam superar cisplatina-resistência e células de pulmão SP apoptose induzida tanto

in vitro

e

in vivo

. Este estudo fornece uma base experimental para a utilização de uma combinação de HBPM, que tem como alvo as células SP pulmonares, com quimioterapia para melhorar a sobrevivência do cancro do pulmão

Citation:. Niu Q, Wang W, Li Y, Ruden DM, Wang F, Li Y, et al. (2012) de baixo peso molecular heparina ablates Lung Cancer Cisplatina-resistência através da indução de proteassoma-Mediated Degradação ABCG2 Protein. PLoS ONE 7 (7): e41035. doi: 10.1371 /journal.pone.0041035

editor: Giuseppe Viglietto, Universidade Magna Grécia, Itália |

Recebido: 12 Março, 2012; Aceito: 17 de junho de 2012; Publicado: 23 Julho 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Niu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Científica para os Retornados ultramarinos estudiosos chineses, a China Ministério de Educação do Estado (No. 2007-1108) para QN e National Institutes of Health conceder ES012933 a DMR. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a causa mais comum de morte por câncer no mundo. Atualmente, as taxas de sobrevivência de câncer de pulmão são pobres, com uma taxa de sobrevida em 5 anos de 15% [1].

A célula-tronco cancerosas (CSC) teoria afirma que os tumores são organizados de forma hierárquica semelhante a tecidos normais , com uma sub-população de células estaminais do tipo tumorigénicas que são resistente à quimioterapia, e geram as células tumorais diferenciadas [2]. população lateral (SP) células com propriedades CSC-como foram inicialmente identificados na leucemia e subsequentemente isolado a partir de tumores sólidos, incluindo cancro da mama, do cérebro, do pulmão, do fígado, da próstata, do cólon, do pâncreas, e da cabeça e cancro do pescoço [3] – [9] . células SP expressam altos níveis de ATP cassete de ligação (ABC) proteínas multidroga transportador que se acredita ser a base da resistência à quimioterapia e falha do tratamento. proteína de resistência do cancro da mama (BRCP /ABCG2), um membro de ABC proteínas da família, é um importante transportador de droga que é considerado como desempenhar um papel fundamental na protecção das células de SP de agentes citotóxicos, tais como cisplatina, e está envolvido na resistência a múltiplas drogas [10 ] – [12]

Apesar do facto de ter sido identificados diversos agentes que têm como alvo células CSC, estes agentes potenciais estão longe de utilização na clínica.. As moléculas de direccionamento de células CSC candidato afetam Wnt, EpCAM, Hedgehog, e sinalização Delta /Notch, enquanto outras abordagens, incluindo anti-Delta-like ligante 4 (DLL4) de anticorpos, salinomicina, metformina, TGF, o sulforafano, e outros foram testados para modificar CSC propriedades de resistência a drogas [13] – [17]. Embora muitos destes agentes parecem promissores, especialmente

in vitro

, o grande problema da segmentação específica para as células CSCs e evitar o

in vivo

toxicidade permanece.

de baixo peso molecular (HBPM) foi aprovado pela FDA em 1998 para a terapia anticoagulante e foi administrado com segurança por mais de 13 anos [18]. Estudos mostraram que o tratamento com heparina de baixo peso molecular reduzida mortalidade por câncer em pacientes com trombose venosa profunda em vários tipos de câncer, o que não está relacionado com as diferenças nas taxas de mortalidade de tromboembolismo [19] – [21]. Apesar de vários estudos clínicos têm demonstrado que LMWH reduziu a mortalidade e prolonga a sobrevivência em pacientes com doença maligna sólidos avançados, o mecanismo através do qual LMWH exerce um efeito anticancerígeno permanece indefinido [22] – [25].

Nossa hipótese LMWH pode ser capaz de modificar as propriedades biológicas de células de pulmão SP com propriedades CSC-like. Portanto, este estudo investiga se LMWH afeta a proliferação de pulmão SP celular, apoptose, e chemoresistance, bem como o crescimento do tumor

in vivo

e cujo mecanismo LMWH tem efeitos. Nossos estudos sugerem LMWH poderia ser uma droga de células de pulmão SP segmentação segura que poderia ser imediatamente utilizado na clínica para superar a resistência à quimioterapia e melhorar a sobrevivência do cancro do pulmão.

Resultados

Side População Classificando

análise de citometria de fluxo com coloração de Hoechst33342 demonstrado que um SP de 10% -17% de células existia nas células A549 /DDP. Como um controlo positivo, os números de células foram SP diminuída na presença de verapamil, uma droga conhecida por inibir a bomba trasporter ABC responsável pelo fenótipo população lado. A pureza das células SP era 95% (média de 97%) e a pureza das células não-SP foi de 95%. células SP e não-SP A549 /DDP foram classificadas separadamente e utilizado nos experimentos posteriores (Figura 1)

.

(A) A549 /células DDP incubadas com Hoechst 33342, sem verapamil e da região em caixa indica o SP no FACS. (B) As células A549 /DDP incubadas com Hoechst 33342, na presença de verapamil, um controlo para identificar a região de SP em FACS. micrografias representativas de A549 colónias /DDP formadas após 10 dias a partir de (C) células de SP, e células não-SP (D) cultivadas em meio isento de soro e as células SP (e) (f), as células não-SP tratada com HBPM, barra de escala = 50 uM. (G) Entrar formadoras de colónias eficiência (CFE) de células SP e não-SP cultivadas em meio isento de soro,

p Art 0,05. (H) Os tumores formados após a inoculação de diferentes números de A549 /população lateral (SP) e não-SP células DDP em NOD /SCID após 14 dias.

LMWH Diminui SP celular Colony Formação Capacidade

a capacidade das células SP e não-SP para formar colônias foi testado

in vitro

. As colónias de ambos os tipos celulares eram visíveis após 10 dias; No entanto, o número de colónias foi significativamente aumentada em comparação com células SP células não-SP. A formação de colónias Log10 eficiência (CFE) de células SP foi significativamente maior do que as células não-SP (1,544 ± 0,150 vs 0,301 ± 0,082,

P

0,05, Figura 1). HBPM reduziu significativamente CFE em células SP (1,544 ± 0,150 vs 0,812 ± 0,082,

P

0,05) em comparação com células não-SP (0,301 ± 0,082 vs 0,295 ± 0,053, p 0,05).

células SP têm aumentado

in vivo

tumorigenicidade

O

in vivo ensaio tumorigênico

indicaram que 5 × 10

3 SP células foram suficientes para a formação de tumores

in vivo

, enquanto mais de 5 × 10

foram necessários 6 células não-SP para iniciar tumores (Figura 1). Os tumores foram encontrados em todos os seis ratinhos injectados com 5 x 10

5 e 5 x 10

4 SP células, mas não foi encontrado tumor em ratinhos injectados com o mesmo número de células não-SP. Não foram observados tumores quando 1 × 10

6 células não-SP foram inoculados. Conclui-se que houve diferença é maior do que 1.000 vezes na tumorigenicidade entre as células SP e não-SP.

LMWH não afeta Proliferação SP celular

O efeito da HBPM na proliferação de células SP foi determinada utilizando o ensaio de MTT. HBPM não teve nenhum efeito significativo na proliferação de células de SP em comparação com as células controlo (SP a taxa de inibição de células SP-tratada de LMWH foi de 3,11% ± 0,20%,

P

0,05, Figura 2).

coloração de anexina V em (a) células de controlo SP células (B) SP tratados com células de HBPM (C) SP tratados com cisplatina e células (D) SP tratados com HBPM mais cisplatina. (E) Quantificação de taxas de apoptose em A549 /células DDP SP induzidos por HBPM e DDP. Não foi observada diferença significativa nas células SP tratados com LMWH controle e. A apoptose induzida por HBPM mais DDP foi significativamente maior do que DDP sozinho (

P

0,05). (F) A taxa de inibição de células /DDP SP A549 tratadas com HBPM em ensaio MTT. Não foi observada diferença significativa na taxa de inibição de células SP tratados com LMWH controle e.

LMWH Aumenta cisplatina (DDP) induziu apoptose em células SP

O efeito da HBPM na apoptose em células SP foi analisada por FACS. Não houve diferença significativa na taxa de apoptose em células tratadas de LMWH de SP, e células SP de controlo (7,21% ± 0,81% vs 8,01% ± 0,91%,

P

0,05); No entanto, a taxa de apoptose na HBPM mais DDP tratada células SP (65,89% ± 5,98%) foi significativamente mais elevada do que as células tratadas com SP sozinha DDP (45,74% ± 4,12%,

P

0,05) e células de controle SP (8,01% ± 0,91%,

p Art 0,05, Figura 2).

LMWH Diminui Expressão da SP superfície celular marcador ABCG2

A549 /DDP células SP expressar ABCG2, CD243 (p-gp) e CD24 em níveis elevados. Após incubação com HBPM durante 36 h, a expressão da proteína ABCG2 foi significativamente reduzida em células SP: ABCG2 células expressando diminuiu de 42,25% ± 4,11% e 9,92% ± 4,08%, (

P

0,05, Figura 3) . Não se observou qualquer alteração significativa na expressão de P-gp e Oct-4, após incubação com HBPM (Figura 3).

(A) Expressão de ABCG2 (CD338) em células de SP de controlo e (B) induzida pela HBPM em células A549 /DDP sp. (C) A expressão da ABCG2 (CD338) em células tumorais e controlos (D) induzidas por HBPM na A549 /DDP SP células de tumor de xenoenxerto. (E) Quantificação da expressão da expressão do marcador de CSC induzida por SP de LMWH em células tumorais e células de xenoenxerto. LMWH reprimidos de forma significativa expressão de ABCG2 por FACS (

p Art 0,05).

Análise FACS de Expressão ABCG2 nas células tumorais

As células obtidas a partir do tumor xenoenxerto tecidos expressa ABCG2, CD243 (p-gp) e CD24. A expressão da proteína de ABCG2 em tecidos de tumor de ratinhos de LMWH tratados foram significativamente mais baixos do que aqueles em ratinhos de controlo (30,38% ± 2,13% vs 20,22% ± 2,01%,

P

0,05, Figura 3). Nenhuma mudança significativa foi observada na expressão de p-gp e Oct-4 após incubação com LMWH (Figura 3).

LMWH não afeta mRNA ABCG2 expressão em células SP e células tumorais com RT-PCR

para determinar se HBPM affets ABCG2 expressão ao nível do ARNm, foi realizada análise de qRT-PCR de células SP tratados com HBPM durante 16 horas e as células tumorais de murganhos tratados e de controlo de LMWH. Nenhuma mudança significativa foi encontrada no nível de mRNA ABCG2 após o tratamento LMWH (Figura 4). Assim, LMWH afeta improvável expressão ABCG2 em seu nível mRNA.

(A) ABCG2 mudanças de expressão de mRNA em células tumorais HBPM tratadas e células SP HBPM tratada. Quantitativa em tempo real de RT-PCR demonstra que a expressão de ARNm ABCG2 não foram significativamente alteradas em células tumorais ou células tratadas de LMWH SP LMWH tratado, em comparação com os controlos em (

P

0,05). β-actina foi utilizado como referência interna. (B) análise por Western blot da expressão em células SP ABCG2 tratados com HBPM, HBPM + MG123, HBPM + Pepstatina A + leupeptina, e controlo. células SP foram inicialmente tratadas com HBPM ou controlo durante 10 horas, e, em seguida, MG132 (10 uM), Pepstain A + leupeptina (cada 100 ug /ml), ou controlo foram adicionados de modo correspondente e incubou-se durante 6 horas. Em seguida, as células foram colhidas para análise de Western blot. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. As densidades das bandas de proteínas ABCG2 em western blot foram quantificados com o Quantidade programa One-4.6.2. (C) expressões ABCG2 em LMWH tratados e de controlo tecidos tumorais (IHC, SP × 200). A pontuação média SI de expressão ABCG2 em LMWH tratados tecidos tumorais foi 3,63 em comparação com a pontuação média SI de 9,13 em tecidos tumorais de controle (3,63 ± 1,69 vs 9,13 ± 2,03,

p Art 0,05).

ABCG2 Protein Expression pode ser restaurado pela proteossómica Inhibitor MG132 em células SP tratados com LMWH

Uma vez que não encontramos alteração significativa dos níveis de mRNA ABCG2 em células SP e tumorais, nós testamos se LMWH ABCG2 redução induzida é causada por protólise mediada por ubiquitina ou pelo lisossoma. Para testar isso, células SP foram tratados com HBPM, LMWH + MG132 e LMWH + Pepstatin A + Leupeptin. Como mostrado na figura. 4, a expressão da proteína em células SP ABCG2 LMWH tratado foi significativamente reduzido em comparação com o controlo que, em 16 horas após o tratamento. A redução pode ser restaurada por tratamento MG132 inibidor de proteossoma, enquanto inibidores lisossomais pepstatina A, leupeptina, mais não teve nenhum efeito. Estes sugerem que LMWH induzida degradação de proteínas ABCG2 através da via do proteassoma.

LMWH Tratamento Diminui Expressão ABCG2 proteína no tecido tumoral por imuno-histoquímica

expressão ABCG2 esteve presente em diferentes intensidades e distribuições diferentes de células por coloração imuno-histoquímica . Significativamente foi observada baixo nível de expressão de ABCG2 LMWH em tecidos de tumor tratados em comparação com os controlos. Seguindo os critérios de estadiamento de intensidade da coloração (SI), a pontuação média SI de expressão ABCG2 em LMWH tratados tecidos tumorais foi 3,63 em comparação com a pontuação média SI de 9,13 em tecidos tumorais de controle (3,63 ± 1,69 vs 9,13 ± 2,03,

p Art . 0,05, Figura 4)

crescimento do tumor da cisplatina Xenoenxerto crescimento Delay é aumentada em LMWH

a administração de LWMH mais DDP para A549 /camundongos portadores de tumor DDP resultou em uma redução significativa comparação com DDP sozinho (0,17 ± 0,05 cm

3 vs 0,29 ± 0,06 cm

3,

p Art 0,05) ou ratos de controle (0,44 ± 0,09 cm

3,

p

0,05) ao fim de 30 dias. Em A549 /DDP portador de tumor ratinhos nus, as diferenças na HBPM combinados com cisplatina e tratadas com cisplatina tumores era significativo após 25 dias (0,17 ± 0,03 centímetros

3 vs 0,24 ± 0,08 cm

3,

P Art 0,05) e dentro de 23 dias em animais de controle (0,16 ± 0,09 cm

3 vs 0,27 ± 0,09 cm

3,

p

0,05, Figura 5). Não houve diferença significativa no volume do tumor dos grupos de LMWH e DDP foi encontrado a partir de 8-30 dias (Figura 5).

células A549 /DDP SP foram inoculados em ratinhos nus Balb /C e os volumes dos tumores foram registados dias começando 1 de tratamento com controlo de solução salina normal, HBPM, DDP e DPP mais LWMH. As diferenças de tamanhos de tumor em LMWH combinado com cisplatina e tratados com cisplatina tumores foi significativa após 25 dias (0,17 ± 0,03 cm

3 vs 0,24 ± 0,08 cm

3,

p Art 0,05) e dentro de 23 dias em animais de controle (0,16 ± 0,09 cm

3 vs 0,27 ± 0,09 cm

3,

p Art 0,05). Não houve diferença significativa no volume do tumor dos grupos HBPM e DDP foi encontrado a partir do dia 30/08.

Discussão

O isolamento de células do pulmão SP com propriedades CSC-like e identificação de existir drogas que modificam as células do pulmão SP e superar a chemoresistance pode fornecer estratégias inovadoras para melhorar o resultado clínico em câncer de pulmão. Nós demonstramos que as células SP a partir de células A549 /DDP resistentes à cisplatina pulmão humano adenocarcinoma são enriquecidas em propriedades CSC-como como eles têm aumentado significativamente a formação de colónias

in vitro Comprar e tumorigenicidade

in vivo

, indicando que as células A549 /DPP SP proporcionar um bom modelo para estudar células SP pulmonares e um novo sistema para estudar chemoresistance.

Nosso estudo indica que LMWH não mata diretamente as células SP pulmonares ou induzir a apoptose das células SP

em vitro

. No entanto, LMWH sensibiliza células SP resistentes à cisplatina à cisplatina apoptose induzida

in vitro

.

In vivo

experiências demonstram que LMWH combinado com cisplatina inibe significativamente o crescimento de xenotransplante tumoral cisplatina-resistente. Estudos adicionais demonstram que a HBPM reduz significativamente a expressão da proteína ABCG2, por FACS e análises Western blot. Yoh descobriram que a expressão do ABCG2, mas não da Pgp, MRP1, MRP2, e MRP3, foi um fator preditivo de mau resultado clínico em pacientes com NSCLC avançado, embora o papel de ABCG2 como transportador de conjugados de platina ainda é controverso [12]. Os nossos resultados são consistentes com as suas conclusões e todos estes sugerem claramente ABCG2 é um transportador de droga que desempenha um papel importante na resistência à cisplatina em células SP. Imunohistoquímica análises consistentemente mostrou que LMWH reduz significativamente a expressão da proteína ABCG2 em tecidos tumorais tratadas com HBPM em comparação com os controles. Tudo isto sugere que a HBPM pode impedir quimiorresistência de células de SP por redução da expressão da proteína ABCG2 sem afectar os seus níveis de ARNm.

Novos estudos revelam que a redução da proteína ABCG2 em células SP era devido à degradação induzida por LMWH através da ubiquitina proteassoma porque proteossómica inibidor-MG132, mas não lisossômico leupeptina inhibitors- e pepstatina a, restaura a expressão da proteína em células ABCG2 SP tratados com HBPM. Especulamos que pode ligar-se a HBPM ABCG2 nas membranas celulares e induzir SP ubiquitinization e degradação, o que reduz quimiorresistência de células de pulmão sp.

HBPM é um agente anticoagulante seguro usado em condições coagulantes e não-coagulantes, que tem sido usado no tratamento do cancro por mais de uma década [18]. retrospectiva de dados sugere que ele pode melhorar a sobrevivência em alguns pacientes com câncer, mas o mecanismo exato ainda não está claro [26]. Modelos experimentais sugerem HBPM é capaz de inibir o crescimento tumoral, invasão, metástase, a angiogénese, a formação da matriz e a resistência a múltiplas drogas [27] reverso – [31]. Este estudo mostra que LMWH sozinho poderia reduzir moderadamente o crescimento do tumor

in vivo

mesmo que ele não poderia induzir células tumorais apoptose diretamente

in vitro

. A razão pode ser que LMWH exerce o seu efeito inibidor do tumor através da interferência com a adesão de células tumorais, invasão, angiogênese, ou microenvironement [32], [33].

Para nosso conhecimento, este estudo é o primeiro relatório que LMWH pode impedir chemoresistance de células de pulmão SP, reduzindo expressões de proteínas ABCG2 através de degradação dependente de proteassoma. A capacidade de HBPM para sensibilizar células SP à quimioterapia induzindo a degradação ABCG2 através da via do proteassoma pode fornecer uma explicação para o mecanismo desconhecido pelo qual LMWH melhora a resposta à quimioterapia e sobrevivência em pacientes com câncer [28], [34].

Em conclusão, nossos estudos sugerem que a LMWH reduz chemoresistance câncer de pulmão através de indução de degradação de proteínas ABCG2 através da via do proteassoma. A combinação de LMWH com cisplatina poderiam ter como alvo tanto as células do pulmão SP quimiorresistentes e células cancerosas não-SP quimiossensíveis, proporcionando uma nova estratégia eficaz para o tratamento do cancro do pulmão. Como HBPM pode ser usado de forma independente das condições hypercoagulant e os efeitos secundários são bem tolerados, a aplicação clínica de HBPM no cancro do pulmão tem um grande potencial. Claramente, são necessários mais estudos clínicos de LMWH combinado com quimioterapia e radioterapia no cancro do pulmão, e vai valer a pena explorar se LMWH pode modificar células SP a partir de outros tipos de câncer.

Materiais e Métodos

Cultura de células e Reagentes cancro

o pulmão humano linha celular de adenocarcinoma A549 resistente a cisplatina /DDP foi obtida a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA) e rotineiramente cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% humanos soro AB e 2 cisplatina mol (Qilu Pharmaceutical Co, Ltd, Shandong, China). As células A549 /DDP foram cultivadas em meio RPMI completo, sem cisplatina durante 3 dias antes de serem utilizados nas experiências. Leupeptina, pepstatina A, e MG132 foram comprados de Sigma (St Louis, MO, EUA).

Side População Seleção e Análise

A549 /células DDP foram suspensas a 1 × 10

6 células /ml em PBS contendo 4% de FBS, incubou-se a 37 ° C durante 60 min com 5 ug /ml de Hoechst 33342 (Sigma, St Louis, MO, EUA), quer isoladamente ou na presença de 500 umol verapamil (Sigma, St Louis, MO, EUA). Após a incubação, foi adicionado 1 ug /ml de iodeto de propídio e, em seguida, a suspensão foi filtrada através de um filtro de células de 40 mícrons (BD Bioscience, San Diego, CA, EUA) para se obter uma suspensão de célula única. Fluxo cytometery análise e classificação foram realizadas utilizando um FACS Vantage SE (BD Bioscience). Hoechst 33342 estava animado com o laser UV em 350 nm e emissão de fluorescência foi medida com 405 /BP30 (Hoechst azul) e 570 /BP20 (Hoechst vermelho) filtros ópticos. A pureza das células de SP, e células SP não foi testado novamente utilizando FACS. Após separação por FACS, as células SP e não-SP A549 /DDP foram mantidas em meio RPMI completo, e foram usados ​​para outras experiências dentro de 2 horas.

Formação de Colónias Ensaio

ensaio de formação de colónias foi realizada para avaliar a capacidade de células clonogénicas, SP e não-SP. Após a triagem, 100 ou SP 100 células não-SP A549 /DDP foram plaqueadas em RPMI 1640/10% em placas de 6 poços em triplicado. O meio foi mudado duas vezes por semana e depois de 10 dias, o número de colónias em cada poço foi determinado sob um microscópio e campos representativos foram fotografados. Percentagem de formação de colónias de eficiência (% CFE) foi calculado como = (Número de colónias obtidas /Número de células cultivadas) × 100 e os valores transformados de log foram calculados [35], [36].

In vivo

tumorigenicidade Experiment

Todos os experimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal do PLA Instituto 304 Hospital de Ciências Biológicas. Vinte e quatro de cinco semanas de idade não-obesos diabéticos /imunodeficiência combinada grave (NOD SCID /) camundongos machos foram adquiridos da Associação Chinesa para Ciência Animal Laboratory (CALAS; Beijing, China) e alojados em condições específicas isentos de agentes patogénicos, de forma controlada temperatura e umidade ambiente com 12 h ciclo claro /escuro. Os ratos foram injectados por via subcutânea de um lado com 5 × 10

5, 1 × 10

5, 5 × 10

4 ou 5 × 10

3 SP células ou 1 × 10

7, 5 × 10

6, 5 × 10

5 ou 5 × 10

4 células não-SP em 100 suspensões ul e crescimento do tumor foi monitorado. 0,3 mg /0,20 ml de LMWH foi injectada subcutaneamente no grupo de tratamento HBPM no dia -1. Os ratinhos foram sacrificados no dia 60 ou quando os tumores atingiram um volume máximo de 1000 mm

3. O volume do tumor foi calculado utilizando (largura

2 × comprimento) /2. Fold diferença de tumorigenicidade foi calculado como o número mínimo de células não-SP necessários para gerar um tumor /número mínimo de células SP necessários para gerar um tumor.

Ensaio MTT

A549 /DDP SP classificados As células foram semeadas em placas de 96 poços a 7,5 x 10

3 por poço e tratadas com ou sem 5 UI /HBPM ml (de baixo peso molecular a heparina de cálcio; Bopuqin, Tianjing perseguição Sun Pharmaceutical Co, Ltd., Tianjing, China) em triplicado. Três poços contendo células tumorais suspensas em meio completo foram utilizados como controlos para a viabilidade das células e três cavidades contendo apenas meio completo foram utilizados como controlos para a redução do corante não específico. Após 48 horas, a solução de corante MTT foi adicionado a cada poço e as amostras foram incubadas a 37 ° C durante 4 h, o produto de formazano foi dissolvido pela adição de 100 ul de DMSO a cada poço e a absorvância (A) foram lidas a 570 nm utilizando um ELISA reader (Anthos 2020 Salzbrug, Austrália) A taxa de inibição (%) foi calculada como 100% (valores um grupo de controle valores -Experimental grupo A) × /valores um grupo de controle.

Apoptosis Assay e SP celular marcador Análise da expressão

A549 /DDP células SP (1 × 10

6/96 placa poço) foram tratados (controlo), ou tratados com 5 UI /mL de HBPM, HBPM mais 2,2 ug /mL de cisplatina (DDP ) ou DDP sozinho por 36 h e coradas utilizando o V-FITC kit de detecção de apoptose Anexina (BioVision, mountain View, CA, EUA) e analisadas em um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Bioscience). Para a análise de marcador de células SP, células A549 /DDP SP foram incubadas com HBPM durante 36 h, em seguida, incubadas durante 30 min a 4 ° C com os anticorpos monoclonais contra o gp-P (Abcam, Hong Kong Science Park, New territórios, Hong Kong), ABCG2 (Abcam, Hong Kong Science Park, New Territories, Hong Kong), CD24 (BioLegend, Roselle Street, San Diego, CA, EUA), e Oct-4 (BioLegend, Roselle Street, San Diego, CA, EUA) acoplado a com FITC ou PE (BioLegend, San Diego, CA, EUA) a uma concentração recomendada pelo fabricante e analisadas por citometria de fluxo. Ensaio de apoptose e análise de expressão do marcador de células SP foram repetidas 3 vezes.

quantitativo em tempo real de RT-PCR

A549 /DDP células de SP de HBPM tratadas ou não tratadas e células tumorais recolhidas de LMWH ou tratada ratos não tratados foram suspensas a 1 x 10

6 células /ml em 5 ml de PBS, como amostra, respectivamente. Em seguida, o isolamento de RNA total foi realizada utilizando o reagente TriPure Isolamento (Roche Diagnostics GmbH. Alemanha) ou RNeasy Mini Kit (Qiagen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

Os níveis de ARNm foram analisadas por RT-quantitativo em tempo real PCR usando um sistema Bio-Rad iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA). Os ARNm foram transcritos de modo inverso em ADNc utilizando um kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA). As sequências dos iniciadores utilizados em tempo real de RT-PCR são: 5′-GGGTAATCCCCAGGCCTCTA-3 ‘(iniciador de sentido do gene humano ABCG2), 5′-CCAGCTCTGTTCTGGATTCCA-3′ (iniciador anti-sentido do gene humano ABCG2), 5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT- 3 ‘(iniciador de sentido do gene β-actina humana), e 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’ (iniciador anti-sentido do gene β-actina humana). A reacção foi realizada sob as seguintes condições: um ciclo a 48 ° C durante 45 min; 95 ° C durante 2 min; 40 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 1 min, e 68 ° C durante 2 min. Cada amplificação RT-PCR foi repetida em triplicado. A eficiência da PCR foi examinada diluindo serialmente o ADNc molde e os dados da curva de fusão foram recolhidos para verificar a especificidade da PCR. Cada uma das amostras de cDNA foi triplicado e a amostra não RT-mRNA correspondente foi incluído como um controlo negativo. O iniciador β-actina foi incluído em cada placa para evitar variações da amostra. O nível de ARNm de cada amostra foi normalizada para a do ARNm β-actina. nível de mRNA Relativa foi apresentado como 2

– [(Ct /ABCG2- Ct /β-actina) LMWH – (Ct /ABCG2- Ct /β-actina) controle]. Todos os dados apresentados foram a média ± DP de três experiências separadas.

Tumor Study Xenoenxerto Crescimento

masculina inata de seis semanas de idade Balb /C ratos nus foram obtidos do Instituto de Associação Chinesa para Ciência animal Laboratory (CALAS). Células de adenocarcinoma do pulmão A549 /DDP (5 × 10

6) foram inoculados subcutaneamente no flanco esquerdo superior no dia 1. Quando os diâmetros dos tumores eram 5 mm, os ratinhos foram divididos em controlo, DDP, e HBPM com DDP grupos (n = 10 cada um) e tratou-se com IP injecção de 8 mg /kg DDP ou um volume igual de solução salina uma vez por semana durante 3 semanas. HBPM (0,3 mg /0,20 ml) ou solução salina s.c. foi dada todos os dias a partir do dia 8 ao dia 30. O volume do tumor foi determinada três vezes por semana, como descrito anteriormente e os ratos foram sacrificados no dia 30.

Expression SP celular marcador em explantes de tumores

amostras tumorais foram excisados ​​a partir de ratos, enxaguado, mecanicamente picada, e digeriu-se durante 4 h a 37 ° C numa incubadora com agitação com 0,1 unidades Wünsch /ml de colagenase I (Roche Diagnostics) em DMEM. A digestão foi desagregadas utilizando uma agulha de calibre 18,5, peneirados através de uma peneira de 100 um e de células preparadas para análise de citometria de fluxo da expressão do marcador de célula de SP, como descrito anteriormente.

Western Blot

células foram SP tratados inicialmente com HBPM ou controlo durante 10 horas, e, em seguida, MG132 (10 uM), Pepstain a + leupeptina (cada 100 ug /ml), ou controlo foram adicionados de modo correspondente e incubou-se durante 6 horas. Em seguida, as células foram colhidas para análise de Western blot. a incubação do anticorpo primário foi realizada a 4 ° C durante 16 horas com um anticorpo anti-rato (ABCG2 BioLegend, San Diego, CA, EUA) diluídos em 1:300 em 3% de albumina de soro bovino, seguida de incubação com conjugado cavalo horseradishperoxidase anti-ratinho de anticorpo secundário, e desenvolvido usando um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA). O anticorpo anti-β-actina foi utilizado como controlo de carga (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA).

A imuno-histoquímica Coloração de ABCG2 em tecido tumoral

Os tecidos foram embebidos em parafina cortado em lâminas 4 uM e cozidos a 60 ° C durante 60 min. As secções foram de-parafinado com xilenos e reidratadas. Em seguida, as secções foram submersos em EDTA tampão de recuperação antigénico numa panela de pressão durante 10 minutos e depois arrefeceu-se à temperatura ambiente durante 20 minutos. As secções foram tratadas com peróxido de hidrogénio a 3% em metanol para extinguir a actividade da peroxidase endógena, seguido de incubação com soro normal para bloquear a ligação não específica. Em seguida, as lâminas foram incubadas com anticorpo anti-ABCG2 humana purificada (Abcam, Hong Kong Science Park, territórios novos, Hong Kong, China) com uma diluição de 1:20 a 4 ° C durante a noite. O segundo anticorpo foi a partir de um kit de reagentes SP (Zhongshan Biotecnologia Company, Beijing, China). Após a lavagem, as secções de tecido foram tratadas com o anticorpo secundário anti-ratinho biotinilado, seguido de nova incubação com complexo estreptavidina-peroxidase de rábano silvestre durante 20 minutos. Coradas com diaminobenzidina (DAB), as secções foram contrastadas com hematoxilina. O tecido positivo conhecido, foi utilizada para controlos positivos. O anticorpo primário foi omitido para os controlos negativos. Um Olympus (Olympus, Tóquio, Japão) microscópio foi utilizado para visualizar a coloração das proteínas-alvo.

As lâminas coradas foram examinadas e avaliadas de forma independente por dois observadores e as pontuações foram determinados pela combinação de a proporção de tumor coradas positivamente células e a intensidade da coloração. proporção de células de tumor foi pontuado como se segue: 0 (sem células tumorais positivas); 1 (≤30% de células tumorais positivas); 2 (31-50% de células tumorais positivas); 3 (as células de tumor positivas 51-80%) e 4 ( 80% células tumorais positivas). intensidade da coloração foi classificada de acordo com os seguintes critérios: 0 (-, nenhuma coloração); 1 (+, coloração fraca = amarelo claro); 2 (++, coloração moderada = amarelo marrom) e 3 (+++, coloração forte = marrom). índice de coloração (SI) foi calculado como o produto da pontuação intensidade de coloração e a percentagem de células tumorais positivas. Usando este método de avaliação, avaliamos a expressão ABCG2 em tecidos tumorais através da determinação do SI, com escore de 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9 ou 12.

Análise Estatística

Os dados são apresentados como média ± SD