Abstract

Tumor micromilieu muitas vezes mostra acidose pronunciada forçando células de adaptar o seu fenótipo direção tumorigênese reforçada induzida pela sinalização celular alterada e regulação da transcrição. Nos mecanismos estudo apresenta e as consequências potenciais do crosstalk entre pH extra e intracelular (pH

e, pH

i) e activadas por mitogénio-proteína-cinases (ERK1 /2, p38) foi analisada. Os dados foram obtidos, principalmente, em R-3327 células de carcinoma da próstata AT1, mas o princípio importância foi confirmada em 5 outros tipos de células. acidose extracelular conduz a uma diminuição rápida e sustentada de pH

i em paralelo à fosforilação de p38 em todos os tipos de células e para ERK1 2 fosforilação /3 em 6 de tipos de células. Além disso, a fosforilação da p38 foi induzida pela única acidose láctica intracelular a pH normal,

E. A inibição da fosforilação de ERK1 2 /durante a acidose levou à morte celular por necrose. Não se obteve qualquer evidências para o envolvimento das cinases c-SRC, PKC, PKA, EGFR ou PI3K nem alterações em volume da célula na activação de MAPK induzida por acidose. No entanto, nossos dados revelam que a acidose aumenta a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS), provavelmente originários da mitocôndria, que posteriormente desencadear MAPK fosforilação. Eliminadora de ROS impediu a fosforilação da MAPK induzida por acidose enquanto que a adição de H

2O

2 reforçada ela. Finalmente, acidose aumentou a fosforilação de CREB o factor de transcrição através de p38, levando ao aumento da actividade de transcrição de um repórter CRE-mesmo 24 horas após a interrupção, as células de volta para um meio ambiente normal. Assim, um microambiente do tumor ácida pode induzir uma mudança mais duradoura p38-CREB-medited no programa de transcrição, que pode manter o fenótipo alterado mesmo quando as células deixar o ambiente do tumor

Citation:. Riemann A, B Schneider , Ihling A, Nowak H, Sauvant C, thews S, et al. (2011) ácidas ambiente conduzem à ROS-Induced MAPK sinalização em células cancerosas. PLoS ONE 6 (7): e22445. doi: 10.1371 /journal.pone.0022445

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de abril de 2011; Aceito: 21 de junho de 2011; Publicação: 26 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Riemann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Deutsche Krebshilfe (Grants 106774/106906), o BMBF (ProNet-T3 Ta-04) eo programa de Wilhelm-Roux da Faculdade de Medicina, Universität Halle-Wittenberg. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Dois microambientes podem ser distinguidas com respeito a tumores sólidos: (i) o ambiente de tecido no qual as células tumorais residir (ambiente de tecido patológica) e (ii) o ambiente local criadas pelas células tumorais (microambiente tumoral) , que pode gerar um ambiente de tecido patológico para as células vizinhas. O ambiente de tecido patológico apoia a promoção tumoral e o microambiente tumoral suporta a progressão tumoral [1] – [4]. Microambiente tumoral é caracterizada pela deficiência de oxigénio (hipoxia), como consequência de anomalias estruturais e funcionais da rede vascular [5], que conduz a perfusão inadequada do tumor sólido [5], [6]. A fim de manter as células de tumor da procura de energia mudar seu metabolismo para a glicólise, resultando em aumento de consumo de glucose e produção de ácido láctico pronunciado. Este fenómeno pode ocorrer mesmo nos tumores quando o fornecimento de oxigénio seja suficiente – conhecido como o efeito de Warburg. Recentemente, foram apresentadas provas demonstrando que a expressão da isoforma de splicing cinase piruvato é necessário para o metabolismo alterado que fornece uma vantagem selectiva para células tumorais [7]. Juntos, esses recursos formam uma rede complexa e criar um microambiente metabólica, que consiste em hipóxia, glicose baixa, altas concentrações de lactato e acidose extracelular. valores de pH nos tumores sólidos está na gama de 6,5 a 6.8 [6]. Este ambiente ácido é de importação para a promoção e progressão do tumor.

É bem conhecido que o comportamento de células de tumor impactos microambiente metabólico. Por exemplo, a eficácia da terapia de radiação, terapia fotodinâmica e agentes quimioterapêuticos é prejudicada pelo ambiente do tumor [8], [9]. Crescimento e características de migração, bem como a sensibilidade apoptose pode ser influenciado também. Assim, o fenótipo de células de tumor – e, portanto, do próprio tumor – depende, para além da determinação genética, no microambiente metabólico. A “semente e solo” -hypothesis mesmo postula que após a aquisição de todas as necessárias alterações genéticas cancerosas apenas a formação do microambiente do tumor permite que as células tumorais a crescer [10].

Para uma compreensão detalhada mecanicista é importante desmontar este microambiente e determinar os efeitos dos diferentes parâmetros individualmente, a fim de avaliar a sua contribuição. Considerando que existe ampla literatura na hipoxia, a importância da acidose metabólica é menos bem investigado. Recentemente, nós mostramos que a acidose metabólica, por si só aumenta chemoresistance nas células tumorais da próstata sob normóxica e condições normoglicêmicos [9], [11], indicando que a acidose é um importante determinante microambiental para alterações no fenótipo tumoral. Esta estimulação induzida por acidose quimiorresistência de P-glicoproteína-dependente depende de MAP quinases, no entanto não está claro como a activação destas quinases por uma redução do pH extracelular ocorre [9]. Pode depender de alterações intracelulares de pH-homeostase e sua regulação, em resposta à acidose extracelular. Além disso, existem várias vias de sinalização candidatos que poderia ligações de pH muda para MAPK de activação, v.g. as cinases de PKA, PKB, PKC, c-Src ou EGFR [12]. Por conseguinte, o objectivo do presente estudo foi examinar (i) o pH da homeostase de células de tumor durante a acidose metabólica do microambiente, (ii) os mecanismos de ERK1 /2 e p38 fosforilação sob estas condições e (iii) a relação possível entre estes dois processos, bem como as consequências de afectar estas vias.

Materiais e Métodos

cultura celular

foi utilizado o AT1 sublinha do 3327 R-carcinoma da próstata de ratos Dunning tal como descrito antes [9]. As células foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) a 37 ° C e sob uma atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera e sub cultivadas duas vezes por semana. células LS513 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA; CRL-2134) foram cultivadas sob as mesmas condições que as células AT1. células OK (células epiteliais normais do túbulo renal proximal do rim opossum) [13] e as células NCI-H358 (carcinoma broncoalveolar humano; American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA; CRL-5807) foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de FCS, as células MDCK-C7 (células do dueto de recolha epiteliais renais normais do canino) [14] em meio MEM suplementado com FCS 10% e células CHO (imortalizada células de ovário de hamster chinês) [15], em Ham F-12 meio suplementado com 10% de FCS. Para todas as experiências, as células foram cultivadas em placas de Petri (Western Blot) ou lamelas (medição de pH

i) e transferido para meio sem suplementação adicional de FCS durante 24 horas. As células de controlo foram expostas a bicarbonato-Ringer tamponada com HEPES solução ajustada a pH 7,4. acidose intracelular foi induzida substituindo 40 mM de NaCl em 40 mM de ácido láctico e de redução de cloreto substituindo completamente NaCl por gluconato de sódio (cloreto de residual de 7,4 mm). acidose extracelular (pH 6,6) foi aplicado utilizando bicarbonato de-MES (ácido morpholinoethanesulfonic) tamponada solução de Ringer ajuste do pH para 6,6. A capacidade tampão (β) é de 5,9 mmol /lxΔpH para o bicarbonato de-tampão HEPES solução de Ringer, pH 7,4 e 3,9 mmol /lxΔpH para o bicarbonato de-MES tamponada solução de Ringer.

Instalação experimental

após a depleção de soro durante 24 h, as células foram incubadas com um dos tampões acima mencionados (1 mL) durante até 3 h. Todos os inibidores ou activadores utilizados foram adicionados durante este período de incubação.

citosólico pH

citosólico pH de células isoladas foi determinada utilizando o BCECF sensível ao pH do corante (2 ‘, 7’-bis- ( 2-carboxietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein, éster de acetoximetilo, Invitrogen, Paisley, Reino Unido), tal como descrito antes [16], [17]. Em resumo, as células foram incubadas com solução de Ringer contendo 5 uM de BCECF-AM durante 15 min. Em seguida, as lamelas foram lavadas 2 vezes com solução de superfusão para remover o excesso de corante e transferido para a fase de um invertido Axiovert 100 de TV microscópio (Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Os comprimentos de onda de excitação foi de 450 nm /490 nm, a luz emitida foi medida através de um filtro de passagem de banda-(515-565 nm). A taxa de aquisição de dados foi uma relação de intensidade de fluorescência a cada 10 s. Depois de subtração de fundo, os rácios de intensidade de fluorescência foram calculados. calibração de pH foi realizada após cada experiência pela nigericina (Sigma, St. Louis, EUA), técnica [18], [19] utilizando uma calibração de dois pontos (pH 6,8 e 7,5). As soluções de calibração continha KCl 132 mM e CaCl 1 mM

2, MgCl 1 mM

2, HEPES 10 mM e 10 mM nigericina.

do volume celular

O efeito de acidose em volume de células foi determinada electronicamente com um contador de células Casy (Innovatis, Reutlingen, Alemanha). Portanto, as células foram incubadas como acima mencionado, individual por tripsinização e o volume celular e a viabilidade foi medida após 10 minutos ou 3 horas nas respectivas soluções de Ringer.

Western blot

Western blotting foi realizado de acordo com protocolos padrão. As células foram submetidas a lise (0,1% de Triton X-100 em PBS, mistura de inibidores de protease, 37 mg /l de ortovanadato de sódio ou de NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,4, 1% de Nonidet P-40, 0,1% de SDS, 1% de desoxicolato de sódio, 0,1% de Triton X-100, EDTA 1 mM, cocktail de inibidores de protease, 184 mg /l de ortovanadato de sódio), proteína de célula determinada por BCA-Methode (BC Ensaio Reagentes de Uptima), separadas por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose . Subsequentemente, as membranas foram incubadas com anticorpos específicos para a ERK1 /2, p38, MKK3 /6; fosfo-ERK1 /2, fosfo-p38, fosfo-MKK3 /6, CREB e fosfo-CREB (1:1000, sinalização celular). O anticorpo primário ligado foi visualizado utilizando anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano e o sistema ECL (Pierce /Thermo Fisher Scientific) com o gerador de imagens ChemiDoc XRS Sistema molecular (Biorad, Munique, Alemanha). A análise quantitativa foi realizada com Quantidade Um software (Biorad).

CRE-SEAP gene repórter ensaio

A transativação foi avaliada pelo repórter sistema de ensaio gene Mercury ™ Pathway Profiling de Clontech Inc. usando alcalina secretora fosfatase (SEAP), sob o controlo de elementos definidos cis-regulação da resposta (CRE) como repórter, essencialmente como descrito anteriormente [20], [21]. Em resumo, as células foram transfectadas com construções de um pcre-SEAP ou vectores vazios. SEAP-actividade no meio foi determinada com o Sistema AttoPhos® da Promega (Mannheim, Alemanha) e normalizados para a transfecção de controlo (ß-galactosidase).

libertação de LDH

A actividade de LDH nos meios de comunicação e em lisados ​​celulares foi medida usando o protocolo padrão [22] adaptada à menor escala (200 mL) em um leitor de vários poços (Infinito, Tecan, Berlim).

Caspase-3-atividade

células Lavaram-se uma vez com tampão PBS (4 ° C) e incubadas com 100 ul de tampão de lise celular (Tris 10 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 0,01% de Triton X-100, pH 7,5) durante 10 min em gelo, colhidas, e centrifugada a 16000g durante 10 min a 4 ° C. 60 ul do sobrenadante foi incubado com 65 ul de tampão de reacção (PIPES 20 mM, EDTA 4 mM, 0,2% CHAPS, 10 mM DTT, pH 7,4) contendo 42 ^ M de DEVD-AFC (concentração final) a 37 ° C, e fluorescência de o produto clivado, 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin (AFC), foi medida a 400 nm de excitação e 505 nm de emissão de comprimentos de onda usando um contador de múltiplas cavidades (Infinito, Tecan, Berlim). Clivado AFC foi quantificado por uma curva de calibração utilizando concentrações conhecidas AFC. O teor de proteína foi determinada com ensaio de ácido bicincon�ico (Interchim, Montluçon, França), utilizando albumina de soro bovino como padrão.

Determinação do pH extracelular, glicose e lactato

pH foi medido com um analisador de gases no sangue (ABL5, Radiometer, Copenhagen, Dinamarca). Para a determinação da concentração de glucose, utilizou-se a glicose (HK) Kit de ensaio a partir de Sigma (G3293) (amostra 2 ou 5 ml, respectivamente, mais de 200 ul kit) de acordo com as instruções do fabricante. O lactato foi determinado utilizando o reagente de lactato (Trinity) de acordo com as instruções do fabricante (amostra de 10 ul mais 100 ul kit). Cada experiência foi realizada pelo menos em triplicado.

formação de ROS

A formação de espécies reactivas de oxigénio (ROS) foi avaliada com o corante fluorescente DCFDA-AM (Molecular Probes, Leiden, Holanda) que reage com um aumento da fluorescência na presença de H

2O

2 uma vez que a ligação éster foi clivada por esterases celulares. As células foram semeadas em placas de 24 poços, placas e incubadas durante 30 minutos com corante após os tratamentos indicados. Subsequentemente, a fluorescência (excitação 485 nm; emissão 535 nm) foi medida utilizando um contador de poços múltiplos (Infinito, Tecan, Berlim, Alemanha). Além disso valores em branco sem células e valores em branco, sem corante foram determinados e subtraídos. O aumento da fluorescência ao longo do valor em branco expressa por mg de proteína foi usada como uma medida para a formação de ROS.

Determinação da actividade mitocondrial

A fim de estimar a actividade mitocondrial, determinou-se a acumulação de rodamina 123 após exposição a pH 7,4 ou pH 6,6. Após a exposição de 3 horas, as células foram incubadas durante 20 min com 0,1 ^ M de rodamina 123 em solução de Ringer HEPES, bem como na presença de 20 uM de CCCP ou 2 uM nigericina [23], [24]. No final, as células foram lisadas com 0,1% de Triton X-100 e a fluorescência celular determinada usando um contador de múltiplas cavidades (Infinito, Tecan, Berlim). absorção de mitocondrial rodamina 123 é evitada na presença de CCCP porque Ψ

m colapsa. Em contraste, a absorção de mitocondrial rodamina 123 é máxima na presença de nigericina, que recolhe o gradiente de pH através da membrana mitocondrial interna. Como consequência toda a energia a partir da cadeia de transporte de electrões é transformado em Ψ

m. Assim, a absorção de rodamina 123, na presença de menos absorção de nigericina de rodamina 123, na presença de CCCP representa uma estimativa grosseira da actividade mitocondrial e elimina quaisquer efeitos não-específicos. A absorção de rodamina 123 foi calibrado com tampão de lise contendo concentrações conhecidas de rodamina 123.

Materiais

Se não for indicado de outra forma, os produtos químicos eram da Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha.

a análise dos dados

Os dados são apresentados como média ± SEM. Para todas as experiências, N é igual ao número de placas de cultura de células ou usados ​​para executar as medições não se citado em contrário. Todas as experiências foram realizadas com, pelo menos, duas passagens. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student desemparelhado ou ANOVA, quando apropriado. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando P . 0,05

Resultados

pH intracelular seguinte acidose extracelular

Fig. 1A mostra o pH intracelular dos diferentes tipos de células. Diminuição do pH extracelular sempre levou a uma diminuição do pH

I, embora o grau desta redução diferiam fortemente entre as linhas de células. Sob condições de controlo (pH 7,4), o pH intracelular foi sempre menor do que no compartimento extracelular. No entanto, sob acidose (pH 6,6), o pH intracelular foi maior na maioria das linhas celulares. Este reverso pH de gradiente foi descrito anteriormente para tumores sólidos

in vivo

[6], que indica que o modelo utilizado no presente estudo se assemelha ao

in vivo

situação de forma adequada. Mesmo que em células CHO e H358 a pH intracelular caiu abaixo do pH extracelular existe indicação para uma extrusão de protões líquido pronunciada. A partir de considerações termodinâmicas em células sem extrusoras de protões (assumindo um potencial de membrana de -40 mV) a pH intracelular seria de aproximadamente 0,65 unidades inferiores em comparação com o pH extracelular. Nas experiências (pH

E 6.6) um pH

i de ~6.0 seria esperado a partir de distribuição passiva. Obviamente, as células CHO e H358 extrudir protões activamente contra o equilíbrio passiva, embora a sua capacidade parece ser um pouco menor do que nas outras linhas de células.

(A) pH

I medido sob condições de controlo (pH 7,4 ) e durante a acidose extracelular (pH 6,6) (n = 3-7). (B) pH de gradiente em células sob controlo AT1 (pH 7,4) e ácida (pH 6,6) As condições para dois pontos de tempo diferentes; círculo: pH

e, quadrado: pH

i

A alteração do pH intracelular segue rapidamente a acidose extracelular e manteve-se estável ao longo de várias horas.. Por exemplo, em células de AT1 pH intracelular (pH

i) rapidamente caiu de pH 7,22 ± 0,08 para 6,75 ± 0,09 pH dentro de 10 minutos (Fig. 1B). Este pH-mudança foi sustentado ao longo de 3 h (Fig. 1B), mas reversível quando se muda de volta para um pH fisiológico

e (para regulação do pH-homeostase em células AT1 ver Fig. S1). O declínio no pH

e durante 3 resultados h de incubação a partir da extensa formação de ácido láctico (efeito Warburg, Fig. S2).

activação de MAPK induzida por acidose em diferentes tipos de células

expondo as células a moderada acidose extracelular conduz a uma activação acentuada de ERK1 /2 e p38 MAP quinases. FIG. 2A mostra a fosforilação de ambas as quinases após incubação de células AT1 durante três horas a um pH de 6,6. Analisando o curso do tempo mostra que a fosforilação já foi observada após 5 min e durou até 3 horas (Fig. 2B). O efeito na activação de p38 foi observada em um amplo espectro de uma variedade de linhas celulares de tumor ou tecidos normais (Fig. 2C). Estes resultados indicam que a fosforilação de p38 por acidose é aumentada em células diferentes, independentemente se derivado de tumor ou tecido normal, apontando para um mecanismo universal de sinalização induzida por stress. Por contraste, a activação de ERK1 /2 induzida por acidose não foi observada em todos os tipos de células investigadas e não estava relacionado com a tumorigenicidade das células (Fig. 2-C), embora o pH intracelular diminuiu em todas as linhas celulares. Assim, mudanças no pH

I parecem não ser um gatilho universal para induzida por acidose ERK1 2 fosforilação /. Para tanto MAPK nenhuma correlação quantitativa entre pH

i ou alterações no pH intracelular e p38 ou ERK1 2 fosforilação /para os diferentes tipos de células foi observada (Fig. S3). Tomados em conjunto, estes resultados levaram à conclusão de que a granel pH intracelular ou alterações no pH

i não são os principais reguladores para ERK1 /2 fosforilação induzida por acidose extracelular, mas servem de gatilho, conforme universal para a fosforilação p38. Uma vez que os mecanismos principais (acidificação intracelular, fosforilação de p38) foram observados em células de outras experiências foram realizadas com este tipo particular de célula AT1.

(A) Western blot típica para a proteína fosforilada e total de ERK1 /2 e p38 na AT1 células após um período de incubação de 3 h em qualquer pH 7,4 ou pH 6,6. (B) curso Tempo de ERK1 /2 e p38 fosforilação induzida por acidose em células AT1. Os valores são a proteína fosforilada divididas pela proteína total, 180 min-Ringer HEPES pH 7,4 é definida como 100%. (N = 3-10). (C) Impacto das condições ácidas sobre ERK1 /2 e a fosforilação da p38 apresentados como% do controlo (pH 7,4) em várias linhas celulares. (N = 5-12); (*) P . 0,05

Efeito da acidose na viabilidade celular

A fim de avaliar diferentes mecanismos de morte celular o teor de proteína por prato (viabilidade celular geral), indução de apoptose (actividade da caspase-3) e necrose (LDH de libertação) foram analisados. Acidose por si só provocou nenhuma alteração significativa na sobrevivência de células (Fig. 3). No entanto, a morte celular por necrose, quando a via de ERK /2 foi inibida aumentaram significativamente, conduzindo a uma perda de células. atividade da caspase-3 não foi afetado, sugerindo que não houve alteração da taxa de apoptose. A inibição da via da p38 foi virtualmente sem efeito. Estes dados indicam que a induzida por acidose ERK1 /2 fosforilação activa um programa de resgate de prevenção de morte celular por necrose. Actualmente, o conjunto completo de experiências nesta série única foi realizado em células de AT1. Por este motivo, permanece em aberto se os passos de ERK1 2 activação induzida por acidose /seguido de necrose toma lugar em todas as linhas de células como um mecanismo geral. Uma vez que algumas linhas celulares não mostram uma activação de ERK1 /2 por acidose (Fig. 2C), pode ser possível que a ERK1 /2-dependência da viabilidade das células é de pelo menos quantitativamente diferente entre diferentes linhas celulares. Aqui, são necessários novos experimentos.

(A) teor de proteína celular, (B) caspase-3-atividade (apoptose) e (C) LDH-release (necrose) de células AT1 após 3 h de incubação em diferentes pH, com ou sem inibidores de ERK1 /2 (U0126) ou p38 via (SB203580) (n = 12-18); (*) P . 0,05

acidificação intracelular e fosforilação p38

O impacto da acidificação intracelular durante a inibição do transporte de bicarbonato de DIDS e /ou carga adicional com lactato na ativação MAPK foi estudou. A um pH extracelular normal, (7.4), quer isolado inibição de transporte de bicarbonato (200 uM DIDS) ou a incubação das células com lactato (40 mM) resultou em uma acidificação bastante fraca em 0,1 unidades de pH (Fig. 4a). No entanto, a combinação de ambos os tratamentos, o pH diminuiu acentuadamente em 0,3 unidades. Analisando a activação de MAPK sob estas condições mostraram que o único inibição do transporte de bicarbonato por DIDS ou exposição de AT1 células em lactato a pH extracelular fisiológico não foi suficiente para alterar p38 ou ERK1 2 fosforilação /(Fig. 4B), mais provavelmente porque pH

i recupera-se muito rapidamente na presença de lactato extracelular (Fig. S1B). A adição simultânea de lactato e DIDS resultou em aumento significativamente a fosforilação da p38 (Fig. 4B). Estes dados suportam a hipótese de que alterações em massa no pH intracelular mediar o efeito estimulador da acidose extracelular de p38 mas não em ERK1 /2. ERK1 /2 fosforilação é estimulado por um pH extracelular reduzido, mas não pela redução do pH intracelular (Fig. 4B).

(A) Os efeitos a longo prazo (3 h) de exposição à DIDS (200 um) e /ou adição de 40 mM de lactato (N = 14-56) sobre o pH

i. pH-alterações são comparadas com as condições de controle (pH 7,4) (*) p 0,05. (B) Proporção de /MAPK fosforilada proteína total em% do controlo (pH 7,4); N = 3-7 para pERK; N = 4-9 por fosfo-p38; (*) P . 0,05

induzida por acidose ERK1 /2 e p38 fosforilação é independente da atividade da fosfatase, mas depende de MAPK quinases MEK1 /2 e MKK3 /6, respectivamente

Desde aumento da fosforilação poderia ser o resultado do aumento da atividade da quinase ou da taxa de fosfatase reduziu o impacto da inibição de fosfatase na ativação de MAPK induzida por acidose foi estudada. Quando tirosina ou treonina /serina-fosfatases foram inibidas usando ortovanadato (100 uM) ou ácido ocadaic (100 nM) o efeito da acidose extracelular de ERK1 /2 e p38 fosforilação foi aditiva (Fig. S4). Em todas as experiências pp38 sem inibidores de fosfatase foi induzida pelo factor de 3-4 (Fig. S4 e S5) comparável à encontrada na série experimental anterior (Fig. 2C). Assim, é improvável que o efeito de acidose é mediada por alterações da actividade de fosfatase. Um passo chave na activação de ERK1 2 /é a quinase a montante MEK1 /2, que integra a maior parte das vias de sinalização que convergem para ERK1 /2 [12]. Quando MEK1 /2 foi inibida por 10 uM U0126, fosforilação basal de ERK1 /2 foi substancialmente reduzida e o efeito de acidose foi revogada (Fig. S5). U0126 impedido ERK1 /2 fosforilação induzida por acidose mesmo na presença dos dois inibidores da fosfatase e ortovanadato de ácido ocadaic, indicando que MEK1 /2 é essencial para o efeito observado. activação de p38 não foi inibida por U0126 (Fig. S5), mas durante 3 h acidose (pH 6,6) a quinase MKK3 /6, que está a montante da p38, foi fosforilado de forma dependente do pH (Fig. 5). Tomados em conjunto, os nossos dados sugerem que os efeitos induzidos pela acidose em MAPK não dependem de alterações na actividade de fosfatase, enquanto que MEK1 /2 é crucial para ERK1 2 activação /e aumento da fosforilação de p38 é devido ao aumento da actividade da MKK3 /6 sob condições ácidas.

os valores representam a proporção de proteína fosforilada (pp38 ou pERK) dividido pelo total de proteínas (p38, ERK). Estes valores foram então normalizados para a proporção de experiências de controlo, a pH 7,4. (*) P 0,05 em relação ao pH 7,4. (N = 4).

activação de MAPK induzida por acidose não depende de EGFR, PKC, PKA, PI3K ou cinases da família Src

Para desvendar as possíveis vias de sinalização que leva de extracelular acidose para uma activação de ERK1 /2 e p38, vários alvos promissores foram analisados, bloqueando-os com inibidores específicos. O papel do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), a proteína quinase C (PKC), a proteína quinase A (PKA), fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) e a família Src de tirosina-quinases foi estudada utilizando AG1478, bisindolilmaleimida I (BIM), R-isómero, LY294002 e PP2, respectivamente. Todas estas cinases podem desempenhar um papel importante na promoção e progressão do tumor. No entanto, nenhum dos inibidores mostraram um efeito significativo sobre a ERK1 /2 ou p38 induzida por activação acidose como representado nas Figs. S6 e S7, embora foram utilizadas concentrações máximas.

Camp tem um potencial impacto duplo na MAPK sinalização [12], [25]. A activação de PKA por cAMP pode conduzir à inibição de MEK1 /2 e /ou Raf-1 (C-Raf). No entanto, a activação da EPAC por cAMP activa B-Raf através Rap1. Aplicação da membrana permeável análogo dibutiril-AMPc (db-cAMP, cAMP-clamp)

per se

levou a uma redução da ERK1 /2, mas não a fosforilação da p38 (Fig. S7). Além disso, o efeito da acidose extracelular foi completamente abolida. Estimulação da formação de AMPc endógeno por forscolina (activador da adenilato-ciclase de) causou um efeito similar como db-cAMP (Fig. S7). Assim, ERK1 /2, mas não a sinalização de cAMP é a p38-sensível e o efeito é provavelmente mediada por PKA, possivelmente através da inibição do C-Raf.

OGR1 não é crucial para a fosforilação da MAPK em um microambiente acídico

de forma a elucidar o mecanismo de detecção de pH para a activação de MAPK ainda mais o papel de receptores acoplados à proteína, capaz de sentir protões extracelular /pH, tem sido estudada. Destes, o receptor de G-cancro do ovário acoplado à proteína 1 (OGR1) foi mostrado para activar a via da MAPK [26]. Não há inibidores específicos para OGR1 disponíveis, mas foi demonstrado que a activação induzida por protões de ERK1 /2 por OGR1 seja cancelada por concentrações de iões de cobre uM. Embora esta não é a inibição específica que pode ser utilizada para falsificar a hipótese de envolvimento OGR1. Na presença de 10 uM de CuCl

2 um aumento da ERK1 /2 e p38 de fosforilação foi observado que foi adicionalmente reforçada pela acidose extracelular (Fig. S8A). Assim, OGR1 provavelmente não mediar o efeito da acidose extracelular sobre a sinalização MAPK

Um papel para o Na

+ /K

+ -.? ATPase na ERK1 2 a ativação induzida por acidose /

Outro mecanismo possível para pH “sensing” seria o de na

+ /K

+ – ATPase, uma enzima que é inibida por acidose e podem induzir a activação de MAPK, quer através de alterações na homeostase celular ou electrólito por via de sinalização do EGFR [27], [28]. FIG. S8 mostra que a inibição induzida por acidose da Na

+ /K

+ – ATPase pode contribuir para ERK1 fosforilação 2 /em células de AT1. No entanto, uma vez que as mudanças de volume de células que fazem parte da cascata de sinalização [29] eram bastante heterogêneo para as diferentes linhas celulares, argumentando contra um papel decisivo para induzida por acidose ERK1 2 fosforilação /.

Impacto das ROS na induzida por acidose activação MAPK

Desde espécies reactivas de oxigénio (ROS) pode atuar como uma molécula de sinalização intracelular [30], nós analisamos se ROS mudanças de produção durante a acidose extracelular. Expondo as células a acidose extracelular formação de ROS induzidas (Fig. 6A). A fim de distinguir entre o impacto das células de acidificação extra e intracelulares foram adicionalmente incubadas com lactato e DIDS a pH extracelular normal, em que a combinação de ambas as substâncias teve o maior impacto no pH intracelular (Fig. 4A) e provocou um aumento significativo nas formação de ROS (Fig. 6B). Eliminadora de ROS com tiron reduziu o nível de ROS sob condição de controlo (pH 7,4), bem como durante a acidose (Figs. 6A e B). DPI (cloreto de diphenyleneiodonium), um inibidor da flavoproteínas, tais como sintase ou NADPH oxidase, não reduzir a formação de ROS.

(A) a formação de ROS durante a acidose extracelular com aplicação dos catadores ROS tiron, DPI ou rotenona (N = 9-12). formação de (A) ROS (medido por fluorescência de DCF-DA) durante a acidose intracelular (induzida pela lactato + DIDS; ver Fig. 4A), com aplicação das captadores de ERO tiron, DPI ou rotenona (N = 3). (C) a actividade mitocondrial Relativa (medida pela rodamina 123 acumulação) em condições de controlo (pH 7,4) e durante a acidose extracelular (pH 6,6); N = 12. (*) p . 0,05

Na presença de rotenona, um inibidor da mitocondrial complexo I, a formação de ROS foi reforçada nos termos ácida, mas não sob condições de controle (Figuras 6A e B. ), ou seja, acidose estimula a formação de ROS induzidas por rotenona. Estes resultados foram confirmados utilizando a sonda de fluorescência específica MitoSox-mitocôndria. Com este mitocondrial sonda formação de ROS aumentada, na presença de rotenona a 236 ± 44%, a pH 7,4, mas a 903 ± 219% a pH 6,6 (n = 6; p 0,05), confirmando um forte impacto do pH ácido na produção de ROS em mitocôndrias . Estes dados excluem transporte de electrões mitocondrial inversa como uma fonte de ROS, mas é indicativo de um aumento do NADH /NAD

+ rácio como gatilho [31]. Complexo I produz o anião superóxido na presença de NADH e esta geração é reforçada por rotenona e ΔpH através da membrana mitocondrial. Uma activação bruto da actividade mitocondrial não pôde ser detectada (Fig. 6C).

incubação das células com H

2O

2, uma molécula de ROS relativamente estável, levou a uma dose de activação dependente preferencialmente a MAP-cinase p38 (Fig. 7B). ERK1 /2 fosforilação também foi aumentada. A incubação das células com tiron que é capaz de reduzir significativamente a formação de ROS (Fig. 6A e B) inibiu ambas p38 e ERK1 2 activação /(Figs. 7A e B), que mostra que a formação de ROS é a montante da fosforilação da MAPK.