Abstract
Fundo
A base biológica para o câncer de desconhecido primário (CUP), a nível molecular permanece largamente desconhecido, com nenhuma evidência de existência de uma entidade biológica comum. Aqui, nós avaliamos a possibilidade de identificar um biomarcador de diagnóstico comum para CUP utilizando uma análise de microarray expressão do gene.
Métodos
amostras de ARNm de tumor de 60 pacientes com CUP foram analisados usando o Affymetrix U133A mais 2,0 GeneChip e foram normalizadas por asinh (hiperbólica arco seno) transformação para construir um perfil de expressão genética média específico para CUP. Um perfil de expressão genética específica ao grupo não-CUP foi construído usando publicamente disponíveis conjuntos de dados de microarranjos matérias. Os testes t foram realizados para comparar a taça com grupos não-copo e os Top 59 genes específicos copo com a maior variação vezes foram selecionados (
p
-VALOR 0,001).
Resultados
Entre os 44 genes que foram up-regulamentada do grupo CUP, foram identificados 6 genes para proteínas ribossomais. Dois destes genes (
RPS7
e
RPL11
) são conhecidos por estar envolvidos na via de proteínas MDM2-p53. Nós também identificamos vários genes relacionados a metástases e apoptose, sugerindo um atributo biológico da CUP.
Conclusões
Os produtos de proteína do up-regulamentada e regulada genes identificados neste estudo pode ser clinicamente útil como biomarcadores originais para xícara de
Citation:. Kurahashi I, Fujita Y, Arao T, Kurata T, Koh Y, Sakai K, et al. (2013) Análise de Expressão Gênica A Microarray-base para identificar diagnóstico Biomarkers para o cancro primário desconhecido. PLoS ONE 8 (5): e63249. doi: 10.1371 /journal.pone.0063249
editor: Ming Tat Ling, Universidade de Tecnologia de Queensland, Austrália |
Recebido: 27 de novembro de 2012; Aceito: 01 de abril de 2013; Publicado em: 09 de maio de 2013
Direitos de autor: © 2013 Kurahashi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo auxílio grant-in-de Investigação Científica do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
os pacientes com câncer de origem desconhecida (CUP) apresentam com doença metastática para o qual o principal local não pode ser encontrado, apesar de extensa investigação padrão. O prognóstico dos pacientes com CUP é geralmente pobre para aqueles que recebem tratamentos empíricos. O período médio de sobrevivência é de 3-9 meses, mesmo quando os regimes de tratamento mais recentes combinação são administrados [1] – [5]. A sobrevida de pacientes com CUP pode ser melhorada se o site principal pode ser identificado e uma terapia específica do local pode ser aplicada [6], [7].
Clinicamente, copos apresentam características comuns, como a rápida progressão , a divulgação precoce e um tumor primário em silêncio, com sinais e sintomas relacionados com o local metastático (s) [8]. O tumor primário pode tanto ter um padrão de crescimento lento ou pode tornar-se involuído e indetectável. Existência de tais propriedades comuns nos leva a supor que pode haver potenciais marcadores biológicos que elucidam CUP como um todo. Análise da expressão de genes é um dos meios pelos quais a identificação de genes característicos para o copo.
Vários estudos utilizando microarrays de expressão de genes têm demonstrado que os níveis de milhares de genes de expressão pode ser utilizado como uma “impressão digital molecular” para classificar uma multiplicidade de tipos de tumor [9] – [15]. Estamos presentemente envolvidos num estudo clínico multicêntrico para prever o local primário de CUP com base na análise de padrões de expressão de genes. A análise interpreta a expressão de genes ~22,000 em cada amostra por aplicação de normalização e de classificação algoritmos de dados a expressão do gene a partir de um micro-arranjo. A semelhança de padrão de expressão do gene de cada espécime de tumor é então comparado com os padrões para os tumores a partir de 24 locais primários conhecidos abrangidas pelo exame. Este estudo possibilitou a identificação de genes que exibiram um padrão de expressão única em CUP. Aqui, apresentamos vários genes que codificam proteínas de metástase e relacionadas com a apoptose assim identificados que podem biologicamente caracterizam CUP.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
Todos os pacientes desde escrita consentimento informado. aprovação do estudo foi obtido a partir de comitês de ética independentes da Universidade de Kinki, Shizuoka Cancer Center, Hyogo Cancer Center, Osaka City Hospital Geral, Universidade de Chiba, Cancer Center Hospital Nacional Oriente, Universidade de Kobe, Tochigi Cancer Center, Saitama Universidade de Medicina da Universidade Tohoku, e Câncer Hospital Institute. O estudo foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsinki.
Design Estudo
Este estudo originou multicêntrico actualmente em curso, randomizado, fase 2 estudo prospectivo para o tratamento da CUP não tratada com base na previsão das o principal site usando dados de um chip de DNA. Os pacientes foram diagnosticados como tendo CUP entre novembro de 2008 e novembro de 2010 em um dos 13 centros do Japão Oncology Group Oeste (WJOG), uma organização sem fins lucrativos japonês para a realização de ensaios clínicos oncológicos. As análises laboratoriais foram realizadas em 2 centros no Japão (Universidade Kinki, Osaka-Sayama e Mitsubishi Chemical Medience Corporation, Tokyo).
Os pacientes
Todos os pacientes elegíveis tinham sido submetidos a uma investigação padrão para CUP. Eles foram divididos em subgrupos desfavoráveis da CUP. foram autorizados diagnósticos de histologicamente ou adenocarcinoma citologia confirmou, carcinoma pouco diferenciado, ou carcinoma de células escamosas. Em cada um dos pacientes, um site principal não tinha sido identificado, após uma história completa, exame físico, perfil bioquímico, tomografia computadorizada (TC) do tórax, abdome e pelve, mamografia em mulheres, as medições da próstata-específicas antigénio (PSA) em homens, e um processamento dirigido de quaisquer áreas sintomáticos. Pacientes nas seguintes categorias foram excluídas: as mulheres com adenocarcinoma envolvendo apenas os linfonodos axilares ou na cavidade peritoneal, pacientes com carcinoma de células escamosas envolvendo apenas gânglios linfáticos cervicais ou linfonodos inguinais, pacientes com carcinoma pouco diferenciado consistente com um tumor de células germinativas (isolado estruturas da linha média, múltiplos nódulos pulmonares, ou níveis elevados de β-gonadotrofina coriônica ou gonadotrofina coriônica-fetoproteína α-humano), homens com um nível de PSA no plasma elevado ou coloração PSA-positivo em um tumor, pacientes com um único, pequeno, potencialmente tumor ressecável, e os pacientes com carcinomas neuroendócrinos.
Coleta de amostras
amostras congeladas frescos obtidos de 60 pacientes com CUP foram utilizados para a análise. Todas as amostras foram testadas sem conhecimento quer as características clínicas ou a resposta a um tratamento subsequente, com excepção para o sexo do paciente e o local da biópsia (principalmente os gânglios linfáticos ou fluido de ascites).
Procedimento do Ensaio
o ARN foi extraído das amostras usando um kit isogene (Nippon Gene, Toyama, Japão). Espectrofotometria foi utilizada para avaliar se uma concentração de ARN total e a pureza adequada estava presente. Em geral, o protocolo para o processamento do ARN, a amplificação e rotulagem fragmentos, material de hibridar no microarray, e digitalização foi semelhante ao protocolo Affymetrix padrão para análise de expressão GeneChip®. Affymetrix GeneChip® Human Genome U133 Além disso 2.0 foi usado em um instrumento Affymetrix 3000 ou 3000Dx GeneChip (estação fluídica e scanner) executando Gene-Chip software operacional para gerar dados de expressão de genes (arquivos .CEL).
Apresentação Banco de dados de microarray dados
o microarray dados foram depositados no banco de dados Omnibus Gene Expression (GEO): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/. O número de acesso GEO para a plataforma é GSE42392, amostras GSM1038716-GSM 1038775.
Análise de Dados
Todos os dados de microarranjos foram normalizados utilizando asinh transformação (hiperbólica arco seno), que é uma versão modificada da normalização de Huber com estabilização de variância [16], [17], e também uma parte da transformação log generalizada (glog) [18]. preconceitos interinstitucionais e gama-a-matriz foram corrigidos subtraindo os seus efeitos específicos que foram estimadas pelo modelo misto [19]. A equação para a transformação asinh é IGK /I.k, onde i representa o valor da expressão, G representa o gene, o símbolo k representa a matriz, e o ponto indica a média. Os valores transformados-ASINH resultantes, que representam a expressão relativa de cada gene, foram utilizados em análises posteriores.
Os conjuntos de dados de microarray em bruto para 2,364 cancros de vários tipos primários e 10 nódulos linfáticos normais foram obtidas a partir da expressão do gene Omnibus (GEO) (Tabela 1). Estes conjuntos de dados foram normalizados e utilizados para construir perfis de expressão genética específicos para cada tipo de cancro (n = 24) bem como um perfil geral para o cancro com primário conhecida (CKP). O conjunto de dados normal do linfonodo foi usado como uma referência. A qualidade dos dados de amostras taça foi monitorada para assegurar que a análise de dados de amostras taça foi comparável ao das amostras de CKP recolhidos a partir de GEO. Apenas as amostras cuja GAPDH, um gene de controlo de arrumação, no 5′-terminal de região (AFFX-HUMGAPDH /M33197_5_at) mostrou uma expressão mínima 500, e com a proporção da intensidade de expressão (GAPDH na região 3 ‘/5’ região). 3 foram escolhidos
O perfil de expressão genética específica para a Copa foi construído utilizando 30 amostras CUP como dados de treinamento e mais 30 amostras de dados de teste (casos ímpares e pares, respectivamente) . Dos 22,215 genes que foram medidos usando ambas as amostras Cup (este trabalho) e amostras CKP (acesso público), foram selecionados um total de 5.645 genes com um presente convite para cada amostra para análise posterior. Para identificar CUP genes específicos, os perfis de expressão genética específicas para CUP (conjuntos de dados de treinamento) e linfonodo normal foram comparadas pelo teste t. Um histograma da
P
-Valores é mostrado na Figura 1. O
P
-Valores para a maioria dos genes eram menos do que 0,001; quando foram selecionados os 100 melhores genes de acordo com os seus
p
-Valores, a taxa de descoberta de falsas (FDR) foi 4,56 × 10
-12 [20]. Para validar se os genes identificados usando os conjuntos de dados de treinamento CUP foram significativamente específico para CUP, a análise discriminante linear (LDA) utilizando estes genes foi realizada para os conjuntos de dados de teste copo e a precisão foi estimada como descrito [21]. Heatmaps e um dendrograma conjunto foram então construídas pelo método Ward [22].
Resultados
Gene Expression Perfil do copo e conhecidos cânceres primários
Um total de 237 genes foram encontrados para ser regulada para cima ou para baixo-regulado por mais de duas vezes entre o nó de linfa normais e 30 amostras de copo (conjuntos de dados de treinamento). Destes, 59 genes com mais do que uma alteração de 2,5 vezes (44 regulada para cima e 15 genes regulados negativamente) estão listados na Tabela 2. Nós designado os conjuntos de genes constituídos por estes genes CUP associada com 2 vezes e 2.5 dobrar-regulação ou a regulação negativa como M
CUP (2.0) e M
CUP (2,5), respectivamente. Usando esses conjuntos de sondas em M
CUP (2,5), análise discriminante linear (LDA) foi realizada para os conjuntos de dados de treinamento CUP juntamente com 2.364 cânceres de vários tipos conhecidos e 10 linfonodos normais. Como esperado, todas as amostras foram correctamente 2,404 discriminados. Quando as 30 amostras de copo permanecendo (conjuntos de dados de teste) foram avaliados utilizando LDA que foi modelado com os conjuntos de dados de treinamento, 26 out das amostras 30 Taça foram atribuídas corretamente para “Cup”, ao passo que apenas os 4 amostras foram previstos como “o outro câncer” . Assim, a precisão da CUP foi validado para ser 86,7%, indicando que os 59 genes selecionados eram de significância estatística como tendo atributos biológicos da CUP.
A Figura 2 mostra o agrupamento supervisionado de todas as amostras 60 CUP realizada em conjunto com 2.364 cânceres de vários tipos conhecidos e 10 nós normais linfáticos utilizando os 59 genes. As amostras CUP foram divididos em 2 grupos com adenocarcinoma de pulmão (ALC) agrupados no meio (direito mais parte do mapa de calor). O grupo maior consistiu em 42 amostras, enquanto que o menor consistiu em 15 amostras. Apenas três amostras copo não foram incluídos em qualquer um destes grupos e, em vez foram incluídas nos agrupamentos de linfoma normal, tumores cerebrais, cancro do ovário e, respectivamente. Estes estavam entre as 4 amostras que foram previstos como “o outro câncer” na LDA. O
vapA
gene, que foi sobre-expresso na maioria das amostras de câncer, mas não no copo ou LAC, revelou um contraste marcante entre CUP /LAC e outras amostras, o que pode ter influenciado a análise de agrupamento. Quando nós re-analisados os dados após a exclusão do
vapA
gene, o agrupamento para a Copa não foi alterada, mas o grupo menor, com 15 amostras não foi agrupado com o LAC (Figura S1). Os perfis de expressão gênica média (PGEs) para a Copa, linfoma normal, e 24 tipos de câncer conhecidos foram comparados para criar um dendrograma representando as relações quantificadas entre CUP e os tipos de câncer conhecidos, que mais uma vez mostrou o agrupamento de CUP juntamente com LAC (Figura S2 ).
os genes são indicados à direita. A barra colorida acima do heatmap representa os diferentes tipos de câncer, ea chave de legenda é do lado esquerdo. No mapa de calor, vermelho representa genes supra-regulados e verde representa genes regulada para baixo, em relação aos níveis de expressão em linfonodos normais, com a escala apresentada no canto superior esquerdo. O perfil de expressão gênica conjuntos de dados para linfonodos normais e que não CUP 24 tipos de câncer conhecidos foram obtidos a partir de fontes acessíveis ao público, como descrito nos Materiais e Métodos.
Seleção de Genes CUP associadas
Embora as funções foram diversas ou desconhecida para os 44 genes up-regulamentados no M
CUP (2,5) conjuntos de dados (Tabela 2), verificou-se que 14 genes (
S100A4
,
PRG1
,
S100A6
,
GSTP1
,
eIF5A
,
LGALS1
,
S100A11
,
PRKDC
,
VIM
,
CST3
,
TIMP1
,
YWHAZ
,
NEDD8
,
STK17A
) poderia ser caracterizada após uma pesquisa usando as palavras-chave “metástase” e “apoptose”. Alguns destes genes foram associados com a transição epitelial-a-mesenquimal (EMT), uma função que tem sido cada vez mais reconhecida como um passo-chave na metástase do câncer [23].
No M
CUP ( 2.5) conjunto de dados, 15 genes foram regulados negativamente. Destes genes, nós nos concentramos em
CD24
,
KRAS Comprar e
DICER1
. As funções conhecidas das regulado para cima e para baixo-regulamentado genes acima mencionados será discutido em detalhes abaixo.
Expressão relativa de Proteínas Ribossômicas-regulada
No M
CUP (2.5) conjunto de dados, também identificamos 6 proteínas ribossomais (
RPL18A
,
RPS7
,
RPL11
,
RPS10
,
RPL36
,
e RPLP2
). Encontrámos 11 mais genes para proteínas ribossomais (
RPL24
,
RPL35
,
RPL35A
,
RPS20
,
RPL13A
,
RPL28
,
RPS26
,
RPS14
,
RPL27A
,
RPL19
,
e RPL29
) na M
CUP (2,0) dataset. proteínas ribossomais são montados em pequenos e grandes subunidades ribossomais. As pequenas 40 S e grandes subunidades ribossomais 60 S contêm cerca de 32 e 47 proteínas ribossomais (conhecidos como RPS e proteínas RPL), respectivamente [24]. O aumento da expressão de proteínas ribossomais tem sido associado com o aumento da proliferação e crescimento; Em alguns casos, no entanto, a expressão aumentada também tem sido mostrado para suprimir tumorigenese [25], [26].
Para examinar se os genes da proteína ribossómica podem ser utilizados como biomarcadores para discriminar COPO a partir de outros tipos de cancro, a média PGEs para um total de 77 genes de proteínas ribossomais foram comparados usando cluster para a Copa, linfoma normal, e 24 tipos de câncer conhecidos (Figura 3). Os genes de proteínas ribossomais que estavam sobre-regulada na Copa também foram regulados positivamente na ALC.
genes de proteínas ribossomais são indicados à direita. No mapa de calor, roxo representa genes supra-regulados e verde representa genes regulada para baixo, em relação aos níveis de expressão em linfonodos normais, com a escala apresentada no canto superior esquerdo. Os genes que foram exclusivamente sobre-expressos no copo e no adenocarcinoma de pulmão são realçados.
Os níveis de expressão de mRNA relativos de 4 genes de proteína ribossômica que estavam sobre-regulada em CUP (
RPS7
,
RPL11
,
RPS10
, e
RPL36
) foram comparados com os níveis de linfoma normais e 24 tipos de câncer conhecidos (Figura 4). As amostras 42 cálice que consistentemente continham grandes quantidades destes mRNAs pertenciam ao conjunto maior do copo, enquanto a 15 amostra restante que apresentaram quantidades relativamente pequenas destes mRNAs pertencia ao cluster menor, tal como mostrado na Figura 2. Tal como esperado, o aumento da expressão destes mRNAs foram também observadas no LAC, mas não em outros tipos de cancro (Figura 4).
os níveis relativos de expressão de (a) RPS7, (B) RPL11, (C) RPS10, e (D ) RPL36 foram comparados com amostras CUP individuais (n = 60), a média dos níveis de expressão de tipos de câncer conhecidos, e um normal amostras de nódulos linfáticos (n = 25). Os valores transformou-ASINH para cada gene foram utilizados para os cálculos.
Discussão
Acumulando conjuntos de dados de microarray gene-expressão analisados vários tipos de tumores têm permitido o estabelecimento de órgãos – e perfis de expressão específicos de tumor que melhoram previsão precisa do local primário de COPO [9], [10], [14], [15]. Nosso estudo oficial fase 2 para corroborar a viabilidade da previsão CUP usando nosso algoritmo está actualmente em curso e irá fornecer genes que apresentam padrão de expressão única em CUP. Uma teoria para explicar COPO convincente é que o cancro primário é microscópico e pode desaparecer por causa da apoptose marcada após a sementeira metástases, que são capazes de proliferar em tumores mais significativos em tecidos diferentes [27]. Como um potencial de metástases alta e vulnerabilidade a apoptose poderia explicar as propriedades de COPO bem, primeiro procurou por genes relacionados com a metástase e a apoptose entre todos os genes que foram sobre-reguladas por mais do que cerca de 2,5 vezes nas amostras de copo (H
CUP (2,5) conjunto de dados).
dos 14 genes up-regulamentados que foram encontrados (
S100A4, PRG1, S100A6, GSTP1, eIF5A, LGALS1, S100A11, PRKDC, VIM, CST3, TIMP1
,
YWHAZ
,
NEDD8
,
STK17A
), três (
S100A4
,
S100A6
,
S100A11
) pertence a um grupo de proteínas S100 envolvido no Ca
2+ rede de sinalização e regulam uma variedade de actividades intracelulares incluindo o crescimento celular e a motilidade [28]. As expressões destes genes são observados em vários tumores epiteliais e têm sido associados a metástase [29], [30].
S100A4
, juntamente com
VIM
, também tem sido usado como um marcador de EMT [31]. A sobre-expressão de
eIF5A
induz a EMT, promovendo assim a metástases do tumor de colo-rectal e o carcinoma hepatocelular [32]. Serglycin, um produto do gene de
PRG1
, é um proteoglicano que foi funcionalmente identificado como um regulador importante da metástase do carcinoma nasofaríngeo (CNP) [33]. A expressão elevada de Serglycin em células NPC podem mediar o nível de vimentina (
VIM
) expressão, o que não é apenas um marcador da EMT, mas também tem um papel importante na regulação da migração celular [31] , [34]. Lewis células de carcinoma do pulmão em ratos mostram metástases para os pulmões quando as células expressam galectina-1 (Gal-1), uma grande proteína de ligação a hidratos de carbono codificada por
LGALS1
, sugerindo novas estratégias de segmentação para a Gal-1 em cancro [35].
Ambas as células metastáticas e células resistentes a fármacos têm padrões de expressão de genes semelhantes de moléculas relacionadas com a sobrevivência, o que sugere que o cancro metastático pode ser difícil de tratar por causa da resistência a drogas anti-cancro. dependente de DNA-cinase de proteína (ADN-PK), um produto de gene de
PRKDC
, é uma das proteínas sobre-regulado em várias células de cancro metastáticas e resistentes a drogas [36]. Porque o aumento da regulação do DNA-PK foi observada nos pacientes Cup na nossa coorte, que nunca tinham sido tratados com quimioterapia, DNA-PK pode indicar resistência essencial, ao invés de resistência adquirida, à quimioterapia. GSTP1 também tem sido postulada em vários tipos de cancro para aumentar o potencial metastático e para o desenvolvimento de resistência a drogas que induzem espécies reactivas de oxigénio (ROS), tais como paclitaxel e cisplatina [37], [38]. Outros genes regulados positivamente no copo revelam também um papel importante na quimiorresistência e pode ser ligada ao potencial metastático. células cancerosas da mama que sobre-expressam o TIMP-1, um inibidor bem conhecido da metaloproteinase de matriz, exibem uma sensibilidade reduzida ao paclitaxel fármacos quimioterapêuticos e epirrubicina através da activação do factor de transcrição NF-kB [39]. A expressão knocked-down de 14-3-3 ζ, um produto gene da
YWHAZ
, sensibiliza as células cancerígenas de cabeça e pescoço à quimioterapia [40]. Uma pequena molécula inibidora da enzima de activação NEDD8 (NAE) podem ser activos contra tumores que são resistentes a outros agentes quimioterapêuticos [41].
Ao contrário dos genes até aqui descrito, cistatina C (
CST-3
) e função STK17A como factores pró-apoptóticos directos por antagonizar a sinalização de TGF-β e por modulação da ROS, respectivamente. A cistatina C foi mostrado para interagir com o receptor de TGF-β tipo II, evitando assim a ligação de TGF-β e indução subsequente de EMT [42]. TGF-β tem sido aceito como um iniciador principal da EMT; No entanto, o NF-kB foi encontrado recentemente para promover EMT em algumas células que não respondem ao TGF-β porque lhes falta SMAD4 funcional, que representa uma via alternativa que conduz ao EMT que pode substituir o TGF-β sinalização [43]. sinalização de NF-kB pode predominantemente induzir EMT no copo. Tanto TIMP-1, o qual pode activar o NF-kB, e a vimentina, que é activado pelo NF-kB, estavam entre os genes (proteínas) que foram supra-regulados no copo como se descreveu acima, fazendo esta hipótese mais provável [39], [43]. STK17A é sobre-regulada em resposta ao estresse oxidativo de um modo dependente da p53 [44]. Desde STK17A é conhecido como um regulador positivo da via apoptótica e seu nível de expressão em carcinomas colorrectais é aumentada em lesões com linfonodo metástases, o processo apoptótico pode estar envolvida na metástase de carcinoma, incluindo o disco [45].
dos 15 genes regulados negativamente na M
dataset CUP (2.5),
CD24
,
KRAS Comprar e
DICER1 Quais são de particular interesse. CD24 é o marcador mais utilizado, em conjunto com os CD44, para a identificação de células de iniciação do tumor em carcinomas da mama. CD44
+ /CD24
– células /baixo de cancro da mama têm a capacidade de metástase, uma vez que o enriquecimento destas células estaminais-como é significativamente observada em pacientes com linfonodos positivos [46]. Um subgrupo de KRAS mutante células cancerosas exposição “kras vício” e têm um fenótipo epitelial diferenciado. A indução de EMT foi mostrado para converter as células de cancro dependentes de KRAS KRAS de células independentes, que não requerem a expressão continuada de KRAS [47].
Dicer1
funciona como um gene supressor de tumor haploinsufficient [48]. frequente perda de um alelo de
Dicer1
tem sido observado em vários tipos de tumores diferentes, causando uma redução global de micro níveis de ARN de estado estacionário, que pode ser funcionalmente supressiva à oncogénese e a metástase de COPO.
O aumento da expressão de várias proteínas ribossomais foi encontrado em CUP. Se essas mudanças na expressão são causalmente relacionada com a geração de CUP é desconhecida. Em alguns casos, a sobre-expressão de proteínas ribossomais, incluindo RPL5, RPL11, RPL23 RPS7 e tem sido demonstrado para suprimir tumorigenese [49], [50]. Estas proteínas p53 activar pela ligação a MDM2 e inibição mediada por MDM2 ubiquitinação e degradação de p53 em resposta ao stress nucleolar (também chamado o stress ao ribossoma). RPL11 e RPS7 foram recentemente mostrado ser necessária para a activação de p53 induzida por agentes que danificam o ADN [51], o que sugere que estas proteínas ribossomais pode desempenhar um papel crucial na activação de p53 em resposta a diversos factores de stress. Além disso, neddylation, o processo pelo qual a proteína ubiquitina-NEDD8 como é conjugado com o seu alvo, é essencial para o papel da RPL11 na mediação de sinalização de p53 [49]. Curiosamente, estas duas proteínas ribossomais e NEDD8 foram incluídos no nosso
CUP (2,5) dataset M. A função supressora de tumor realizada por estas proteínas podem ser relacionados com a vulnerabilidade a apoptose que de copo (no sítio primário) apresenta como uma das suas propriedades.
Para as análises funcionais dos genes identificados, a sobre-expressão ou knockdown utilizando experiências as linhas celulares apropriadas seria plausível para prosseguir se o gene de interesse confere alterao no crescimento ou na capacidade metastática de células. O processo metastático pode ser avaliada
In vitro
monitorizando a invasão celular através de Matrigel e a adesão de células a placas, etc inibidores sintéticos específicos para a Gal-1, de ADN-PK e 14-3-3 ζ foram desenvolvidos [52] – [54]. Assim, será interessante para investigar o efeito destes inibidores nas células com superexpressão do respectivo gene
in vitro
ou
in vivo
, o que pode levar a terapia-alvo para a Copa.
Para nossa surpresa, o perfil de expressão gênica (GEF) do CUP se assemelhava a de adenocarcinoma de pulmão (LAC), o que pode simplesmente refletir o relativamente elevado potencial metastático de LAC. Em um estudo usando
18F-flúor-2-deoxiglicose tomografia por emissão de positrões (FDG-PET), o local mais comumente detectada do tumor primário em pacientes com CUP foi o pulmão [55]. Na Copa, o cancro primário e suas metástases (-ses) se comportam de forma muito diferente em relação à proliferação, levando à suposição de que os perfis moleculares de amostras CUP dos dois locais seria diferente. Nós somos incapazes de comparar essas diferenças porque o câncer primário é não identificável. A análise de expressão diferencial de genes utilizando tecidos tumorais primários e metastáticos de pacientes com câncer avançado de pulmão pode fornecer algumas pistas para essa pergunta.
Em conclusão, foram identificados vários genes que estavam sobre-regulada na Copa e que podem contribuir para a aquisição de um fenótipo metastático, bem como resistência a fármacos anticancerígenos, em muitos casos. Também foram identificados fatores pró-apoptóticos. Os efeitos de combinações múltiplas funções de genes que são altamente expressos em CUP poderiam estar envolvidos na regulação comportamentos CUP, como apoptose e metástase. validação de imuno-histoquímica ou baseado baseado em PCR dos genes candidatos é necessário para refinar a classificação molecular de CUP.
Informações de Apoio
Figura S1.
Heatmap construído como na Figura 1, mas excluindo o
vapA
gene
doi:. 10.1371 /journal.pone.0063249.s001
(TIF)
Figura S2. dendrograma Cluster
para cada tipo de câncer. análise de agrupamento foi feito usando o método de Ward e 77 genes de proteínas ribossomais
doi:. 10.1371 /journal.pone.0063249.s002
(TIF)
Reconhecimentos
Agradecemos Takuya Wada para a análise de varredura microarray e os dados, Tomoko Kitayama para suporte técnico e Marco DeVelasco pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por NPO West Japan Oncology Group.