Abstract
Fundo
Porque alguns marcadores definitivos estão disponíveis para células hepáticas estaminais cancerígenas (HCSCs), com base em física, em vez de propriedades imunoquímicas, foi aplicado um método inovador para enriquecer HCSCs.
Metodologia
Depois de células tumorais hepáticas (HTCs) foram isolados primeiramente de diethylinitrosamine induzida por ratos F344 modelo HCC utilizando centrifugação de gradiente de Percoll descontínuo (PDGC) e purificado através de tripsinização diferencial e fixação diferencial (DTDA), que foram separados em quatro fracções de Percoll utilizando centrifugação em gradiente contínuo (PCGC) e sequencialmente designadas como fracções I-IV (FI -IV). características morfológicas, os níveis de mRNA e de proteína de marcadores de células-tronco, habilidades de proliferação, a diferenciação induzida,
in vitro
capacidades migratórias,
in vitro
capacidades quimio-resistentes, e
in vivo
capacidades malignas foram determinadas para as células de cada fracção.
Apreciação
Como a densidade de células aumentada, 22,18%, 11,62%, 4,73% e 61,47% de HTCs de cultura principal foram segregados FI-FIV, respectivamente. As células de FIII (densidade entre 1,041 e 1,062 g /ml), mostrou uma relação núcleo-citoplasmática maior e menos organelas e expressaram níveis mais elevados de marcadores de células estaminais (AFP, EpCAM e CD133) do que as células a partir de outras fracções (
P
0,01). Além disso,
in vitro
, as células de FIII mostrou uma maior capacidade de se auto-renovar, diferenciar-se em HTCs maduros, o trânsito através das membranas, arranhões próximos, e levar a resistência à quimioterapia do que as células de qualquer outra fracção;
in vivo
, a injeção de apenas 1 × 10
4 células de FIII poderia gerar tumores não só em tecido subcutâneo, mas também nos fígados de ratos nus.
Conclusões
Através do nosso novo método, as células HCSC-like foram enriquecidos com sucesso em FIII. Este estudo irá contribuir grandemente para duas importantes áreas de interesse biológico:. Isolamento CSC e terapia HCC
Citation: Liu W-h, Wang X, você N, Tao K-s, Wang T, Tang L-j, et al. (2012) Enriquecimento eficiente de cancro hepático células estaminais-como um HCC modelo de rato primária através de um gradiente de densidade A centrifugação Centrada Method. PLoS ONE 7 (4): e35720. doi: 10.1371 /journal.pone.0035720
editor: Kwan Man, The University of Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 03 de fevereiro de 2012; Aceito: 20 de março de 2012; Publicação: 25 de abril de 2012
Direitos de autor: © 2012 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81170419, 81172061, 8100309). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Durante a última década, a noção de que os tumores são mantidos por suas próprias células-tronco, as chamadas células-tronco cancerosas (CSCs), criou grande entusiasmo na comunidade de pesquisa [1]. CSCs são células tumorais geralmente dormentes ou devagar ciclismo, que têm a capacidade de reconstituir tumores [1]. Eles são pensados para ser envolvido na resistência do tumor à terapia de quimioterapia /radiação e recidiva e progressão do tumor. CSCs são importantes porque são responsáveis pela resistência ao tratamento. A obtenção de uma maior compreensão das características CSC-específica proporciona perspectivas sobre os estágios iniciais da tumorigénese para ajudar na prevenção deste fenómeno e para melhorar a selectividade de terapias antitumorais. A existência de CSCs foi proposta pela primeira vez há 40 anos [2]; no entanto, eles foram apenas recentemente isolado a partir de tumores sólidos, incluindo tumores da mama [3], da próstata [4], do cérebro [5] e do cólon [6]. Embora CSCs têm sido isoladas de alguns tipos de tumores, há muito debate em torno deste tema.
O carcinoma hepatocelular (HCC) é um tipo altamente maligno de tumor sólido associado a metástases frequentes e mau prognóstico [7]. CSCs hepáticas isoladas (HCSCs) representam um
in vitro
modelo adequado para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visam erradicar a subpopulação tumorigênico dentro de HCC. É por esta razão que a identificação e compreensão de HCSCs são cruciais. Para isolar HCSCs, uma variedade de técnicas de separação estão disponíveis. Um método comum para CSCs de isolamento foi caracterizar seu fenótipo da superfície celular e usar marcadores para selecionar negativa ou positivamente para células particulares. Relata-se células de tumor hepático (HTCs) com os EpCAM + ou + fenótipo estaminais têm propriedades semelhantes a CD133 [8]; no entanto, eles têm mostrado exibir plasticidade limitada. Actualmente, um marcador específico para o isolamento de HCSCs permanece controverso. É urgentemente necessário um método alternativo para o isolamento de HCSCs. Um outro método para a separação de CSC baseia-se no diferencial de efluxo de corantes fluorescentes, tais como rodamina 123 ou Hoechst 33342. Recentemente, o isolamento de células população lateral (SP) usando corante Hoechst 33342 tornou-se um método útil para a obtenção de CSCs de vários tumores. Num estudo anterior pelo nosso grupo, que enriquecido HCSCs a partir da linha celular MHCC97 com base no efluxo de rodamina 123 ou Hoechst 33342 [9]. No entanto, ainda existem algumas limitações associadas com este método, tais como detecção de células estaminais de falsos positivos e a necessidade de instrumentos especiais. A última opção para o isolamento de CSCs é baseado em métodos de separação físicos, tais como a separação por gradiente de densidade. Em um estudo anterior, foram isoladas com sucesso células-tronco do fígado /progenitoras fetais (FLSPCs) de células fetais de cultura principal fígado através de centrifugação em gradiente de densidade centrado em um método de três etapas [10].
No presente estudo, procurou-se determinar se HCSCs pode ser obtida explorando as suas propriedades físicas. Para este efeito, aplicou-se o nosso método de três passos estabelecida com um ligeiro ajustamento para o isolamento de HCSCs HTCs primárias. Os HTCs foram primeiramente isolados utilizando centrifugação em gradiente de Percoll descontínuo (PDGC), depois purificou-se com base em tripsinização diferencial e diferenciado aderência (DTDA), e, finalmente, em camadas por centrifugação em gradiente de Percoll contínua (PCGC). HTCs foram, portanto, separadas em quatro subpopulações. A terceira subpopulação, que continha as células menor número, com uma densidade que varia entre 1.041 e 1.062 g /ml, apresentou a maior expressão de marcadores de células-tronco, a maior capacidade de proliferar e formam colônias
in vitro
, o maior capacidade para migrar
in vitro
, uma maior capacidade de ser resistente a quimioterapia, e a capacidade mais rica para gerar tumores em ratinhos NOD /SCID. Todos estes resultados indicam que a população da terceira camada dos gradientes PCGC possuía características CSC. Esta nova estratégia para isolar HCSCs vai fazer grandes contribuições em duas áreas principais: proporcionará novos conhecimentos relacionados com o isolamento de outros tipos de CSCs; e vai permitir-nos investigar a contribuição de HCSCs para HCC.
Materiais e Métodos
1 Procedimento para separar HTCs
1.1 Construção de um modelo de HCC por dietilnitrosamina (DEN ) indução.
Doze machos Fisher 344 ratos (animais do recurso Rodent National Laboratory, Xangai, China) no grupo experimental foram tratados com 0,05% de DEN (Sigma Co, NY, EUA) na água de beber durante 6 semanas e foram, em seguida, transferido para água potável normais [11]. Outros doze machos Fisher 344 ratos no grupo de controle receberam uma dieta normal. Aos 10, 14 e 18 semanas após a indução DEN, quatro ratos de cada grupo foram sacrificados. As amostras de tecido do fígado de cada grupo foram rotineiramente processadas e coradas com hematoxilina e eosina (H E) para exame histológico. Todos os experimentos com animais foram realizados estritamente de acordo com protocolos de estudo animal [12] e aprovado pelo Comitê Cuidado e Uso Animal Research na Quarta Universidade Médica Militar.
1.2 Identificação do HCC por imuno-histoquímica.
para melhor identificar o tipo de tumores hepáticos que ocorreram nos ratos, os níveis de AFP e CK19 expressão foram examinadas imuno-histoquimicamente. secções embebidas em parafina foram desparafinados utilizando xileno e de uma série de concentrações de etanol, bloqueadas com soro de cabra a 20%, e coradas com um AFP de coelho-anti-rato primário ou CK-19 anticorpo (diluição 1:200; Santa Cruz, CA). anticorpos secundários IgG anti-coelho de cabra foram usadas para a coloração de AFP ou CK-19. Estas secções também foram contrastadas com 2- (4-diamidinophenyl) dicloridrato -6-indolecarbamidine (DAPI) (diluição 1:100; Sigma) para a detecção de núcleos. Os controlos negativos foram coradas sem anticorpos primários. secções coradas foram examinadas sob um microscópio de fluorescência (FV1000MPE, Olympus Corporation, Tóquio, Japão). As taxas positivas para a AFP e CK-19 foram determinados em todas as seções.
1.3 Isolamento de HTCs por PDGC.
nódulos HCC individuais foram removidos de cada rato no grupo experimental. HTCs matérias foram isolados de acordo com Hohne et al. [13] com pequenas modificações. Resumidamente, os nódulos de carcinoma hepatocelular foram picados em meio E de William (Sigma Co, Louis, MO, EUA) com 0,1% de colagenase de tipo IV e 0,005% de tripsina (Sigma Co, Louis, MO, EUA) e, em seguida, incubadas durante 20 min a 37 ° C em um banho de água com agitação. Após a incubação, os sobrenadantes das células libertadas foram passados através de uma malha de nylon de 100 um e centrifugada a 1000 × g durante 8 min. Os sedimentos foram lavados duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Invitrogen Co, EUA) para se obter HTCs matérias. Estes HTCs brutos foram preparados como suspensões de célula única e separada em diferentes fracções, utilizando PDGC (30%, 50% e 70% de Percoll). As células na interface de 30% e 50% de Percoll foram recolhidas e cultivadas em placas de 6 poços contendo meio de William E suplementado com 10% v /v de soro fetal de bovino (Invitrogen Co, EUA), 5 ug /ml de insulina (Sigma Co , Louis, MO, EUA), hidrocortisona 5 uM, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO
2. Quando as células aderentes estendida como uma colônia monocamada 20 dias mais tarde, foram coletadas as células monoclonais por digestão local com cilindros de clonagem e transferiu-os para uma nova placa de cultura para continuar o processo de cultivo.
1.4 Purificação de HTC através de DTDA .
Para obter HTCs puros, as células em cultura foram tratadas como se segue. Com base nos resultados de um estudo anterior pelo nosso grupo [10], as células de diferentes tamanhos podem ser tripsinizadas dentro de períodos de tempo distintos. Verificou-se quando as células são digeridos usando 0,25% de tripsina durante 10 min, as células são tripsinizadas muito grandes e excluídos, enquanto que outras células permanecem. Este método é referido como “tripsinização diferencial”. Curiosamente, quando as células foram tripsinizadas para repicagem completamente ao longo de um período de 120 minutos, as células grandes não aderir às placas e foram facilmente removidos. Este fenómeno é referido como “aderência diferencial”. HTCs foram purificados através destes dois stepsHTCs.
1.5 Separação de HTCs por PCGC
.
O protocolo foi realizado de acordo com os métodos do nosso estudo anterior [10]. Resumidamente, para criar gradientes contínuos, uma solução de Percoll a 40% foi centrifugado a 20000 × g durante 90 min, utilizando um rotor de ângulo cabeça. O tubo foi em seguida deixada em repouso durante 30 min, e a suspensão de células foi suavemente em camadas em cima de gradientes os pré-formados. O tubo contendo as células foi centrifugado a 500 × g durante 15 min, utilizando um rotor basculante. A partir da parte superior para a parte inferior do tubo, como as densidades celulares aumentaram continuamente, recolhidos quatro fracções de células e fracções deles designados I-IV (FI-IV) (Figura 1A).
Os tumores pequenos (A) (setas pretas) foram causados por 10 semanas de indução de DEN. (B) O fígado tinha sido quase completamente substituída por grandes tumores 18 semanas após a indução DEN. (C) Opinião de baixo de ampliação de um H seção E-manchada do tecido tumoral. (D) Alto ampliação de um H seção E-manchada. (E) Baixo ampliação de uma secção AFP-manchada. (F) Alto, ampliação de uma secção AFP-manchada. (G) vista de ampliação baixa de uma seção CK-19-manchada. (H) Alto, ampliação de uma secção CK-19-manchada. (I, J) Imagens de HTCs de cultura principal. (K, L) Imagens de HTCs purificados por DTDA. ampliações originais: 100 × (C, I-L), 200 × (D, E, G), 400 × (F, H)
2 comparação morfológica entre as diferentes frações
. microscopia electrónica
2.1 Transmissão (MET).
As células isoladas de fresco a partir de cada fracção foram fixadas com glutaraldeído a 2,5% a 4 ° C durante 4 h, em seguida, lavadas com PBS frio e fixadas em mais de 1% de ósmio tetróxido à temperatura ambiente durante 2 h. As amostras foram primeiro desidratadas utilizando um gradiente de etanol e acetona, em seguida embebidas em resina Epon812 e acetona (v /v, 01:01) durante 30 min, seguido por resina Epon812 100% durante 1 h. A resina foi Epon812 solidificou a 37 ° C durante 24 h e a 60 ° C durante 48 h. Secções ultrafinas foram preparadas usando um ultramicrotome LKB (Ultrotome NOVA; LKB, Broma, Suécia) e coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo para exame por TEM (JEM-2000EX, JEOL, Japão)
2.2 imunofluorescência. (IF) coloração com faloidina.
Para analisar melhor as diferenças morfológicas entre as células recém-isoladas de cada fracção, foi utilizada coloração faloidina. As células foram primeiro tratados com um anticorpo primário faloidina (diluição 1:100; Santa Cruz, CA) e, em seguida, com um anticorpo anti-coelho de cabra fluorescente FITC-conjugado secundário (diluição 1:100; Santa Cruz, CA) durante 2 h. A morfologia das células foi observada num microscópio de fluorescência, e os números de cílios e pseudopodia foram calculados.
3 Comparação de marcadores entre diferentes fracções
3.1 A citometria de fluxo (FCM).
As células isoladas de fresco a partir de cada fracção foram preparadas a uma concentração de 10
6cells /mL utilizando meio de William e (contendo 20% de FBS) e incubado durante 15-30 minutos à temperatura ambiente para bloquear não específica locais. Estas células foram então lavadas duas vezes com PBS e re-suspensas em 990 ul de PBS. Subsequentemente, 10 uL de anticorpos, incluindo CD133 (conjugado com PE, BioLegend, EUA) e EpCAM (conjugado com FITC, BioLegend, EUA), foram adicionados a cada suspensão de células. Após 30 min de incubação a 4 ° C no escuro, as células foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas em 0,1% de formaldeído e analisada usando o sistema de FACSCaliburTM (Sistemas Immunocytometry BD, San Jose, CA).
3.2 se a análise.
Depois as células isoladas de fresco a partir de cada fracção aderida a uma lâmina de cultura, elas foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com 4% de paraformaldeído durante 20 min, e imersos em PBS durante 10 min, seguido por exposição para 0,01% de Triton X-100 à temperatura ambiente durante 10 min. As células foram tratadas com soro de cabra a 6% (Santa Cruz, CA) à temperatura ambiente durante 30 min para bloquear não específica reacções imunes e, em seguida, com CD133 primário (diluição 1:200; Santa Cruz, CA), AFP (diluição 1: 200; Santa Cruz, CA) e CK-19 (diluição 1:200; Santa Cruz, CA) anticorpos a 4 ° C durante a noite. Depois as amostras foram lavadas duas vezes com PBS, foram incubadas com anticorpos fluorescentes PE /conjugada com FITC de cabra anti-coelho secundário (diluição 1:100; Santa Cruz, CA) durante 2 h. Subsequentemente, as amostras foram tratadas com DAPI (diluição 1:100; Sigma) durante 15 min. A fluorescência das amostras foi observada utilizando um microscópio de fluorescência (FV1000MPE, Olympus Co., Tóquio, Japão).
3,3 quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR).
O ARN total extraiu-se a partir das células isoladas de fresco de cada fracção utilizando o reagente TRIzol (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) e reversamente transcrito em ADNc com Superscript II reverse Transcriptase, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uma quantidade igual de cDNA a partir de cada amostra foi amplificada com iniciadores específicos (Tabela 1). A PCR foi realizada utilizando SYBR Verde Mistura Mestre (Applied Biosystems, Foster City, CA) ao longo de 40 ciclos. Os parâmetros de ciclagem para a PCR eram de 10 minutos a 95 ° C, 15 segundos a 95 ° C e 30 segundos a 60 ° C, com um passo de dissociação final de 15 segundos a 95 ° C, 20 segundos a 60 ° C, e 15 segundos a 95 ° C utilizando o sistema em tempo real, PCR Bio-Rad MyIQ5 (Bio-Rad, Califórnia, EUA). Cada amostra foi ensaiada em triplicado. Os níveis de ARNm foram normalizados utilizando GAPDH como referência interna.
4 A diferenciação induzida pelo factor de crescimento de hepatócitos (HGF)
Todas as células a partir de cada fracção foram separadamente cultivadas em sérica comercial forma livre (Sigma Co, Louis, MO, EUA) suplementado com HGF a uma concentração de 20 ng /ml. Depois de todas as células em placas de 96 poços (1 × 10
3 células /poço) foram cultivadas durante 14 d, elas foram recolhidas e a identificação exacta foi realizada como se segue. A diferenciação foi avaliada pela detecção da expressão de CSCs CD133 marcador específico por FCM e marcador HCC AFP por IF. Os protocolos detalhados foram como descrito acima.
5 Comparação funcional entre as diferentes fracções
5.1 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT) ensaio.
as capacidades proliferativas das células isoladas de fresco a partir de cada fracção foram determinadas utilizando o ensaio de MTT. Resumidamente, as células foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 10
3 células /poço. Às 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 14 dias de cultura, o MTT (Sigma, St. Louis, MO, EUA) dissolvida em PBS foi adicionado a cada poço a uma concentração final de 5 mg /ml, e o As amostras foram incubadas a 37 ° C durante 4 h. escuras cristais de azul de formazano insolúvel em água que se formaram durante a clivagem de MTT nas células que metabolizam activamente foram, em seguida, dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Gibco /Invitrogen, Nova Iorque, EUA). A densidade óptica foi medida a um comprimento de onda de 490 nm com um Bio-Rad 680 leitor de microplacas (Bio-Rad, Califórnia, EUA).
5,2 Colony teste de formação.
As células isoladas de fresco a partir de cada fracção foram inoculados separadamente em cada cavidade (10 células por poço) de placas de 96 poços (Corning Life Sciences, Acton, MA) suplementado com 100-200 ul de meio E de William, mais o factor inibidor de leucemia (LIF), a uma concentração de 10 ug /ml. A viabilidade celular foi avaliada através de coloração com azul de tripano (Sigma-Aldrich) a vários pontos de tempo. Após 4 semanas de cultura, cada poço foi examinado utilizando microscopia de luz, e o número total de colónias de células foi contado. Imagens das colónias foram gravados usando um microscópio (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Kingston-upon-Thames, Reino Unido) e uma câmera digital (fotônica C4742-95, Hamamatsu, Welwyn Garden City, Hertfordshire, Reino Unido), em condições de contraste de fase.
5,3 ensaio de migração Transwell.
um total de 1 × 10
5 células em 0,5 ml de meio E de Williams isento de soro de cada fracção foram semeadas em um 8 mícrons pore- membrana de policarbonato de tamanho de Boyden câmara inserido num aparelho de Transwell (Costar, Cambridge, MA) revestidas com Matrigel. Um total de 600 ul de meio E de Williams contendo FBS a 20% foi adicionada à câmara inferior. Após incubação durante 24 h a 37 ° C em 5% de CO
2 incubadora, as células sobre a superfície de topo do inserto foram removidos por limpeza com uma mecha de algodão. As células que tinham migrado para a superfície inferior do inserto foram fixadas em metanol a 100% durante 2 minutos, coradas em 0,5% de violeta cristal durante 2 min, lavadas em PBS e sujeitas a uma inspecção através de microscopia. Os valores para a invasão e migração foram obtidos pela contagem sob um microscópio de luz invertida (Olympus Corporation, Tóquio, Japão) em 5 campos selecionados aleatoriamente.
5,4
In vitro
ensaio de zero.
Cada poço de placas de cultura de tecidos de 24 poços foi semeada com células a uma densidade final de 100.000 células por poço, e estas células foram mantidas a 37 ° C sob 5% de CO
2 durante 24 h para permitir que adiram e para formar monocamadas confluentes. Estas monocamadas confluentes foram então marcados com uma ponta de pipeta estéril, para deixar um arranhão de aproximadamente 0,4-0,5 mm de largura. O meio de cultura foi então imediatamente removido (juntamente com quaisquer células desalojadas). O meio removido foi substituído com meio E de William fresco. Todos os ensaios de raspar foram realizadas em triplicado. encerramento zero foi monitorada por recolha de imagens digitais no início da experiência e a intervalos regulares durante o processo de migração celular para fechar a zero, e as imagens foram comparadas para quantificar a taxa de migração das células. As imagens digitais foram capturadas usando um microscópio invertido (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Kingston-upon-Thames, Reino Unido) e uma câmera digital (fotônica C4742-95, Hamamatsu, Welwyn Garden City, Hertfordshire, Reino Unido) em fase.
5,5 quimioterapêutico experimento.
Para confirmar
in vitro
quimio-resistência, 1,5 × 10
5 células a partir de cada fracção foram plaqueadas em placas de 24 poços e tratadas com paclitaxel (10 ng /ml) durante 24 h. A dose óptima de paclitaxel utilizado no presente estudo foi aprovada de acordo com as nossas experiências preliminares. Um kit de detecção de apoptose Anexina V-FITC /PI (Anexina V-FITC /PI Staining Kit; Immunotech Co., Marselha, França) foi utilizada para a detecção de apoptose celular. Resumidamente, as células tratadas com paclitaxel foram recolhidas, lavadas em PBS frio, incubaram-se durante 15 minutos com f luoresceína-conjugado anexina V e PI de acordo com os protocolos do fabricante, e analisadas por FCM.
5,6 Tumor formação em NOD /SCID.
Trinta e seis NOD camundongos machos /SCID (6-8 semanas de idade) obtidos a partir do centro de animais de laboratório de Beijing Xiehe University Medical (Pequim, China) foram mantidas em condições limitadas de agentes patogénicos para o animal centro de recursos da Quarta Universidade médica Militar (Xi’an, China). Estes ratos foram aleatoriamente divididos em seis grupos: F0, FI, FII, FIII FIV, ea linha de células HeG2 controle. Assim, cada grupo foi alimentado com 6 ratos. As células foram injectadas em ratinhos NOD /SCID, por injecção subcutânea em diferentes quantidades (1 × 10
5 e 1 × 10
4). O crescimento tumoral foi monitorizado a cada 2 dias após a segunda semana de inoculação. Todos os ratinhos foram sacrificados 60 dias após a injecção. Todos os tecidos tumorais resultantes foram recolhidos, fixados em formaldeído a 4% e embebidos em parafina para a H E de coloração para avaliar a histologia do tumor. Os tumores foram classificados de acordo com seu tamanho. A existência de nenhum tumor macroscópica foi definida como negativa (-); um diâmetro de tumor 0,2 cm como positivo (+); um diâmetro de 0,2-0,5 cm, como moderadamente positiva (++); e um diâmetro de 0,5 cm tão fortemente positiva (+++)
6 estatística A análise
SPSS 14.0 software foi utilizado para todas as avaliações estatísticas.. Todos os dados são expressos como a média ± erro padrão de experiências separadas (n≥3, em que n representa o número de experiências independentes). Os dados foram analisados para significado estatístico utilizando ANOVA de uma via.
P
. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
formação
1 HCC e isolamento HTCs
Quando os ratos foram sacrificados 10 semanas após a indução DEN , apenas pequenos tumores poderia ser encontrado (Figura 1A). Às 18 semanas após a indução de DEN, a maior parte do tecido do fígado de ratos tinha sido substituído por tecidos tumorais com superfícies ásperas (Figura 1B). Com base nas avaliações de três patologistas independentes, H E coloração verificou-se que os tumores eram todos carcinoma hepático derivado (Figura 1C, D). Para melhor identificar o tipo de tumores, que seleccionado um marcador de HCC (AFP) e outro marcador para o colangiocarcinoma (CK-19) para corar as secções de tecido a partir dos mesmos tumores. A maioria das células tumorais no interior de nódulos de tumor coradas positivamente para a AFP (68,7 ± 6,21%) (Figura 1E, F). Em contraste, quase sem células que coraram positivamente para CK-19 foram encontrados em uma grande área (1,12 ± 0,13%) (Figura 1G, H). Em resumo, os tumores coradas positivamente e negativamente para a AFP para CK-19. Este resultado indica que estes tumores eram quase origem hepática, que é consistente com os resultados de H E de coloração. Os HTCs isoladas a partir de tecidos de carcinoma hepatocelular primário cresceu lentamente no início, com apenas algumas colónias a ser formada, e exibida morfologia heterogénea (Figura 1I, J). Através da purificação DTDA, HTCs proliferaram rapidamente e foram muito mais homogêneo (Figura 1 K, L). Assim, estes HTCs poderia ser usado para as experiências subsequentes.
2 Fraccionamento de HTC através PCGC
Num estudo anterior, verificou-se que a centrifugação de 40% de Percoll, durante 90 minutos resultou na formação de um gradiente contínuo óptimo [10]; Portanto, no presente estudo, aplicamos esta metodologia para fracionar HTCs. Sob estas condições, de acordo com a distribuição dos sedimentos celulares, dividiu-se a população HTCs (F0) em quatro fracções principais (fracção I-IV, FI-IV). Com base na monitorização da densidade do marcador grânulos, quatro fracções de células foram suavemente removido individualmente a partir do tubo, a partir do topo para a base (Figura 2A). Celular contagem revelou que 22,18 ± 2,13%, 11,62 ± 1,06%, 4,73 ± 0,38% e 61,47 ± 6,24% das células foram segregados em FI-FIV, respectivamente, o que significa que o FIV continha a maioria das células, e as células menor número (inferior 5% das células) foram encontrados em FIII (Figura 2A). Com base em histogramas dot-plot obtidos a partir de FACS, antes da separação, as células em F0 eram heterogéneos no tamanho, ao passo que, após a separação, o tamanho das células em cada fracção tornou-se um pouco mais homogénea. Como esperado, a análise de FCM de cada subpopulação revelou um aumento na granularidade da célula [FSC (dispersão frontal) /SSC (dispersão lateral)] com o aumento da densidade de Percoll (Figura 2B). Assim, a partir de FI para FIV, as células aumentou continuamente em tamanho.
(A) Ilustração esquemática do gradiente de Percoll contínua utilizada para fraccionamento e as percentagens de células segregadas em cada fracção. (B) Ponto-plot_histograms resultante da análise de FACS que mostra as densidades de células em cada fracção. (C) A microscopia de luz de células de cada fracção em fase. (D) as imagens de TEM e diâmetros de células a partir de cada fracção. (E) Imagens de células coradas por phalloidin reflectir as diferentes morfologias das superfícies celulares. ampliações originais: 100 × (C), 6000 × (D), 400 × (E)
3 de comparação morfológica de células do FI-FIV
As células de cada fracção. foram cultivadas separadamente em meio de William E. As células de FIII foram os primeiros a aderir a placas, que ocorreram em menos de 2 h, seguido pelas células de FI e FII em 2,5 h, e as células de FIV e F0, o que exigiu mais de 3 h. Em
in vitro
condições de cultura, as células heterogénea porte em F0 pode ser facilmente observado. Após separação, verificou-se que as células de FII e FI foram o menor, seguido por FIII, e as células de FIV foram as maiores (Figura 2C).
As imagens TEM exibida fenómenos semelhantes tal como observado no os resultados obtidos através de microscopia de luz. As células F0 exibiu uma grande variedade de diâmetros, variando de 6 uM para 30 uM (Figura 2D). Os diâmetros das células de FII e FI foram o menor, seguido por FIII, e os diâmetros das células de FIV foram as maiores (Figura 2D). Enquanto isso, as células de FIII apresentou a maior relação núcleo-citoplasmática e as organelas menor número; Em contraste, as células de FIV mostraram a menor relação núcleo-citoplasmática e o maior número de organelos (Figura 2D). Isto indicou que as células de FIII foram as mais imaturas.
Além disso, as células coradas a partir de cada fracção utilizando faloidina. Na microscopia de fluorescência, as células de FIII foram ligeiramente mais intensamente corado por faloidina e exibida mais cílios ou pseudopodia nas suas superfícies das células do que os de qualquer outra fracção (Figura 2E). No entanto, a análise estatística indicou a diferença não foi significativa (
P Art 0,05).
4 Expressão de marcadores de células-tronco
Para determinar as propriedades-tronco de células cada fracção, dois marcadores de células-tronco relativamente amplamente aceitas foram detectados por FCM imediatamente após a separação. Ambos EpCAM e CD133 foram mais altamente expresso nas células isoladas de fresco a partir de FIII em comparação com as outras fracções (
P
0,01) (Figura 3A, C). A percentagem de células positivas em EpCAM-FIII era tão elevada como 81,5 ± 7,96%, e a percentagem de células CD133-positivo foi ainda mais elevada, 84,7 ± 8,53%. Em contraste, a expressão de ambos os marcadores de células estaminais em células isoladas de fresco a partir de FIV foi menor:. 7,1% ± 0,64% para EpCAM e 5,7% ± 0,63% para CD133 (Figura 3A, C)
(A) expressão de marcadores de células-tronco (EpCAM e CD133) em cada fracção determinada pela FCM. (B) Com base no IF, células CD133-positivos (vermelhos, núcleos em azul) e AFP e células-CK-19 positivo (verde, núcleos em azul) foram encontrados para ser incluído em diferentes proporções. (C) gráfico de colunas que reflecte os dados obtidos via FCM. (D) gráfico de colunas que reflete os dados gerados pelo IF. Resultados (E) QRT-PCR de marcadores específicos em células isoladas de fresco a partir de cada fracção. F0 representa HTCs não fraccionadas; FI-IV indica fracções I-IV, após a separação. * Refere-se a
P
0,01 em comparação com qualquer outra fracção. ampliação original:. 100 × (B)
Para identificar ainda mais as propriedades-tronco de células de cada fracção, foi detectada a expressão de CD133 usando IF. A percentagem de células CD133 positivo foi o mais alto em FIII, em 83,2% ± 8,01%, ea menor em FIV, em 4,6% ± 0,42%, (Figura 3B, D). Nós também seleccionado um marcador de tumor hepático (AFP) e um marcador de tumor biliar (CK-19) para identificar as células de cada fracção. Após separação, a percentagem de células positivas AFP em FIII foi a mais elevada (89,6% ± 8,27%), sendo muito mais elevado em qualquer outra fracção (
P
0,01) (Figura 3B, D). No entanto, apenas algumas células no FI foram determinados como sendo CK-19 positivo (6,1% ± 0,54%), e quase sem células F0, FII, FIII e FIV expressa CK-19 (Figura 3B, D).
O fenómeno descrito acima foi quantitativamente verificada utilizando qRT-PCR. Os níveis relativos de EpCAM e AFP mRNA foram maiores nas células de FIII (
P Art 0,01), sendo quase quatro vezes maior do que observada em células de F0. Em contraste, os níveis de ARNm de EpCAM e a PAC, foram mais baixos em células de FIV (
P
0,01), sendo a metade dos níveis em células de F0 (Figura 3E). De acordo com os resultados de IF, CK-19 ARNm poderia ser apenas fracamente detectada em células de FI (dobra relativo foi 0,103 ± 0,012); no entanto, CK-19 mRNA mal podia ser células de F0, FII, FIII e FIV (Figura 3E) detectado. Além disso, o marcador hepática madura ALB foi moderadamente expressa em células de FIV, muito fracamente expresso em células de F0, FI e FII, e expressou quase não a todos em células de FIII.