Abstract

As células tumorais circulantes Introdução

(CTCs) poderia representar uma fonte não-invasivo de câncer as células usadas para a monitorização longitudinal do estado de mutação tumoral ao longo do curso da doença. Os objetivos do presente estudo foram investigar a detecção de

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mutações em CTCs de pacientes com câncer colorretal metastático (mCRC) e comparar o seu estado de mutação durante o tratamento ou a progressão da doença com a dos tumores primários correspondentes.

Materiais e Métodos

Identificação dos sete

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mutações nos codões 12 e 13 foi realizada por Peptide Nucleic Acid (PNA) à base de método mais comum qPCR. A sensibilidade do ensaio foi determinado após o isolamento de

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células cancerosas cravado mutantes em sangue de dadores saudáveis, utilizando o kit de CellSearch celular epitelial. detecção consistente de

KRAS

mutações foi conseguido em amostras contendo pelo menos 10 células tumorais /7,5 ml de sangue.

Resultados

A utilidade clínica do ensaio foi avaliada em 48 amostras de sangue extraídas 31 pacientes com mCRC. Todos os pacientes tiveram

PIK3C

A e

BRAF

tipo selvagem tumores primários e 14

KRAS

tumores mutantes. CTC foram detectados em 65% das amostras obtidas a partir de 74% dos pacientes.

KRAS

análise de mutação em amostras CTC-enriquecidos mostrou que 45% e 16,7% dos pacientes com tumores primários mutantes e de tipo selvagem, respectivamente, tinham mutações detectáveis ​​em suas CTCs. Avaliando

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mutações em amostras de sangue de série revelou que CTCs individuais do doente exibiu estado mutacional diferente de

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durante o tratamento.

Conclusões

O actual apoio aos achados a razão para o uso do CTC como uma fonte dinâmica de células de tumor que, por re-avaliação da sua

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estado de mutação, poderia prever, talvez mais precisamente, a resposta dos pacientes à terapia CCRm alvo.

citação: Kalikaki A, Politaki H, J Souglakos, Apostolaki S, Papadimitraki E, Georgoulia N, et al. (2014)

KRAS

genotípica Alterações de células circulantes do tumor durante o tratamento de pacientes com câncer colorretal metastático. PLoS ONE 9 (8): e104902. doi: 10.1371 /journal.pone.0104902

editor: Georgia Sotiropoulou, University of Patras, Grécia |

Recebido: 29 Abril, 2014; Aceito: 16 de julho de 2014; Publicação: 19 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kalikaki et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação da Associação de Creta for Biomedical Research (CABR), a Sociedade Helénica de Oncologia Médica (HeSMO) eo Programa operacional “Competitividade Empreendedorismo”, National Quadro de Referência Estratégico 2007-2013, Acção Nacional: “Cooperação”, OncoSeed Diagnóstico: Biologia de células circulantes de tumor, Distante Metástase Desenvolvimento de líquidos Métodos de biópsia; Secretaria-Geral de Pesquisa e Tecnologia da Grécia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Assistant Professor John Souglakos atualmente serve como um editor acadêmico. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A associação entre a

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mutações e resposta a inibidores do EGFR tem sido estabelecido em vários estudos; consequentemente,

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genotipagem é recomendado em todos os pacientes com câncer colorretal metastático (mCRC) antes de qualquer terapia que utiliza o alvo EGFR anticorpos monoclonais, cetuximab ou panitumumab [1]. No entanto, nem todos os pacientes com

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tumores de tipo selvagem responder às terapias alvo-EGFR e a maioria dos pacientes inicialmente responsivos a doença evoluiu dentro de 5 a 6 meses [2].

Tendo em conta que a maior parte dos estudos foram conduzidos utilizando o tecido obtido a partir do tumor primário enquanto que os anticorpos monoclonais EGFR têm sido utilizados para tratar a doença metastática, é possível que a falta de eficácia e /ou o surgimento de resistência subsequente pode ser devido a diversificação genética de células metastáticas em comparação com os seus homólogos de tumor primário ou a variações dinâmicas no genótipo ou fenótipo tumoral que surgem durante o tratamento.

Vários estudos têm mostrado estado de mutação discordante entre os tumores primários e metástases em uma proporção correspondente (5% -30% ) de pacientes de CRC [3], [4], [5], [6]. Além disso, estudos recentes sugerem que a resistência adquirida é conseguido em parte através da selecção de pequenas sub-clones de pré-existente com mutações que conferem resistência à terapia anti-EGFR [7], [8]. Porque biópsias invasivas de metástases não são sempre é viável e não pode ser facilmente executado repetidamente, as células tumorais (CTCs) em circulação no sangue periférico de pacientes com cancro, que se pensa mediar a propagação hematogénica de doença para locais distantes, pode representar uma fonte alternativa de metástase células tumorais.

é bem documentado que CTCs, como definido pelo Sistema CellSearch aprovado pela FDA, pode servir como um marcador de carga de tumor micrometastática associada com o prognóstico dos pacientes e pode prever com precisão a eficácia da terapia em mama metastático, colorretal, próstata e câncer de pulmão [9], [10], [11], [12]. Estudos anteriores em câncer colorretal metastático sugeriu que o número absoluto e as variações numéricas de CTCs durante a progressão da doença ou terapia pode fornecer informações valiosas para a evolução clínica e a eficácia dos tratamentos administrados [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. No entanto, CTCs nem sempre pode ser identificada em pacientes metastáticos, enfatizando a necessidade de desenvolver ensaios de detecção CTC específicos do tipo mais sensíveis e câncer [19]. Neste contexto, a identificação de mutações oncogénicas em CTC poderia contribuir para a melhoria de métodos de detecção existentes. Além disso, genotipagem de CTCs poderia melhorar o acompanhamento da resposta a terapias específicas, identificando perfis genômicos preditivos de recorrência da doença antes da progressão clínica da doença [20], [21], [22], [23], [24].

o objetivo deste estudo foi investigar a viabilidade da detecção de

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mutações em frações CTC-enriquecidas em pacientes com mCRC. Objetivos adicionais foram avaliar se

KRAS

estado de mutação de CTCs se correlaciona com o de tumores primários correspondentes e examinar a heterogeneidade genética de CTCs no que diz respeito ao

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estado de mutação durante o tratamento.

Materiais e Métodos

os pacientes

Trinta e um pacientes com câncer colorretal metastático foram inscritos no estudo atual. Em todos os pacientes, o diagnóstico foi confirmado pelo exame histológico do tumor primário antes do início de qualquer terapia sistêmica. Todos menos um paciente foram tratados com 5-FU à base de primeira linha quimioterapia de combinação, com ou sem um agente biológico (bevacizumab ou panitumumab). Dezenove (55%) pacientes receberam uma combinação à base de irinotecano e 11 (37%) de um regime à base de oxaliplatina no cenário de primeira linha (um paciente não recebeu nenhum tratamento). Além disso, 25 (83%) pacientes receberam bevacizumab e dois (7%) panitumumab. No momento da análise, 19 pacientes apresentaram progressão da doença para tratamento de primeira linha e 12 deles foram tratados com um regime de quimioterapia de segunda linha; cinco destes 12 pacientes foram tratados com panitumumab em combinação com quimioterapia.

O sangue periférico foi analisada para a presença de CTC antes do início do tratamento de primeira linha em 12 pacientes, no momento da progressão em primeira linha tratamento em 9 e a qualquer momento durante o tratamento em 18 pacientes.

Todos os doentes, bem como 16 dadores de sangue saudáveis, que não tinham nenhuma doença conhecida e sem história de doença maligna, foram testados para a presença de CTC, utilizando o CellSearch epitelial Kit celular (Veridex LLC). O sangue periférico foi obtido a partir de pacientes com CCRm (7,5 ml) e dadores saudáveis ​​(23 ml, para utilização em experiências spiking) por punção venosa em tubos CellSave específicos; a fim de evitar a contaminação das amostras com as células epiteliais os primeiros 5 ml de sangue foi rejeitado. Todos os testes foram realizados dentro de 72 horas a partir da colheita de sangue de acordo com as instruções do fabricante. As células que foram CK (+) /CD45 (-). E tinha um núcleo intracelular DAPI positivas foram caracterizadas como CTCs por biólogos experientes (EP e SA)

Uma vez que este estudo foi um estudo piloto de viabilidade, houve sem uma estatística da amostra coleção estimativa do tamanho e espécime foi baseada na disponibilidade de cartuchos CellSearch.

Ética declaração

Todos os pacientes deram o seu consentimento informado por escrito para participar do estudo, que foi aprovado pelo Comitês de ética e científica da University Hospital Geral de Heraklion, Creta, Grécia; o manuscrito foi preparado de acordo com os critérios OBSERVA [25]

As linhas celulares

linhas celulares de cancro abrigar

KRAS

mutações [LS174T, adenocarcinoma de cólon humano, c.35G Um (p.G12D); HCT116, o adenocarcinoma do cólon humano, c.38G A (p.G13D); HUP-T3, adenocarcinoma pancreático humano, c.34G C (p.G12R); KYSE410, carcinoma de células escamosas esofágico Humano, c.34G T (p.G12C); A549, adenocarcinoma alveolar humano, c.34G A (p.G12S); SW403, adenocarcinoma de cólon humano, c.35G T (p.G12V) e RPMI8226, mieloma humano, c.35G C (p.G12A)] ou tipo selvagem para

KRAS

(HT-29, Human adenocarcinoma do cólon)] originado a partir da American Type Culture Collection (ATCC, EUA) e foram gentilmente cedidas do Prof. A. Jung (Instituto de Patologia, Ludwig-Maximilian-University, Munique, Alemanha). Todas as linhas celulares foram cultivadas em frascos de acordo com as recomendações do fornecedor, antes da colheita subsequente utilizando 0,25% de tripsina e EDTA 5 mmol L /(GIBCO-BRL). Autenticação foi feito por determinação do

KRAS

estado mutacional de cada linha celular por seqüenciamento Sanger. Todas as linhas de células, exceto SW403 foram heterozigotos para

KRAS

mutações e revelou o genótipo esperado.

isolamento de DNA a partir de fracções e tecidos

Na sequência de contagem CTC, as células capturadas CTC-enriquecidos foram transferidas da câmara para um tubo de 2 mL e submetidos a uma digestão com proteinase K a 65 ° C durante 2-5 h; isolamento de ADN foi realizada utilizando o Epicentre MasterPure ADN RNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções dos fabricantes e o DNA extraído foi quantificado utilizando um NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies, EUA) e armazenou-se a -20 ° C até serem usadas. O rendimento médio de DNA foi -1,5 mg; No entanto, a quantificação de DNA por espectroscopia de UV não é preciso, devido à detecção de ADN de cadeia simples, ARN ou nucleótidos livres na amostra.

incluídos em parafina fixadas em formalina (FFPE) de tumor de tecido primário foi avaliada histologicamente pela um patologista (MT) e micro-dissecção foi realizada para aumentar a percentagem de células tumorais. Três secções de tecidos de 5 um foram deparaffinised por xileno e etanol lavagens e submetido a uma digestão proteinase K durante a noite a 56 ° C, em seguida, o ADN foi purificado utilizando um kit de micro QIAamp DNA (Qiagen, Alemanha).

A análise da mutação no primário tumores

em consentindo pacientes, os tumores primários foram avaliados para mutações no

KRAS

,

PIK3CA

e

BRAF

tanto pelo sequenciamento Sanger e metodologias com alta sensibilidade como descrito anteriormente [26].

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ensaio de mutação

Um ensaio de mutação que combinava a PNA (PNA) mediada por PCR braçadeira com TaqMan-MGB discriminação alélica ensaios foi previamente desenvolvida para detectar a sete mais comum

KRAS

mutações [6] .Os condições térmicas para PCR PNA mediada de aperto para cada um dos sete

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modelos mutantes foram optimizadas usando um PNA marcado com um corante fluorescente tanto como sonda e sensor de braçadeira de PCR de acordo com Luo JD et al [27]. A maior seletividade, valor ou seja, alta Ct na sonda do tipo selvagem e de baixo valor Ct na sonda mutante foi alcançado a 62 ° C com 200 nM PNA para o c.35G A (p.G12D), c.38G A (p.G13D) e c.35G T (p.G12V) e 150 nM para o PNA c.34G C (p.G12R), c.34G T (p.G12C), c.34G a ( p.G12S) e c.35G C (p.G12A)

KRAS

mutantes modelos, respectivamente. As reacções foram realizadas em Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System em placas de 384 poços, num volume total de 5 mL, contendo 2 ul (cerca de 1/8 do total de DNA extraído a partir de amostras CTC-enriquecidos e 20 ng de ADN extraído de FFPEs ) DNA, 2,5 mL 2X TaqMan mistura principal genotipagem (Applied Biosystems, EUA), 0,25 mL de genotipagem mistura de ensaio e 150 ou 200 nm PNA; Em paralelo, foi efectuada uma reacção não-PNA-braçadeira. As condições de PCR foram 95 ° C durante 10 min, seguido de ciclagem de dois passos: 50 ciclos de 92 ° C durante 15 s, e 62 ° C durante 90 s. Todas as amostras foram realizadas pelo menos em duplicado. Os valores Ct foram obtidos a partir de software de recolha de dados de PCR em tempo real do instrumento usando 0,2 limiar manual. Um controlo positivo para cada

mutação KRAS

(amostras modelo que compunham misturas de linhas celulares com mutantes rácios /tipo selvagem 1/100 e 1/500) e um controle negativo (

KRAS tipo selvagem

linha de células) na entrada total de 50 ng foram incluídos em cada

O ΔCt = Ct

sonda mut (+ PNA) -. Ct

sonda em peso (valor -PNA) foi calculado para cada amostra; Ct

sonda mut (+ PNA) e Ct

sonda peso (-PNA) denotava o Ct (limiar de ciclo Ct, é denominado como o número do ciclo em que um sinal é detectado acima da fluorescência do fundo) valores para o mutante e sondas wt das reacções com e sem PNA, respectivamente. O Ct

sonda mut (+ PNA) reflete a quantidade de

KRAS

DNA mutante dentro da amostra, enquanto o Ct

sonda peso (-PNA) reflete a quantidade de template amplificável derivada dos números variados de contaminação de leucócitos no CTC fração [28].

ensaio de validade

validade do resultado do ensaio para cada amostra foi determinado pelo valor Ct

sonda peso (-PNA), que deve ser 24≤Ct

sonda peso (-PNA) 32; Se o Ct

sonda em peso (-PNA) numa amostra é superior a 32, o resultado do ensaio não é fiável devido a uma baixa quantidade de ADN ou de amplificação do alvo falhou. Eficiente de aperto PNA PCR foi confirmada por um valor de Ct

wtprobe (+ PNA) 45. O

KRAS

estado de mutação foi determinada pela comparação dos valores ΔCt previamente definidos valores de corte ΔCt para cada um dos sete mais comum

KRAS

mutações. Os valores de corte para cada ensaio de mutação foram determinados a partir da análise de amostras de sangue de 16 doadores saudáveis ​​após análise CellSearch. Como valor de corte foi definido ao ΔCt correspondente à especificidade máxima; isto é, nenhuma mutação detectada em 100% (16/16) de dadores saudáveis ​​(Tabela 1, Figura 1).

Gráficos mostrou os valores ΔCt (

Y

eixo) versus o CTC- amostras enriquecidas (

x

eixo) de pacientes com CCRm (n = 31), indivíduos saudáveis ​​(n = 16) e as amostras modelo cravado com 100 e 10 células de linhas de células (LS174T, SW403, KYSE410 e HCT116) que abrigam hotspot

KRAS

mutações c.35G A; p.G12D (A), c.35G T; p.G12V (B), c.38G A; p.G13D (C) e c.34G T; p.G12C (D). limite de corte é representado por dot-line; amostras com ΔCt abaixo do limiar são considerados mutante; ΔCt = Ct

sonda mut (+ PNA) – Ct

sonda peso (-PNA); NVD, nenhuma variante detectada.

Especificidade analítica e sensibilidade

A especificidade analítica dos sete ensaios foi avaliada individualmente usando DNA genômico (gDNA) isolado de

KRAS

linha de tipo selvagem celular (HT29) ou positivo para específica

KRAS

mutações; o limite inferior de detecção para todos os ensaios foi de 0,015 ng. Para avaliar a sensibilidade analítica, cada um dos sete

KRAS

linha celular mutante ADNg foi diluído em série ao longo de um intervalo de três concentrações diferentes (100 ng, 50 ng e 20 ng) de tipo selvagem ADNg fornecida pela HT- 29 a linha celular para dar razões de mutação /de tipo selvagem de 100%, 50%, 10%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% e 0%. Todos os ensaios têm uma sensibilidade de 0,1%, mantendo o total de entrada constante a 20 ng, excepto os ensaios para a detecção de p.G13D p.G12V e que tem uma sensibilidade de 0,5% (Tabela 1).

reatividade cruzada

testes de reactividade cruzada foram realizados para todos os ensaios de mutação que potencialmente identificar modelo de outro ensaio devido à base-emparelhamento imperfeito e ler-through. Os resultados indicam que o ensaio G12D mostra reactividade cruzada significativa com os modelos G12V e mutantes G12a, o ensaio de G13D com o modelo mutante G12S, o ensaio G12R com as G12C e G12S modelos de mutantes e o ensaio G12C com o modelo mutante G12S (Tabela 2).

intra e inter-ensaio de precisão

precisão intra-ensaio foi avaliada através da análise de amostras modelo executado em triplicado no mesmo experimento usando diluição em série (100%, 50%, 10%, 2%, 1%, 0,5% e 0,1%) de

KRAS

ADN mutantes, tal como mencionado acima, em 20 ng de fundo

KRAS

ADN de tipo selvagem. Os coeficientes de ΔCt de variação para o

KRAS

DNA mutante variou entre 0,3% e 2,5%. reprodutibilidade inter-ensaio foi medida de modo análogo por meio do cálculo dos coeficientes de variação ΔCt de amostras em triplicado executar em dias diferentes utilizando as mesmas diluições em série de ADN mutada. Os coeficientes de ΔCt de variação para o

KRAS

DNA mutante variou entre 0,4% e 2,5%. Além disso, em amostras modelo com uma mutação /relação de tipo selvagem de 0,5%, a taxa global de falha ensaio de mutação foi de 0%.

Resultados

Mutation otimização ensaio

A sensibilidade do nossa abordagem experimental para determinar com precisão o

KRAS

estado de mutação em um número limitado de CTCs presentes entre as células sanguíneas normais no sangue circulante foi validado por spiking

KRAS

células cancerosas mutantes para o sangue de dadores saudáveis . Aproximadamente 100 e 10 células tumorais foram misturados em 7,5 ml de sangue em tubos de CellSave e analisadas por CellSearch dentro de 2 dias, em pelo menos 3 experiências independentes. A recuperação percentual média para as células 100 e 10 perfurantes [LS174T, c.35G A (p.G12D), n = 5 experiências; HCT116, c.38G A (p.G13D), n = 4 experiências; SW403, c.35G T (p.G12V), n = 4 experiências e KYSE410, c.34G T (p.G12C), n = 3 experiências] foi de 95% (gama de 70% -100%) e 92,5 % (gama de 25% -130%), respectivamente. A ampla gama de recuperação pode ser atribuído ao erro associado com baixos números de pico-a de células. Seguindo CTC enumeração pelo kit CellSearch celular epitelial, o DNA foi extraído das células capturadas e espécimes foram analisadas para todos os sete

KRAS

mutações. Por este ensaio,

KRAS

mutações poderia ser consistentemente identificados a partir de 10 células tumorais fortificadas.

características e avaliação de CTCs

demografia do paciente, características clínicas e patológicas são listados de Doentes na Tabela 3.

KRAS

mutações foram identificadas em tumores primários de 45% dos pacientes; oito tumor primário (57%) dos pacientes abrigava o c.35G A (p.G12D) mutação, três (21%) do c.35G T (p.G12V), uma (7%) do c.38G Um (p.G13D), uma (7%) do c.34G T (p.G12C) e um (7%) do c.35G C (p.G12A). Todos os tumores eram

PIK3CA

e

BRAF

tipo selvagem. O tempo médio entre a ressecção cirúrgica do tumor primário e análise de CTCs foi de 6 meses (intervalo de 1-134).

Um total de 48 amostras de sangue foram obtidas de 31 pacientes para CTC enumeração usando CellSearch ( tabela 4). Doze (39%) pacientes eram quimioterapia naïve no momento da primeira coleta de sangue. Doze (71%) e 11 (79%) pacientes com

KRAS

tipo selvagem e tumores primários mutantes, respectivamente, tiveram CTCs detectáveis; uma mediana de 9 (gama 2-660) e 7 (intervalo de 1 a 865) CTC foram detectadas em doentes com

KRAS

tipo selvagem e mutantes de tumores primários, respectivamente. No total, 1 ou mais CTC pode ser detectada em 31 amostras (65%) de sangue obtidas a partir de 23 (74%) pacientes (Tabela 4).

KRAS

análise de mutações nos codões 12 e 13 foi realizada em todas as amostras com CTCs detectáveis ​​(Figura 1).

KRAS

mutações em pacientes CTC enriquecido amostras

KRAS

mutações podem ser identificadas no CTCs de cinco (45%) pacientes cujos tumores primários tinha mutado

KRAS

. Em particular, antes do início de 1

st linha de quimioterapia apenas dois dos pacientes virgens de seis quimioterapia (# 1 e # 5) abrigavam CTCs com mutações detectáveis, enquanto no momento da progressão da doença, mutações podem ser identificadas em um (# 8) dos dois pacientes; mutações também eram detectáveis ​​durante o follow-up de 1

linha de tratamento st em dois pacientes (# 6 e # 10) (Tabela 4).

poderia também ser identificados KRAS

mutações nas CTCs de dois (17%) pacientes (# 15 e # 16) cujos tumores primários não tinham mutações detectáveis; em ambos os pacientes, as CTCs foram coletados durante o monitoramento da primeira quimioterapia line (Tabela 4).

KRAS

estado mutacional de CTCs em amostras de sangue de série

Quatro amostras de sangue em série do paciente # 1 teve CTCs detectáveis;

KRAS

mutações foram documentados mesmo após a administração do primeiro ciclo de quimioterapia, apesar da diminuição importante do número de CTC; continuação do tratamento (após o 3

ciclo rd) resultou em redução ainda maior do número CTC e indetectável

KRAS

mutações em amostras CTC-enriquecidos enquanto a avaliação da resposta ao tratamento revelou uma resposta parcial; após o 8

th ciclo de quimioterapia, o número de CTCs foi aumentada e

KRAS

mutações poderiam ser detectados novamente enquanto o paciente ainda permanecia em resposta parcial (Tabela 4).

No caso da paciente # 15 que tinha um

KRAS selvagem

tumor tipo primário, nenhum

KRAS

mutações podem ser detectados na amostra CTC-enriquecidas quando o paciente estava em resposta parcial e sob tratamento com panitumumab manutenção; No entanto, após 4 meses de tratamento, no momento da progressão da doença, conforme documentado pelo radiológica agravamento das lesões hepáticas e a aparência clínica de ascites, o número dos CTC foi aumentada e

KRAS

mutações poderão ser identificados no CTC fracção de células enriquecida.

KRAS

mutações eram mais detectáveis ​​após a 2

nd ciclo de quimioterapia de resgate, apesar da diminuição do número CTC (Tabela 4).

Discussão

As mutações em

KRAS

resultado na activação constitutiva da via de Ras /MAPK, e prever a falta de resposta aos anticorpos monoclonais anti-EGFR. Até à data, as decisões de terapia depende principalmente da

KRAS

estado de mutação do tumor primário; No entanto, as alterações genéticas que ocorrem durante a progressão da doença e resistência adquirida ao tratamento pode alterar a fisiologia do tumor. Por conseguinte, uma importante questão diz respeito à possibilidade de utilizar CTC como uma alternativa não invasiva de uma nova biópsia que poderia ser mais representativas do estado biológico de corrente de células tumorais e pode ser utilizado como um biomarcador de qualquer sensibilidade ou resistência adquirida a EGFR alvo terapia.

os resultados do estudo indicam claramente a viabilidade para determinar o

KRAS

estado de mutação em amostras de sangue CTC-enriquecido no contexto da prática clínica de rotina, na sequência de CTCs enumeração pela CellSearch sistema. Os dados apresentados suportam fortemente a hipótese de que o CTC pode representar uma fonte de tempo real de biópsia líquido, o qual pode permitir a genotipagem dinâmico de células de tumor durante o tratamento. Os dados também indicam que o ensaio estabelecido proporciona uma sensibilidade de detecção de aproximadamente 10 células mutadas /7,5 ml de sangue, sem a necessidade de amplificação do genoma inteiro, e oferece a possibilidade de uma monitorização seriada não invasivo, rápido e de baixo custo do

KRAS

estado de mutação em códons 12 e 13, durante o curso do tratamento.

KRAS

mutações foram identificadas, mesmo em amostras clínicas contendo um preço tão baixo quanto 3 CTCs /7,5 ml de sangue; não podemos excluir que isto pode ser devido à presença de

KRAS

mutações nos fragmentos CTC que não são considerados como CTCs real durante a documentação e contagem de CTCs pelo sistema CellSearch e /ou DNA livre de células (cfDNA) adsorvido à superfície dos leucócitos contaminantes [29]. É de notar que estudos anteriores mostraram que ambas as CTCs e fragmentos CTC correlacionam-se com os resultados dos pacientes no câncer de próstata [30].

Apesar do pequeno tamanho da amostra e da população de pacientes heterogêneo analisados, o presente estudo fornece evidências de que

KRAS

estado de mutação de CTCs pode diferir substancialmente do que do tumor primário correspondente. CTCs sem detectável

KRAS

mutações foram obtidos a partir de seis dos 11 pacientes com tumores primários mutantes; isto pode ser explicado pela heterogeneidade intra-tumoral e /ou o enriquecimento de clones preexistentes pequenas com maior potencial metastático durante a progressão da doença. No entanto, em três dos seis casos discordantes, a ressecção e exame do tumor primário para

KRAS

mutações foi realizada apenas um mês antes da análise dos CTC (dados não mostrados), indicando possivelmente um modelo de evolução paralela do tumor primário e de metástases. Estudos anteriores demonstraram que o estado de mutação da CTC nem sempre reflectem de que a metástase correspondente [31]; portanto, a comparação do

KRAS

estado de mutação do tumor primário, metástases correspondentes e serial amostras de sangue CTC-enriquecido pode lançar luz sobre a origem das metástases.

Embora as condições e a taxa de conversão genótipo não são bem compreendidos, o estudo sugere que CTC de estado de mutação diferente podem surgir durante o tratamento no mesmo paciente (doentes # 1 e # 15). Com efeito, pode-se supor que o tratamento, com ou sem agentes segmentados, por eliminação de alguns clones sensíveis à quimioterapia pode permitir o surgimento de outros clones de baixa frequência que diferem das células tumorais predominantes no que diz respeito ao estado de mutação. Esta hipótese é fortemente sugerido pela presença de

KRAS

mutações em CTCs de dois dos 12 pacientes com

KRAS

tumores primários tipo selvagem que foram tratados com regimes incorporando panitumumab ou bevacizumab (pacientes # 15 e # 16). No entanto, a incapacidade de detectar mutações nas amostras CTC enriquecidas pode também ser atribuída à baixa frequência dos CTC com mutações, bem como a limitações metodológicos; o FDA aprovou CellSearch epitelial Kit Cell, que é relatado para ser inferior a CellSearch epitelial kit celular perfil em termos de caracterização molecular CTCs “[32]. No entanto, tem sido demonstrado que CTC capturados com o Kit de Célula Epitelial CellSearch pode ser analisada com sucesso por metodologias de sequenciação da próxima geração [33]. Além disso, uma subpopulação de CTC não poderia ser detectado por CellSearch devido à expressão insuficiente de EpCAM e /ou Citoqueratinas; no entanto, um estudo recente no SCLC demonstrou que CTCs, expressando EpCAM, capturado com sistema de CellSearch podem formar tumores em ratinhos imunocomprometidos [34].

Estudos anteriores utilizaram diferentes metodologias, a fim de isolar e caracterizar molecularmente o CTCs. Na mama e câncer de próstata metastático, perfil genômico de CTCs isolados por enriquecimento imunomagn�ica e fluorescência activado separação de células revelou novas alterações genômicas que ocorrem durante a progressão da doença [35], [36]. Usando um dispositivo de captura de CTC microfluídico, a

TMPRSS2-ERG

fusão, o TKI sensibilizar

EGFR

mutações ativadoras e

EGFR

T790M TKI resistência mutação foram detectados em CTCs de pacientes com câncer de próstata e doença metastática do câncer de pulmão, respectivamente, enquanto as mutações do

AR

,

KRAS Comprar e

BRAF

genes foram identificados em amostras CTC-enriquecidas isoladas de próstata e pacientes com CCRm, respectivamente, utilizando o kit de perfil CellSearch [24], [37], [38], [39]. Genotipagem de CTCs individuais isolados pelo CellSearch ou o sistema IsoFlux em pacientes com mCRC confirmaram uma heterogeneidade paciente intra e inter baseado no

PIK3CA

e

KRAS

estado de mutação [22], [ ,,,0],31]; Além disso, diferentes alterações genéticas em CTCs individuais já foram relatados em pacientes com câncer de mama e câncer de esôfago [23], [40].

Os relatórios anteriores sugeriram uma ligação entre a presença de CTCs e do DNA livre de células (cfDNA ) no soro ou plasma de pacientes com cancro [41].

KRAS

mutações detectadas no soro de pacientes com mCRC têm sido propostas para monitorizar a resposta ao tratamento antes do aparecimento clínico da progressão da doença enquanto que nos doentes com NSCLC, foi relatado uma sensibilidade maior para a detecção de mutações de EGFR em cfDNA do que na CTC [7], [8], [42]. No entanto, a origem de cfDNA não é bem compreendido, uma vez que pode ser derivada a partir de células tumorais apoptóticas, apoptóticas leucócitos produzidas pela terapia citotóxica, assim como por exossomas ou CTC libertados a partir de células tumorais no sangue. Embora o isolamento e análise de cfDNA é mais simples e mais reprodutível do que o isolamento e a genotipagem CTC, a caracterização molecular dos CTC além de ser útil para o insucesso do tratamento a monitorização ou a recidiva da doença também pode fornecer informação para orientar a escolha do tratamento óptimo e /ou desenvolvimento de novos terapias.

em conclusão, os dados apresentados descrevem uma metodologia simples, baseada na utilização diária da plataforma CellSearch para a identificação de

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estado mutacional de CTCs de pacientes com câncer colorretal metastático e fornecer uma justificação para considerar re-avaliação da

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estado mutacional em CTCs, a fim de prever melhor resposta à terapia anti-EGFR.