Abstract

ARF supressores de tumor age como um sensor de sinais oncogênicos, contrariando proliferação aberrante em grande parte, através da activação do programa transcricional de p53, apesar de um número de funções independentes da p53 foram descritos. Evidências crescentes sugerem que, para além de promover a tumorigénese através de perturbações no equilíbrio homeostático entre a proliferação celular e a apoptose de células cancerosas evidentes, alterações genéticas levando a tumor perda supressor de função ou ganho oncogene de função também pode incitar o desenvolvimento do tumor através de efeitos sobre o tumor microambiente. Em um modelo de ratinho transgénico de multi-fase neuroendócrino pancreático carcinogénese (PNET) accionada por inibição da p53 canónica e supressores tumorais Rb com T grande de SV40-antigénio (TAG), a progressão estocástica de tumores é limitada, em parte, por um requisito para a iniciação de um interruptor angiogênico. Apesar de inibição de p53 por Tag neste modelo PNET rato, perturbação concomitante de Arf por nocaute genético resultou numa via acelerou significativamente a formação de tumores que, surpreendentemente, não foi conduzido por alterações na proliferação de células tumorais ou apoptose, mas sim através de activação precoce do angiogénico interruptor. Na configuração de um knockout gene p53 constitucional, perda de Arf também acelerou o desenvolvimento do tumor, embora em menor grau. Estes resultados demonstram que a perda da função Arf pode promover tumorigênese via facilitando a angiogênese, pelo menos em parte, através de mecanismos independentes de p53

Citation:. Ulanet DB, perda de p19

Arf Facilita Hanahan D (2010) o interruptor Angiogênica e iniciação do tumor em um modelo de cancro da multi-Stage via p53-dependente e independente mecanismos. PLoS ONE 5 (8): e12454. doi: 10.1371 /journal.pone.0012454

editor: Nils Cordes, da Universidade de Tecnologia de Dresden, Alemanha |

Recebido: 02 de junho de 2010; Aceito: 03 de agosto de 2010; Publicação: 27 de agosto de 2010

Direitos de autor: © 2010 Ulanet, Hanahan. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por um subsídio do Instituto Nacional do Câncer (DH; R01CA45234) ea Fundação AP Giannini para a Investigação médica (DBU; https://www.apgianninifoundation.org/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O ARF (quadro de leitura alternativo; p14

ARF no ser humano, p19

Arf no mouse) supressor tumoral atua como um sensor de sinais hiper-proliferativa, resultando em parada de crescimento dependente de p53 e apoptose [1], [2], [3]. Enquanto IRA não é expresso em níveis apreciáveis ​​na maioria dos tecidos normais, a activação do oncogene desencadeia a sua expressão [4], resultando na inibição da ubiquitina ligase de MDM2 e estabilização de p53 [5]. A inibição da via p53, mais comumente através de mutações no

p53

si, inativação de

ARF

, ou amplificação do

MDM2

é pensado para ser um passo crítico na patogênese da maioria dos cancros humanos [6]. Embora mutação do

p53

e

ARF

em tumores são, na maior parte eventos mutuamente exclusivos [7], as evidências sugerem que a relação entre p53 e ARF não é estritamente linear e aponta para p53 funções supressoras de tumor independentes de de ARF [8], [9]. evidência inicial in vivo para uma desconexão de potencial entre IRA e p53 veio da constatação de que combinada

p19

Arf

e

p53

deficiência em ratos resulta na emergência de um espectro de tumor que consiste em uma gama mais ampla de tipos de tumor do que em ratinhos que carecem do gene, quer por si só [9]. Posteriormente, um estudo realizado em duas etapas modelo de carcinogênese pele do rato DMBA /TPA revelou uma taxa de crescimento acelerado de papilomas em um

p19

Arf

-deficient comparado a um

p53

-deficient fundo genético [10]. Da mesma forma,

p19

Arf

mas não

p53

deficiência facilitou o desenvolvimento de melanoma em um modelo de rato transgénico através de ajuda de uma via de senescência independente de p53 [11]. Um estudo mais recente sugere um contexto de dependência para o resultado da

p19

Arf

perda durante oncogênese no cenário da

Pten

-deficiência, em que

p19

Arf

perda transmitida uma função inibidora parcial durante a carcinogênese de próstata, mas abolida senescência e promovido hiperproliferação e transformação de fibroblastos de embrião de ratinho. Em ambas as configurações do resultado diferencial da

p19

Arf

perdas ocorreu sem efeitos sobre a atividade p53 [12].

Em um modelo de rato transgénico de multi-estágio neuroendócrino do pâncreas carcinogênese (PNET) , PIR-Tag2, a expressão do SV-40 T-antigénio (TAG) em células p pancreáticas conduz à inibição de p53 e Rb supressores tumorais, promovendo uma via multi-estágio ainda temporalmente estocástico definido para a tumorigénese. Apesar expressão oncogénica em todos os ilhéus pancreáticos do rato -400, eventos secundárias são necessárias para a progressão de cada passo da via para tumores [13], [14]. A maioria, mas não todos os ilhéus normais evoluir para lesões hiperplásicas /displásicas em todo o aproximada 14 semanas tempo de vida de ratos RIP-Tag2. Do mesmo modo, apenas um subconjunto (~15-20%) das lesões dos ilhéus hiperplásicos submetido a um interruptor angiogénico, e apenas uma fracção (~ 25%) destas ilhotas angiogénicos subsequentemente progredir para tumores sólidos. Promoção do interruptor hiperplásica é pensado para ser, em parte, mediada pelo factor de crescimento /sobrevivência, IGF-II, tal como a sua expressão é induzida concomitante com o aparecimento da célula-β hiper-proliferação [15]. Um estudo mais recente identificou uma associação entre assinaturas de expressão microRNA e as diferentes fases Tumorigênese RIP-Tag2, com a implicação de que as alterações na expressão destes miRNAs poderia estar jogando um papel na condução desses “interruptores” [16].

Nós procuramos nesta investigação para determinar se Arf tinham funções independente de p53 em suprimir a progressão do tumor no modelo de RIP-Tag2 PNET, através de cruzamentos de camundongos portadores de uma genética knock-out de

Arf.

a previous estudo mostrou que nocaute genética de

p53

neste modelo não resultou numa via acelerado para a formação de tumores, e, de facto, a proliferação de células tumorais beta foi reduzida, provavelmente uma consequência da desestabilização do SV-40 T grande antigénio oncogene, ao qual se liga [17]. Em contraste, demonstramos aqui que a perda de

Arf

acelera significativamente a formação do tumor, via facilitando o interruptor angiogênico. Estes estudos fornecem

in vivo

evidência para funções independentes de p53 de Arf e sugerir um novo papel para Arf como um supressor de tumor angiogênese.

Resultados

Knockout de

Arf

acelera a progressão do tumor RIP-Tag2 sem efeitos significativos sobre a apoptose de células tumorais /proliferação

de acordo com a indução conhecida de p19

Arf em resposta a sinais oncogênicos [4],

Arf

expressão de mRNA foi encontrado para ser induzida em SV-40 Tag expressando ilhotas hiperproliferativas em comparação com ilhéus normais, com um aumento adicional com a progressão de lesões angiogénicos e tumores sólidos em ratinhos PIR-Tag2 (Figura 1). Para determinar se Arf pode estar suprimindo tumorigênese no cenário de inibição de p53, foram avaliados os efeitos de nocaute genético de

Arf neste caminho. Notavelmente, a perda de Arf resultou num aumento muito significativo, cerca de 5 vezes na carga de tumor (Figura 2A, p 0,0001); houve, para além disso, um aumento de 1,8 vezes no número de tumores (Figura 2B, p = 0,002). perda de heterozigotos Arf também resultou num aumento significativo da carga do tumor (p 0,001) e número do tumor (p = 0,02) em comparação com in

Arf

ratinhos de tipo selvagem PIR-Tag2. Perda do tipo selvagem

Arf

alelo não ocorreu em nenhum dos

Arf

+/-

tumores

Os níveis de mRNA examinadas (Figura S1). de

Arf foram avaliadas utilizando RT-PCR quantitativo em ADNc gerado a partir de misturas de ARN de ilhéus não transgénicos normais, e ilhéus hiperplásicos, ilhotas angiogénicos (ilhotas isoladas 5-10 ratinhos foram agrupados), e tumores (igual quantidades de ARN isolado a partir de 10 tumores de pelo menos 5 ratos em conjuntos) a partir de ratinhos PIR-Tag2. a expressão do gene normalizada e plotados em relação à expressão GMSI

(A, B) Efeitos de heterozigotos e homozigotos knockout de

Arf

na carga tumoral (A;. * p 0,001, * * p 0,0001 em relação ao

Arf + /+

; a diferença entre o

Arf +/-

e

Arf – /-

ratos não foi estatisticamente significativa) e número de tumores (B ; * p = 0,02, ** p = 0,002), em 12 ratinhos PIR-Tag2 semanas de idade. Os valores médios +/- SEM de 15 (

Arf + /+

), 17 (

Arf +/-

), ou 20 (

Arf – /-

) ratos /grupo são indicados. Teste de Mann-Whitney para significância estatística. (C) A apoptose, conforme determinado por marcação TUNEL em ilhotas hiperplásicas (Hip), ilhotas angiogénicos (ANG) e tumores (Tum) a partir de

Arf

+ /+

ou

Arf

– /- ratos

RIP-Tag2. Os valores médios +/- SEM de lesões graduais de 6-7 ratos individuais de cada genótipo são indicados. O número de lesões totais analisadas para cada fase genótipo /lesão são como se segue:

Arf + /+

(Hyp: n = 27; Ang: n = 33; Tum: n = 14);

Arf – /-

(Hyp: n = 18; Ang: n = 25: Tum: n = 22). (D) A proliferação, tal como medida pela% de células com incorporação de BrdU nas diferentes fases de lesões dos ilhéus a partir de 4 indivíduo

Arf + /+

(Hyp: n = 21; Ang: n = 24; Tum: N = 12) e

Arf – /-

(Hyp: n = 18; Ang:. n = 22; Tum: n = 24) ratos RIP-Tag2

Dado o anteriormente capacidade demonstrada de IRA para induzir a paragem do ciclo celular e a apoptose independentemente de p53 [9], [18], [19], [20], [21], foram examinados para alterações na apoptose e a proliferação tal como avaliado pela marcação TUNEL e a incorporação de BrdU , respectivamente, em lesões pré-neoplásicas e tumores de

RIP-Tag2; Arf

+ /+ Comprar e

Arf

– /-

ratos. Surpreendentemente, fomos incapazes de detectar qualquer efeito significativo da perda de Arf em qualquer um destes parâmetros em qualquer um dos estágios RIP-Tag2 (Figura 2C, D). Para garantir que não ignoram os efeitos subtis no ciclo celular regulação /proliferação, em adição ao ensaio de incorporação de BrdU, que mede a percentagem de células na fase S, que avaliou também o índice proliferativo por imunocoloração para fosfo-histona H3, um marcador para as células em fase M. De acordo com o ensaio de incorporação de BrdU-, não se observou qualquer diferença significativa na percentagem de células na fase M após a perda de Arf (Figura S2). Além disso, knockdown estável de

Arf

utilizando um

Arf

segmentação shRNA numa linha celular derivada de um tumor de tipo selvagem PIR-Tag2 não teve nenhum efeito sobre o crescimento das células cancerosas in vitro (Figura 3).

As células tumorais foram transduzidas estavelmente com um não-silenciamento (NS) ou

Arf

silenciar shRNA. (A) Knockdown de expressão da proteína Arf pela shRNA

Arf

alvo. Os níveis de proteína β-actina indicado como um controlo para a carga de proteína. (B) Efeito do

Arf

knockdown sobre o crescimento de células tumorais

in vitro

. Os valores médios +/- SEM de três experiências independentes realizadas em triplicado são indicados.

Perda de Arf facilita o interruptor angiogênico

Para investigar como knockout de

Arf

pode estar acelerando o crescimento do tumor, sem alterações na proliferação de células-β ou apoptose, avaliou-se a perda de Arf poderia estar afetando qualquer um dos obstáculos inerentes que limitam a transição de oncogene expressando células beta em ilhotas pancreáticas através dos diferentes passos para a formação de tumores. Apesar de a expressão do oncogene tag no pâncreas desenvolvimento embrionário começando no dia 9, há um atraso na iniciação da hiperproliferação esporádica ilhéu por várias semanas. Para determinar se a perda de IRA poderia facilitar um início precoce do interruptor hiperplásico, examinámos a percentagem de lesões hiperproliferativas da ilhota (conforme determinado por coloração com o marcador de proliferação de Ki67) em ambas as 3- e 5-semanas de idade em

PIR -Tag2; Arf

+ /+ Comprar e

Arf

– /-

ratos. Não foi observada diferença significativa no percentual de ilhotas hiperproliferativas em cada uma destas fases (Figura 4A), embora em 5 semanas de idade, ilhotas de

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

ratos foram em média maiores em tamanho (Figura S3A; aumento de 1,5 vezes; p = 0,007). O aumento do tamanho da lesão não foi um resultado do aumento de tamanho da célula, como o número de células /área era quase idêntica entre os dois grupos (Figura S3B).

(A) Efeitos sobre o interruptor hiperplásicas. Ilhotas de Ki67 secções coradas a partir de ratos velhos 3- ou 5-semana foram pontuadas como “normais” (sem hiperproliferação) ou hiperplásicas. Os valores representam a distribuição das subclasses diferentes das ilhotas dentro dos genótipos indicados. Para ratinhos de 3 semanas, 60 (

Arf + /+

) e 58 (

Arf – /-

) lesões ilhotas foram marcados em seções a partir de 3 ratos /grupo; para ratos velhos 5-semana, 166 (

Arf + /+

) e 231 (

Arf – /-

) lesões ilhotas foram marcados em seções 3-4 ratinhos /grupo. A distribuição dos tipos de ilhotas não foi significativamente diferente entre os dois genótipos, seja ponto de tempo (teste exato de Fisher; cinco semanas timepoint: p = 0,06). lesões hiperplásicas manchado de Ki67 representativos (de 3 semanas ratos RIP-Tag2 de idade) da indicada

Arf

genótipos são retratados na direita. (B, C) Efeitos sobre o interruptor e tumor angiogênico iniciação. O número de lesões vermelhas, angiogénicos (B) e tumores (C) foi calculado a partir de 11 (

Arf + /+

) ou 15 (

Arf – /-

) 8 semanas de idade RIP- camundongos Tag2 dos genótipos indicados. Valores médios ± SEM são indicados. Mann-Whitney para a significância estatística; * P = 0,01, ** p . 0,0001

A seguir, avaliou os efeitos de

Arf

nocaute sobre a freqüência de comutação angiogênico. Em contraste com o impacto insignificante sobre a incidência de hiperplasias dos ilhéus, o número de glóbulos vermelhos, hemorrágicas ilhotas angiogénicos foi significativamente aumentada (aproximadamente 30%) em 8 semanas de idade

PIR-Tag2

;

Arf

– /-

ratinhos comparada com

RIP-Tag2

;

Arf

+ /+

ninhada (Figura 4B; p = 0,01). Além disso, enquanto o aparecimento de tumores sólidos era muito raro em 8 semanas em

PIR-Tag2

;

Arf

+ /+

ratos (tumores presentes em 4/11 ratos; média de 1 tumor /mouse), pequenos tumores foram encontrados em quase todos os

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

camundongos analisados ​​nesta idade (média de -2,5 tumores /mouse; Figura 4C, p 0,0001). É de notar, na pontuação de lesões hiperplásicas no ponto de tempo cinco semanas, ilhotas ocasionais que apresentem as características hemorrágicas típicos /ilhas de sangue de ilhotas angiogênicos [22], [23] foram observadas, com uma tendência para uma maior incidência na

Arf

– /-

comparação com

Arf

+ /+

ratos; no entanto, essa diferença não foi estatisticamente significativa, neste ponto do tempo (Figura S3C). Assim, neste modelo de multi-estágio, perda de Arf acelera a formação do tumor, pelo menos em parte, através de facilitar o interruptor angiogênico.

knockout Arf não resultar em alterações significativas para o fenótipo vascular

Para explorar ainda mais a natureza do aumento do fenótipo angiogénico no

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

ratos, nós próxima avaliou o fenótipo da vasculatura angiogênico. Apesar do aumento do número de lesões angiogénicos em

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

ratinhos, as lesões resultantes não diferiram de forma significativa na densidade vascular ou morfologia (espessura navio, grau de ramificação) (Figura 5A e dados não mostrados), ou no grau de pericitos cobertura (Figura 5B). Dadas as descobertas anteriores que demonstram um papel para a MMP-9 expressando neutrófilos na promoção do interruptor angiogénica [24], também examinámos se a perda de expressão Arf resultou em alterações na incidência de recrutamento de neutrófilos a “pré-angiogénicas” lesões hiperplásicas. Em ambos

RIP-Tag2

;

Arf

+ /+ Comprar e

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

ratinhos, duas vezes imunocoloração para o marcador de proliferação Ki67 e o marcador 7/4 neutrófilo demonstrou que aproximadamente 25% das lesões hiperplásicas examinados (com 5 semanas de idade) continha neutrófilos infiltrantes ( na maioria dos casos não mais de uma 7/4 + células /islet; dados não mostrados). Além disso, não há mudanças significativas no número de células que se infiltram duplamente positivas MMP-9 e 7/4 foi observada em lesões angiogénicos a partir de 8-semanas de idade

PIR-Tag2

;

Arf

+ /+ Comprar e

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

ratinhos (dados não mostrados)

(a) Visualização da vasculatura em lesões angiogénicos a partir de 8-semanas de idade murganhos PIR-Tag2 dos genótipos indicados por. imunocoloração para Meca32 (vermelho). Representante Meca32 /DAPI (azul) fundiram imagens são mostradas. densidade de vasos foi calculada por medição da área ocupada pelos navios Meca32 +; Os valores representam a média ± SEM calculado a partir de análise de 16-20 lesões angiogénicos a partir de 4 ratos individuais de cada genótipo. (B) imunocoloração Duplo para Meca32 (células endoteliais, vermelho) e NG2 (pericitos, verde) foi realizada para analisar o grau de cobertura pericyte dentro da vasculatura angiogênico de 8 semanas ratos RIP-Tag2 dos genótipos indicados. Bares, 20 um.

Selective

Arf

nocaute no estroma compartimento não melhorar significativamente tumor desenvolvimento

Estudos anteriores demonstraram que o

Arf

– /-

ratos são cegos devido a um defeito na involução da vasculatura hialóide no olho durante o desenvolvimento, resultante de um acúmulo de células perivasculares Pdgrfrβ + [25], [26]. Dados implicado tanto os efeitos celulares autónomos e não autónomos da perda de Arf sobre este fenótipo [27]. Desde

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

ratos não têm expressão Arf em todo o corpo e não apenas nas células tumorais, que questionou se a perda de Arf em um tipo de células não β poderia ser em parte facilitando o interruptor angiogênico e a formação de tumores. Para começar a explorar esta possibilidade, primeiro analisou se pudéssemos detectar

expressão Arf

no compartimento estromal do tipo selvagem

RIP-Tag2

tumores. Análise quantitativa por RT-PCR em tempo real em compartimentos celulares ordenados do

PIR-Tag2

tumores demonstraram

Arf

expressão, como esperado, no compartimento da célula do tumor, mas não em células endoteliais (CD31 +) , células do sistema imunológico (CD45 +) ou (pericitos Pdgfrβ +) (Figura 6A) e S4. Estes resultados são consistentes com a noção de que a indução da expressão Arf é, na sua maior parte, limitada a resposta a sinais oncogénicos [4]; no entanto, esta análise não descartou a possibilidade de indução transitória de expressão Arf nos tipos de células do estroma analisados, nem expressão em outras classes de células infiltrantes tumorais [por exemplo, pericitos Pdgfrβ-negativos [28]].

(A) A expressão de

Arf nos diferentes tipos de células tumorais RIP-Tag2 Constituinte. Em tempo real quantitativa de RT-PCR foi realizada em ARNm isolado de células de tumores de FACS PIR-Tag2 [ECS (células endoteliais), CIs (células imunes), T /COs (tumor /outras células)] classificados. Os níveis de expressão representada graficamente em relação à expressão de L19. (B) Efeito do

Arf nocaute no desenvolvimento do tumor de células tumorais ortotopicamente transplantados. 1 × 10

5 células tumorais derivadas de um

RIP-Tag2

;

Arf

+ /+

tumor foram injetados no pâncreas de

Arf

+ /+

ou

Arf

– /-

ratos e permitiu a crescer durante 4 semanas. Os valores representam o volume de tumor médio (± SEM) calculado a partir de tumores isolados a partir de 12 ratos individuais de cada um dos genótipos indicados. A diferença entre os valores não alcançou significância estatística (teste de Mann-Whitney, p = 0,1).

Para avaliar diretamente o papel potencial dos

Arf

nocaute no não-tumoral compartimento da célula em influenciar a progressão do tumor, realizamos experimentos ortotópicos em que as células tumorais derivadas de um

RIP-Tag2

;

Arf

+ /+

tumor foram injetados no pâncreas de imunocompetentes

Arf

+ /+

ou

Arf

– /-

ratos, e o tamanho do tumor foi medido quatro semanas mais tarde. Não houve diferença significativa no tamanho médio do tumor entre os tumores formados no

Arf

+ /+

contra

Arf

– /-

ratos (Figura 6B). Combinado com a nossa incapacidade para detectar

expressão Arf

num tipo de célula do estroma do tumor, estes resultados sugerem que o nocaute

Arf

no compartimento estromal do tumor não é susceptível de ser o condutor predominante do apressou o crescimento tumoral observada após a

Arf

nocaute em camundongos RIP-Tag2. Uma vez que não está claro se o mecanismo de indução de angiogênese em células tumorais injetadas ortotopicamente segue um caminho semelhante como angiogênese induzida em lesões pré-neoplásicas endógenos, permanece a possibilidade de que a falta de efeito observado pode em parte estar a reflectir essas diferenças.

Knockout de

Arf

acelera a formação de tumores através de ambos os mecanismos de p53 dependentes e independentes

Desde p53 tem demonstrado ser quantitativamente sequestrado por SV-40 Tag e sua atividade de transativação é comprovadamente inibidas em beta-células de camundongos RIP-Tag2 [17], que suspeitava que a maioria dos efeitos observados sobre eliminatória da

Arf

para ser independente de p53. No entanto, procedeu-se a verificar o p53-independência do

Arf

fenótipo nocaute, analisando os efeitos do

Arf

nocaute em um fundo genético p53 nulo. Como no fundo-wild-type p53,

Arf

nocaute no

RIP-Tag2; p53

– /-

ratos resultou num aumento significativo do (2,4 vezes) a carga de tumor às 12 semanas de idade, em comparação com

Arf

+ /+

da mesma ninhada (Figura 7A; p 0,001), bem como um aumento significativo de 30% no número de lesões angiogénicas (Figura 7C, p = 0,04) e tumores pequenos (Figura 7D; p = 0,002) com 8 semanas de idade, confirmando que estes efeitos são, pelo menos em parte p53-independente. No entanto, deve notar-se que a magnitude do impacto de

Arf

knockout na carga de tumor (em 12 semanas) e o número do tumor (com 8 semanas) não foi tão dramática como no

PIR-Tag2

;

camundongos p53

do tipo -wild (Figura 2). Além disso, apesar de iniciação do tumor ocorreu mais cedo no

RIP-Tag2; p53

– /-; Arf

– /-

comparação com

RIP-Tag2; p53

– /-; Arf

+ /+

ratos, por 12 semanas de idade, não foi detectada diferença no número de tumor entre ratos destes genótipos (Figura 7B), sugerindo que ambas as funções de p53 dependentes e independentes de Arf cooperar para suprimir o interruptor angiogênico e progressão do tumor neste modelo carcinogênese multi-estágio

(a, B)

Arf

nocaute no

RIP-Tag2.; p53

– /-

ratos resulta em um aumento da carga de tumor (a; p 0,0001) sem afectar o número de tumores (B) com 12 semanas de idade. Os valores médios +/- SEM de 19 (

p53 – /-; Arf + /+

), ou 14 (

p53 – /-; Arf – /-

) ratos /grupo são indicados. Teste de Mann-Whitney para significância estatística. (C, D) aumento do número de ilhotas angiogénicos (C; p = 0,04) e tumores (D; p = 0,002) em

RIP-Tag2; p53

– /-

;

p19

Arf – /-

ratos com 8 semanas de idade. Os valores médios +/- SEM de 15 (

p53 – /-; Arf + /+

), ou 13 (

p53 – /-; Arf – /-

) ratos /grupo são indicados. teste de Mann-Whitney para significância estatística.

Na tentativa de identificar um mecanismo molecular para o aumento da frequência de comutação angiogênico em

Arf-

nulos ratos RIP-Tag2, analisamos a expressão de uma matriz de genes relacionados com a angiogénese por PCR em tempo real. Nós não, no entanto, identificar quaisquer genes reguladores angiogénicos que foram convincentemente alteradas ao nível da transcrição em tumores inteiros ou ilhotas angiogénicos sobre perda de Arf (dados não mostrados e Figura S5A). À luz de estudos recentes que demonstram um papel para Arf na biogênese do ribossomo [29] e no controle pós-transcricional da expressão de VEGF [30], avaliamos possíveis alterações na expressão de VEGF no nível de proteína em cima de perda de Arf. Embora os níveis de proteína VEGF foram modestamente elevados em tumores RIP-Tag2 no

p53 -null

fundo genético (aumento de 35%; p = 0,02), verificou-se que, neste contexto, genética, perda de

Arf

não resultar em alterações nos níveis de proteína total de VEGF (Figura S5B). Além disso, a imunocoloração para VEGF não revelou quaisquer mudanças óbvias na expressão de VEGF /localização nas diferentes lesões ilhotas pré-neoplásicas no

Arf

-null RIP-Tag2 ratinhos (Figura S5c). Assim, não há nenhuma indicação de que a angiogénese acelerada resultantes da perda de Arf envolve alteração na biossíntese de VEGF.

Discussão

A inactivação da via IRA /p53 é um evento crítico na maioria dos humanos cancros, que serve para levantar as restrições sobre a sinalização oncogénica [31]. Para além das actividades canónicos supressores de tumores de p53 na mediação do ciclo celular prisão, apoptose e senescência, p53 também pode funcionar na manutenção da dormência do tumor por meio de supressão da angiogénese [32]. Em um modelo de carcinogénese em várias fases, em que a p53 é funcionalmente inibida por SV-40 da etiqueta, que demonstram que a p19

Arf pode também modular a angiogénese programa, pelo menos em parte através de mecanismos independentes da p53. ablação genética de

Arf em

ratos RIP-Tag2 resultou em uma aceleração significativa da via tumorigênese, que foi associado com um aumento da frequência de ilhotas submetidos a um interruptor angiogênico e formação de tumor mais cedo. Notavelmente, o interruptor hiperproliferativa não foi afectada, nem foram proliferação /apoptose índices em qualquer fase da via para a formação do tumor.

Apesar do aumento da frequência de comutação angiogénico, a vasculatura no interior das lesões resultantes angiogénicos não diferiram significativamente fenotipicamente entre

RIP-Tag2; Arf

+ /+ Comprar e

Arf

– /-

ratos, consistentes com estudos anteriores neste modelo no qual alterados frequências de comutação angiogénicos ocorreu sem alterações concomitantes na morfologia embarcação ou apoptose de células tumorais /proliferação mediante nocaute genética de MMP-9 [33] ou de neutrófilos ablação [24]. A ausência de diferenças globais no grau de recrutamento de neutrófilos para pré-angiogénicos lesões em

RIP-Tag2; Arf

– /-

comparação com

Arf

+ /+

ratos sugere que Arf pode modular a angiogénese através de um mecanismo alternativo. No entanto, devido à multi-focal e natureza estocástica do presente modelo de tumor, em que apenas cerca de 15-20% (com base em um total de 400 ilhotas /ratinho) de lesões hiperplásicas irá tornar-se “angiogénica” (esta frequência é aumentada em apenas alguns% em

Arf

– /-.

ratos) permanece a possibilidade de que alterações transitórias não detectados em neutrófilos em um pequeno subconjunto de lesões poderia ser responsável por aumento da incidência de comutação angiogênico

Enquanto não está claro o que sinal específico (s) impulsiona o recrutamento inicial de células inflamatórias e início do interruptor angiogênico, o paradigma atual sugere que uma ruptura no equilíbrio entre fatores pró e anti-angiogénicos endógenos é fundamental [34] . Notavelmente, das muitas funções independente de p53 da IRA que foram descritos até à data [8], vários pode ser previsto para potencialmente impactar o interruptor angiogênico. Em particular, o NF-kB e de c-Myc, ambos os quais têm sido implicados na regulação da angiogénese através dos seus efeitos sobre a expressão de mediadores pró-inflamatórios [35], [36], [37], foram identificadas como alvos independente de p53 de IRA [38], [39]. Além disso, a fixação do nucleolar do forte indutor da angiogénese, o HIF-1α por IRA tem sido demonstrado para regular a sua actividade de transcrição [40]. Além disso, um estudo recente complementar por Kawagishi et ai. sugerido um papel independente de p53 para IRA na supressão da angiogénese do tumor através do controlo pós-transcricional da expressão de VEGF-A [30]; No entanto, nos tumores PNET PIR-Tag2, os níveis de proteína VEGF foi não significativamente alterada pela perda de IRA. Assim, podemos inferir que o aumento dos níveis de VEGF expressão não subjacente à comutação angiogênico mais cedo, embora não se possa excluir possíveis alterações na biodisponibilidade VEGF, mediadas por exemplo, aumento da matriz degradante actividade proteolítica.

Um papel potencial para IRA em o processo da vasculogénese e /ou angiogénese foi previamente postulada [8], decorrente da demonstração de que Arf pode regular o desenvolvimento vascular no olho do rato [25], uma das funções descritas apenas de ARF lado de supressão do tumor. Um mecanismo pelo qual a perda de Arf aumenta a sinalização de PDGF, resultando em uma proliferação excessiva e acúmulo de células perivasculares Pdgfrβ + foi proposto para explicar o defeito vascular resultando em cegueira em

Arf

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ratos. Enquanto não houve alterações mensuráveis ​​na acumulação pericyte na vasculatura de

RIP-Tag2; Arf

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lesões angiogénicos, permanece a possibilidade de que o recrutamento inicial de + células perivasculares Pdgrβ à neovasculatura pode ser estimulado diretamente ou indiretamente (por exemplo, fator pró-angiogênico através da secreção de um ainda a ser identificado de Arf nulo células /tumorais pré-neoplásicas) pela perda de Arf.

Expansivo tumor desenvolvimento /crescimento exige não só a desregulação do crescimento celular e sinais de sobrevivência, mas também envolve alterações significativas no microambiente do tumor incipiente. Em particular, a formação de um fornecimento de sangue é crítico para o crescimento de tumores e metástases. Emergentes evidência sugere que oncogenes e supressores de tumor podem influenciar o desenvolvimento do tumor, não só através de funções de células-autônoma na regulação da proliferação /apoptose, mas também através da modulação direta de reguladores de angiogênese. O oncogene Myc tem sido demonstrado que regulam a angiogénese através da indução directa do mediador pró-inflamatório, IL-1β, que promove a activação de MMP e de libertação de VEGF retido a partir da matriz extracelular [41]. Ras, através da activação de Myc, pode activar a angiogénese através da repressão do inibidor de angiogénese, a trombospondina-1 [42]. De modo semelhante, o p53 supressor de tumores tem sido demonstrado que regulam positivamente a expressão de trombospondina-1 [43], [44], bem como a produção dos fragmentos derivados de colagénio anti-angiogénicos e endostatina tumstatin [45]. Nós aqui descobrir um papel para p19

Arf em limitar o interruptor angiogénico tumoral, demonstrando que a perda de expressão Arf promove o interruptor angiogénico e acelera o desenvolvimento do tumor, através de ambos os mecanismos de p53 dependente e independente, em um modelo de carcinogénese multi-fase .