Abstract

adenovírus (ADS), especialmente HAdV-5, foram geneticamente equipado com potencial de replicação com restrição de tumor para permitir que aplicações na terapia do câncer oncolytic. Tais adenovírus oncolytic foram bem toleradas em pacientes com câncer, mas sua eficácia anti-tumoral tem de ser melhorada. A este respeito, deve considerar-se que as células cancerosas, dependentes seu tecido de origem, podem diferir substancialmente das células normais do hospedeiro para o qual os anúncios são adaptados por complexas interacções vírus-hospedeiro. Consequentemente, a eficiência da replicação viral, um factor determinante da atividade oncolytic, pode ser sub-óptima em células cancerosas. Assim, analisámos os dois a cinética de replicação do HAdV-5 e o transcriptoma induzida por vírus em células epiteliais brônquicas humanas (HBEC) em comparação com as células cancerosas. Este é o primeiro relatório sobre todo o genoma perfil de expressão de anúncios em suas células hospedeiras nativas. Descobrimos que a expressão de E1A e início da replicação do genoma viral são mais rápidos em HBEC e consideravelmente atrasado em células de melanoma. Em células de carcinoma de pulmão de células escamosas, observamos HAdV-5 cinética de replicação intermediários. produção infecciosa das partículas, a disseminação viral e atividade lítica de HAdV-5 foram atenuadas em células de melanoma contra HBEC. Expression profiling no início da replicação do genoma virai revelou que HAdV-5 induzida mais fortes alterações no transcriptoma celular em HBEC, seguido de cancro do pulmão e células de melanoma. Foram identificados proeminente regulação de genes envolvidos no ciclo celular e metabolismo de DNA, replicação e empacotamento em HBEC, que está de acordo com a necessidade para induzir a fase S para a replicação viral. Surpreendentemente, em células de melanoma HAdV-5 desencadeada regulação opostas dos referidos genes e, em contraste com as células de cancro do pulmão, qualquer indução fraco na fase S foi detectado quando se utiliza o promotor E2F como repórter. Nossos resultados fornecem uma base racional para melhorar adenovírus oncolytic quer por adaptação de infecção viral para direcionar células tumorais ou por modular funções das células do tumor para melhor apoiar a replicação viral

Citation:. Dorer DE, Holtrup F, Fellenberg K, Kaufmann JK , Engelhardt S, Hoheisel JD, et ai. (2011) Replicação e transcriptoma induzida por vírus de HAdV-5 em células hospedeiras normais versus células cancerosas – As diferenças de relevância para adenoviral onc�ise. PLoS ONE 6 (11): e27934. doi: 10.1371 /journal.pone.0027934

editor: Maciej S. Lesniak, The University of Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de junho de 2011; Aceito: 28 de outubro de 2011; Publicado: November 30, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Dorer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Associação Helmholtz de Centros de Investigação Nacional (Helmholtz-University Grupo Grant), o Programa Intramural do alemão Cancer Research Center (DKFZ, Deutsches Krebsforschungszentrum) e pelas bolsas de estudo da Escola de Pós-graduação Internacional de Helmholtz para Pesquisa do Câncer para DED, FH, e JKK. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenovírus (Ads) estão a emergir terapêuticos para o cancro com base na sua potência para infectar e lisar as células cancerosas, um processo denominado de oncólise virai [1], [2]. Este esquema apresenta um efeito de amplificação único como células de tumor infectadas produzem vírus de progénie que espalham a infecção no tumor. Uma outra vantagem é que o modo de acção de anúncios oncolíticos difere de terapias convencionais, para que as células cancerosas desenvolvem frequentemente resistência. Restrição da replicação do vírus às células tumorais é essencialmente necessário para a aplicação de anúncios em terapia do cancro. A este respeito, o amplo conhecimento da estrutura do anúncio, organização do genoma e ciclo de replicação combinada com tecnologias para a engenharia Ad facilita o desenvolvimento racional de anúncios oncolytic [2], [3]. De facto, os vírus oncolí ticos com excelente selectividade para o tumor foram projectadas com base na HAdV-2 fortemente relacionadas e HAdV-5. Isto foi conseguido, quer por mutação de funções de genes que são complementadas em células cancerosas, mas não em células normais, ou visando a expressão de genes virais essenciais para as células tumorais [1], [2], [4]. Diversos ensaios clínicos demonstraram que tais anúncios modificados são bem toleradas em pacientes, mas que a sua potência terapêutica precisa de ser melhorada [5], [6]. Neste contexto, a oportunidade para a engenharia racional de anúncios é novamente uma vantagem fundamental, uma vez que facilita o desenvolvimento de agentes oncolíticos avançada. Do mesmo modo, estudos para melhorar a entrada Ad em células cancerosas ou para inserir genes terapêuticos em anúncios oncolytic foram relatados [2], [7], [8].

onc�ise adenoviral necessita de replicação Ad eficiente em células cancerosas alvo. trabalho anterior no campo não considerou adequadamente que as células cancerosas, dependentes do tecido de origem, podem diferir substancialmente das células hospedeiras Ad normais. Assim, o vírus não se deparar com o meio celular que é adaptado para por interacções de células completas de vírus-hospedeiro. Em consequência, a replicação do anúncio, a lise celular e propagação pode ser abaixo do ideal. Especificamente, HAdV-2 e -5 são evolutiva adaptado para replicar em células epiteliais do tracto respiratório [9], mas estão a ser desenvolvidos para a terapia de uma grande variedade de alvos tumorais. De facto, mutações de HAdV-5 que aumentar a replicação do vírus e disseminação de células tumorais têm sido relatada [10] – [12]. Um exemplo é a supressão de

E1B19K

, que tem actividade anti-apoptótica. Supressão de

E1B19K

resultou em forte aumento da replicação HAdV-5 e onc�ise em células de câncer de pulmão. No entanto, a replicação reduzida foi avaliado em células de cancro derivadas de outros tecidos, incluindo células de melanoma [11], [13] – [15]. Estas observações novamente apontar em dependência do tipo de célula de interações celulares Ad-anfitriãs e, consequentemente, a eficiência da replicação do anúncio: Diferenças na programação apoptose entre células normais e cancerosas, mas também entre as células cancerosas diferentes provavelmente fazer com que o diferente permissivas para o

E1B19K

-deleted HAdV-5.

Como obrigatórias parasitas intracelulares anúncios são dependentes da produção de energia celular e máquinas biossintética. Na verdade, os anúncios têm implementado diversas e intrincados mecanismos moleculares para estabelecer condições na célula hospedeira que garantir a reprodução do vírus eficiente. Estes são os mais estudados para HAdV-2 e -5 ([16], [17] e referências aí contidas). De modo correspondente, os produtos de expressão de genes virais precoce – além de fornecer proteínas necessárias para a replicação do genoma viral – manipular o ambiente celular para suportar a replicação do vírus por vários mecanismos, nomeadamente através da modulação directa e indirecta de transcrição celular ([17] – [19] e suas referências). O primeiro gene viral expresso durante a infecção Ad é E1A, que codifica uma família de proteínas que resultam de splicing alternativo. proteínas E1A induzem a expressão de outros genes precoces Ad e manipular a transcrição de genes celulares directamente ou indirectamente, [20], [21]. A maior proteína E1A (13S) contém um domínio de transactivação potente que induz a transcrição E1A quando interage com as proteínas de ligação de ADN. Ambas as proteínas 13S e 12S de E1A ligam a pRb, resultando na liberação de fatores de transcrição E2F de complexos PRB-E2F. As proteínas E2F então activar a transcrição de genes virais e celulares através de sítios de ligação de E2F-([17], [19], [22], [23] e referências aí contidas). E2F amplamente induzir genes celulares envolvidos na fase S do ciclo celular, o que também são necessários para a replicação do genoma do Ad. Outras actividades da transcrição de proteínas E1A são mediadas pela interacção com um painel de factores celulares que inibem ou activam a transcrição, por exemplo, histona acetilases ([17] e referências aí contidas). Outra proteína início do anúncio, E1B55K, contém um domínio de repressão de transcrição forte. Ao ligar-se o domínio de transactivação de p53 que muda funcionalmente a p53 a partir de um activador de transcrição para um repressor [24]. Além disso, em conjunto com E1B55K E4ORF6 gatilho degradação de p53 [25]. O shut-off resultante de genes pró-apoptóticos p53-responsive neutraliza a indução de apoptose desencadeada por um estímulo anormal do ciclo celular por E1A.

O excelente conhecimento da infecção anúncio foi adquirida por estudos extensivos que eram em sua maioria realizada com HAdV-2 ou -5 em HeLa e outras células cancerosas e focado em genes de anúncios individuais [17]. Assim, a infecção de anúncios no seu ambiente normal das células do hospedeiro nativo, por exemplo células epiteliais primárias do trato respiratório para HAdV-5, tem sido pouco estudada (a maioria desses estudos analisou a seletividade de anúncios oncolytic, ver discussão). Note-se que as células HeLa que diferem das células hospedeiras Ad normais, como sejam de origem do cancro do colo do útero e têm sido extensivamente passadas. Além disso, eles contêm genes do vírus do papiloma humano que afetam as funções celulares importantes para a replicação do anúncio. Estudos que investigam como indivíduo genes Ad afetar as funções celulares não consideram a complexa rede de interações vírus-hospedeiro durante as infecções de vírus. A este respeito, a tecnologia de microarray representa uma ferramenta poderosa para a monitorização de todo o genoma da expressão do gene celular reprogramado durante a infecção Ad. De facto, estudos anteriores revelaram microarray que HAdV-2 e -5 infecções alvo múltiplas vias celulares [26] – [30]. Estes estudos foram realizados com células HeLa e fibroblastos primários. Como infecções Ad modular a expressão de genes do genoma das células do hospedeiro nativo não foi investigada até à data. Por conseguinte, uma análise comparativa dos perfis de expressão genética induzidas anúncio de células tumorais em comparação com células hospedeiras Ad nativas, o que é de interesse para o desenvolvimento de anúncios oncolytic, não está disponível até à data.

Neste estudo, portanto, nós exploramos Ad como infecção de células cancerosas difere da infecção Ad das suas células hospedeiras normais. Para este fim, foi realizada uma análise comparativa dos HAdV-5 cinética de replicação e atividade lítica em células epiteliais brônquicas primários, células de carcinoma de células escamosas do pulmão e células de melanoma. Nós escolhemos este conjunto de células, uma vez que representam células HAdV-5 hospedeiras normais, células de tumores derivados de HAdV-5 células hospedeiras e células tumorais derivadas de um tipo de célula não relacionado, respectivamente. A seguir, foi realizado perfil de expressão do genoma do HAdV-5 infecção em células epiteliais brônquicas normais e células tumorais. diferenças celular type-dependentes nos transcriptomes celulares induzidas HAdV-5 foram avaliados por análise bioinformática.

Resultados

potência lítica e eficiência da replicação de HAdV-5 nas células brônquicas humanas normais epiteliais e câncer células

o primeiro avaliou se a eficiência do HAdV-5 lise celular dependente de difusão e replicação diferem entre células hospedeiras HAdV-5 nativas e células cancerosas. As células primárias humanas epiteliais brônquicas (HBECs) foram usados ​​em nosso estudo, pois representam os HAdV-5 células hospedeiras nativas do epitélio respiratório mais de perto. Eles foram comparadas com células de cancro do pulmão SK-MES-1, SW900 (tanto de carcinoma de células escamosas), e A549 (adenocarcinoma), para células de melanoma células normais primárias mais humanas SK-MEL-28 e Mel624, e, nomeadamente fibroblastos e queratinócitos . Num ensaio de citotoxicidade, observou-se que a lise celular dependente de propagação por HAdV-5 foi igualmente eficaz na HBECs, SW900 e células A549, mas atenuado em SK-MES-1 de células e ainda mais nas duas linhas celulares de melanoma (Fig. 1A ). Citotoxicidade de HAdV-5 para queratinócitos foi semelhante ao HBECs, ao passo que não foi observada morte celular de fibroblastos primários no tempo de medição. Estes resultados mostram claramente que a potência de lise de HAdV-5 é de células tipo-dependente e pode ser fortemente reduzida em células cancerosas em comparação com HBECs. De nota, redução da potência de lise do HAdV-5 em células SK-MEL-28 e Mel624 não pode ser atribuído à ligação ineficiente célula virai e entrada, porque estas células mostraram forte expressão do CAR receptor de HAdV-5 (Fig. S1) e eram ainda mais suscetíveis a transdução por um HAdV-5 vector deficiente na replicação do que HBECs, A549 e células SW900 (Tabela S1). Esta é uma evidência clara de que a redução da actividade lítica de HAdV-5 em células de melanoma é determinada num passo de pós-entrada da replicação do vírus. Em contraste, os fibroblastos faltava expressão CAR e eram difíceis de transdução. Como as células foram coradas 8 dias pós-infecção, o que permite a vários ciclos de replicação do vírus, os resultados do ensaio de citotoxicidade indicam as diferenças na eficácia de replicação HAdV-5 e espalhar entre as células de melanoma e HBEC. Portanto, o próximo comparação HAdV-5 replicação em HBECs, SW900 e SK-MEL-28 mais diretamente pela quantificação da produção de partículas de vírus infeccioso durante um ciclo de replicação (Fig. 1B). produção de partículas de vírus infeccioso por HBECs era 100 vezes mais elevadas do que para a SK-MEL-28, às 36 h e 48 h pós-infecção. Os títulos de vírus atingiu o pico de HBEC às 48 h, enquanto eles continuaram a aumentar até 72 h para SK-MEL-28, quando atingiu um pico de um título ainda menor do que para HBECs. produção de partículas infecciosas por células SW900 apresentaram cinéticas semelhantes a HBECs, mas manteve-se aproximadamente 10 vezes mais baixa. Concluímos que HAdV-5 replicação está atrasado em SK MEL-28 em comparação com células HBECs e células SW900, o que está de acordo com os dados de citotoxicidade

(A) Citotoxicidade:. Vários tipos de células foram infectadas com ambos o tipo selvagem HAdV-5 (

em peso

) ou o vírus de controle de replicação deficiente HAdV-5 CMV-GFP (

GFP

) a MOI de 10

1 a 10

-4 TCID

50 /célula. As células foram células primárias humanas epiteliais brônquicas (HBEC, as células de um dos dois doadores que dão resultados semelhantes são mostrados), carcinoma de células escamosas do pulmão (SK-MES-1, SW900), adenocarcinoma de pulmão (A549), melanoma (SK-MEL -28, Mel624) humana primária fibroblastos de prepúcio (HFF) e queratinócitos humanos primários (PHK). Após incubação durante oito dias, as células sobreviventes foram fixadas e coradas com violeta de cristal. células do pulmão (

painéis esquerdos

) mostrou citotoxicidade global mais forte em comparação com células de melanoma (

painéis de média

). (B) Replicação: HBEC, SW900 ou SK-mel-28 de células foram infectadas com uma TCID

50 /células de HAdV-5. Após uma hora de incubação, os inóculos foram removidos e as células foram lavadas três vezes. As células e os sobrenadantes foram colhidas nos pontos de tempo indicados e as partículas de vírus infecciosos foram quantificados por determinação de TCID

50. As barras representam valores médios de infecções em triplicado e as barras de erro desvios-padrão. Os asteriscos indicam significância estatística (

p≤0.05

) das diferenças entre SK-MEL-28 e HBEC assim como SK-MEL-28 e SW900 (*), ou entre SW900 e HBEC (**). Aumentos de títulos virais foram significativas (

p≤0,05) para HBEC até 48 he SK-MEL-28 até 72 h de infecção post. Para SW900 títulos virais não apresentaram aumento significativo após 36 h (

p = 0,056 para 48 h versus 36 h

).

Cinética de expressão genética viral e replicação do genoma de HAdV-5 em HBECs e células cancerosas

próxima investigada a cinética de HAdV-5 replicação em células cancerosas e HBECs em mais detalhe por quantificação da expressão de genes virais e a replicação do genoma (Fig. 2). Tal como estas experiências foram utilizados para definir o ponto de tempo da subsequente perfil de expressão de genes, que foram realizados com os procedimentos correspondentemente normalizadas, isto é, as células foram cultivadas em meio de crescimento de microarray e infectados com os títulos de vírus, resultando em 80% de eficiência de infecção para cada tipo de célula (Tabela S1). O início da replicação do ADN virai foi retardado para células de melanoma (SK-MEL-28, 20 H; Mel624, 24 h) e SK-MES-1, células (20 h), em comparação com células SW900 (16 h) e HBEC (16 h ou 12 h, dependendo da doador) (Fig. 2B). fibroblastos primários mostrou um atraso (24 h), mas um primário queratinócitos (16 h) de início precoce da replicação do ADN viral. Estas diferenças de HAdV-5 cinética de replicação entre os tipos de células bem correlacionada com diferenças de lise viral e a produção de partículas infecciosas (ver Fig. 1). Análise da cinética da expressão de ARNm de E1A revelou que as diferenças de início da replicação do ADN entre os tipos de células reflectir as diferenças correspondentes na expressão do gene precoce: HBEC, SW900 e queratinócitos mostrou um rápido início da expressão de ARNm de E1A atingindo níveis quase máximos às 8 h pós-infecção . Em contraste, para células de melanoma, SK-MES-1 e fibroblastos um aumento mais lenta e contínua na expressão de ARNm de E1A foi observada (Fig. 2A). A razão para as diferenças na expressão de E1A entre linhas celulares não é clara. experiências de transfecção transitória com um plasmídeo repórter contendo o primeiro 557 pb do HAdV-5 genoma não revelou diferenças significativas na actividade potenciador /promotor E1A entre os tipos de células (Fig. S2). a expressão do gene virai tardia espelhado a cinética de replicação do genoma viral, como esperado (Fig. 2C). Concluímos que HAdV-5 replicação e lise são consideravelmente mais rápida do que em HBECs em células de melanoma. Replicação e lise nas células de cancro do pulmão é, dependente da linha celular, rápida ou intermediário. Para outras células primárias, cinética de replicação foram dependentes do tipo de célula: queratinócitos epiteliais mostrou fibroblastos rápidas e mesenquimais, como relatado anteriormente [27], [30], mostrou uma cinética de replicação lenta

células primárias humanas (

painéis esquerdos

) e linhas de células tumorais (

painéis direitos

) foram infectados com HAdV-5 em títulos, resultando em 80% de eficiência de infecção (

ver

Fig. 1

para nomes de tipos de células; HBEC d1, d2 HBEC são HBEC de diferentes doadores

). Inóculos foram removidos após uma hora de incubação. O ARN total e o ADN foi colhido para cada ponto de tempo indicado e foi analisada para E1A (A) e os níveis de fibra (C) de ARNm e para cópias virais de genomas (B), respectivamente, por qPCR. Os resultados das experiências representativas são mostrados; experimentos repetição rendeu momentos idênticos para o aparecimento de E1A e mRNA fibra de expressão e replicação do vírus genoma. Para HBEC D2, números de cópias do genoma não foram determinadas a 20 h e 24 h, por causa do número limitado de células deste dador.

análise comparativa das alterações induzidas por HAdV-5 para a expressão do gene celular em células cancerosas contra HBECs

a seguir, investigou se a expressão do gene celular é diferente afetados pela infecção Ad no câncer contra células normais. Por isso, foi realizada uma análise comparativa dos HAdV-5 mudanças induzidas pela infecção em transcriptomes de HBECs (2 doadores diferentes), células de câncer de pulmão de células escamosas (SK-MES-1, SW900) e células de melanoma (SK-MEL-28, Mel624 ). As células foram cultivadas utilizando condições e meios estandardizados (ver materiais e métodos para detalhes) e foram infectadas com HAdV-5 com títulos, resultando em 80% de eficiência de transdução para cada tipo de célula ou foram falsamente infectadas. As células foram colhidas no ponto de tempo de início de replicação do genoma viral, porque nesse momento eram esperadas alterações fundamentais para o transcriptoma celular na preparação da replicação do ADN viral. Além disso, estudos anteriores demonstraram mudanças menos em pontos de tempo anteriores para outras células [27], [28], [30]. Ao escolher este ponto de tempo, para cada tipo de célula individualmente, de acordo com a cinética mostrados na Fig. 2, podemos ajustar as diferenças na cinética de replicação virais entre os tipos de células. O ARN total foi purificado e utilizado para criar perfis de expressão. dados de microarranjos estão disponíveis on-line no banco de dados ArrayExpress (número de acesso E-MEXP-3125). Durante a análise bioinformática expressão de genes em amostras não infectadas foi definida como o estado estacionário e em comparação com os níveis de expressão de genes em amostras infectadas. Assim, foi determinado o transcriptoma celular induzida por vírus, ou seja, alterações de expressão de genes específicos de infecção para cada tipo de célula individualmente, sem criar um viés através do tipo de variações inter-celular por diferentes origens genéticas (ver Materiais e Métodos para mais detalhes).

Nós achamos mais fortes mudanças na expressão gênica por infecção HAdV-5 em HBECs, seguido de células de câncer de pulmão, enquanto que a expressão do gene foi muito menos afetada por HAdV-5 infecção em células de melanoma (ver também a análise de correspondência na Fig. S3). Ambos os números de genes celulares significativamente regulados por HAdV-5 infecção (Tabela 1) e as alterações na expressão de genes de dobragem (ArrayExpress, E-MEXP-3125) eram mais elevadas para HBECs e eram mais baixos para as células de melanoma. Estes resultados correlacionam-se com a eficácia de replicação do HAdV-5 para estas células: HBECs mostraram a replicação HAdV-5 mais eficiente e mais forte expressão de gene induzida por vírus, enquanto que para as células de melanoma tanto a eficiência da replicação e alterações induzidas por vírus na expressão de genes foram mais baixas.

Como perfis de infecção anúncio de células epiteliais respiratórias normais expressão não tem sido relatada antes, nós primeira avaliou o transcriptoma celular induzida HAdV-5 em HBEC. Os nossos resultados mostram a indução de genes envolvidos na replicação do DNA e do ciclo celular, organização da cromatina, e o metabolismo de nucleótidos, ao passo que os genes envolvidos na diferenciação, regulação (principalmente negativa) da proliferação, e a regulação da morte celular foram reprimidos (Tabela 2 e Tabela S2).

em seguida, comparamos gene assinaturas de expressão de infecção HAdV-5 em HBECs e células cancerosas por diferentes análises de bioinformática. agrupamento hierárquico de genes diferencialmente regulados dos cinco tipos de células analisadas em destaque dois grupos de genes que mostram regulação oposta em células de melanoma contra HBECs, genes ou seja, que são induzidos em HBECs, mas reprimido em uma ou ambas as linhas de células de melanoma (enquadrada na Fig . 3A, ampliada na Fig. S4). Curiosamente, o cluster maior mostra uma acumulação altamente significativa de genes envolvidos na replicação do DNA, o metabolismo de nucleótidos, regulação do ciclo celular e resposta a danos no ADN (Fig. 3B), que também foram encontrados no cluster menor (aqui significado de acumulação não foi alcançado porque Devido ao pequeno número de genes). genes seleccionados são listados na Tabela 3. Estas funções celulares têm sido amplamente relatado para ser induzida por infecção ad [17] e estes aglomerados contêm vários dos genes mais fortemente induzidos em HBECs (ver Tabela 2). Assim, é surpreendente que HAdV-5 não consegue induzir ou com frequência ainda reprime esses genes /funções celulares em células de melanoma. Os dados de expressão de genes obtidos por análise de micro-arranjo foi validada por PCR quantitativo (fig. S5). Como mais uma bioinformática abordagem para identificar vias celulares mais diferencialmente regulados por HAdV-5 infecção de células de melanoma contra HBECs, foi realizada análise de caminho Ingenuity dos dados de expressão de genes. Identificamos o S ​​rede reguladora G1 /transição, com genes-chave da fase pró-S (

E2F

,

CCNE

,

CDK2

,

Cdc25A

) induziu em HBECs, mas reprimidos ou não regulado em células de melanoma (Fig. S6). Concluímos que HAdV-5 infecção de células de melanoma não consegue induzir um painel de genes em fase S. envolvidos na regulação do ciclo celular, metabolismo de nucleótidos e de replicação e reparação do ADN, que são induzidas nas células nativas HAdV-5, HBEC.

(a) de agrupamento hierárquico de genes utilizando multi-Experiment Viewer (

MeV 4.5.1

) com base na aprox. 1000 genes mais significativamente regulados (

ver

Materiais e Métodos

para os critérios de filtragem de dados

). Grupos de genes que mostram oposição regulação por infecção HAdV-5 em HBEC contra células de melanoma são enquadrados. As ampliações de estes aglomerados são apresentados na Fig. S4. (B) As listas de genes dentro de cluster 2 foram submetidos à análise ontologia gene usando o banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada (

DAVID;

david.abcc.ncifcrf.gov). Os valores P de termos GO foram corrigidos para testes múltiplos utilizando o algoritmo Benjamini-Hochberg.

Análise da indução fase S por HAdV-5 infecção usando o promotor E2F-1 como repórter

Como expressão gênica profiling indicou que HAdV-5 falha para induzir genes envolvidos criticamente em processos em fase S em células de melanoma, o próximo realizado um ensaio biológico independente para investigar a indução fase S por infecção HAdV-5. O promotor E2F-1, a qual é fortemente induzido durante a fase S, foi utilizada como um repórter para a entrada na fase S induzida por Ad [31]. HBEC, SW900, SK-MES-1, A549, SK-MEL-28 e Mel624 células foram transfectadas com os plasmídeos repórter da luciferase contendo ou o promotor E2F-1 ou o promotor de SV40 constitutiva como controlo. As células transfectadas foram subsequentemente superinfectadas com qualquer HAdV-5 com ou HAdV-5 CMV-GFP como eliminados em E1, vírus de controlo deficiente em replicação. Quantificação da expressão do gene repórter (Fig. 4) revelou que em células de cancro do pulmão, a infecção com HAdV-5 induz o promotor E2F-1, mas não o promotor do SV40, muito mais forte do que o controle de vírus deficiente na replicação. Em contraste, a E2F-1 por indução do promotor infecção HAdV-5 foi mínimo ou ausente em células de melanoma. Estes resultados estão de acordo com o nosso perfil de expressão gênica de dados e mostrar que S indução fase por HAdV-5 é eficiente na HBEC, mas pobre em células de melanoma.

luciferase plasmídeos de gene repórter (A) contendo E2F-1 ou fragmentos do promotor SV40 foram transfectados para as linhas celulares indicadas. Após 24 horas, as células foram infectadas com HAdV-5 (

em peso

) ou deficiente em replicação HAdV-5 CMV-GFP (

GFP) em títulos de infecção, resultando em 80%. A actividade da luciferase foi quantificada vinte horas após a infecção. As colunas representam os valores médios de triplicado transfections /infecções e barras de erro reflectem o desvio padrão. Os asteriscos indicam significância estatística para comparações de HAdV-5 com HAdV-5 CMV-GFP (

* p ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001

). (B) representação diferente de dados mostrados no painel A:. Mudança vezes na actividade de promotor por HAdV-5 em comparação com HAdV-5 CMV-GFP

Discussão

infecção Ad produtiva é dependente de um ambiente celular que suporta as diferentes fases do ciclo de replicação virai. Portanto, os anúncios evoluíram estratégias para manipular o ambiente celular em células hospedeiras. proteínas virais precoces e precoces imediatos estabelecer uma rede complexa de interacções com as funções da célula hospedeira, a fim de neutralizar as defesas do hospedeiro e induzir vias celulares necessárias para a replicação do genoma virai. Isto inclui a reprogramação da expressão do gene celular. Aqui, descrevemos pela primeira vez o transcriptoma HAdV-5 induzida por infecção por HBECs, representando suas células hospedeiras nativas. Em primeiro lugar, determinada a cinética de HAdV-5 replicação em HBECs, que é o seguinte: a expressão de E1A inicia antes de 4 horas pós-infecção (h.p.i.) e atinge um patamar em 8 h.p.i .; o primeiro aumento virais do genoma e de ARNm de fibra cópias ocorre em 8 ou 12 hpi, dependente do dador, e a produção de partículas infecciosas atinge um planalto a 48 hpi. Isto é seguido por uma propagação de vírus eficiente na monocamada de células, como observado por citotoxicidade ensaio após a infecção baixo título. Genome-wide perfis de HBECs HAdV-5-infectadas no início da replicação do genoma virai, quando são esperadas grandes modificações na célula hospedeira por genes virais iniciais de expressão, revelou um aumento significativo na expressão de 424 e uma redução de 519 de 18631 avaliada genes. Assim, a repressão do gene era proeminente neste ponto de tempo, mesmo considerando que é mais difícil de detectar do que a indução do gene por causa da semivida do ARNm presente antes da infecção. Os genes envolvidos no metabolismo do ciclo celular, replicação de ADN, organização da cromatina e de nucleótidos foram acumulados na população de genes regulada positivamente. Isto incluiu

E2F-2

, mostrando o maior aumento na expressão de mRNA (11,5 vezes),

CCNE1

e

CCNE2

(ciclina E1 e E2; 7.9- e 6.2 fold),

RRM2

(ribonucleótido-redutase M2; 5,2 vezes),

Cdc25A

(3,5 vezes),

MCM2

,

7

e

10

(3-, 3.3- e 3,3 vezes),

EXO1

(exonuclease 1; 3,1 vezes),

RFC3

e

4

(factor C3 replicação e 4; 2,8 e 2,1 vezes),

PCNA

(proliferando antigénio da célula nuclear; 2,2 vezes) e vários histona, fator de montagem da cromatina e genes centrômero. Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores que tenham estabelecido, embora em outros tipos de células, que S a indução de fase em células infectadas com Ad é necessária para a replicação viral de proceder. O número de genes e as taxas de indução que se reportam pode ser ainda subestimado, uma vez que não sincronizar HBECs antes da infecção, a fim de permitir uma comparação válida para as células cancerosas. Genes com actividade na diferenciação, regulação negativa da proliferação (incluindo

CDKN1A

; -2.9 e

CDKN2B

; -2,73), e morte celular regulação foram acumulados na população gene reprimido (mais forte repressão foi para a hormona da hormona-like paratireóide, 16,1 vezes). De nota, não identificamos o acúmulo de genes envolvidos na imunidade no conjunto de genes upregulated.

Infecção

HAdV-5 tem sido raramente investigados em células epiteliais respiratórias normais antes. Vários estudos de anúncios oncolíticos compararam células epiteliais respiratórias principalmente com células tumorais em ensaios de citotoxicidade e de produção de partículas infecciosas para avaliar a selectividade e eficiência de vírus mutantes [32] – [39]. Estes estudos têm mostrado que a produção de HAdV-5 infecciosas em partículas de células epiteliais respiratórias primárias é eficiente e picos de cerca de 48 h p.i. [37], [39], o que está de acordo com os nossos resultados.

Estudos anteriores sobre os perfis de expressão Ad infecção foram realizados com células HeLa e fibroblastos humanos. Para as células HeLa, HAdV-2 infecção a uma MOI de 100 foi relatado para regular 76, 60, ou 382 genes mais do que 1,5 vezes a 6 h, 10 h ou 20 hpi, respectivamente (12000 foram analisadas em 6 h, 7.500 genes no 10 h e 20 h) [26], [28]. Outro estudo constatou 75 dos 4.600 genes regulados mais do dobro por HAdV-5 a 24 h.p.i. células de HeLa [40]. Se o número menor de genes regulados em comparação com HBECs do nosso estudo é devido à transformação de células HeLa é difícil de avaliar por causa das diferenças na metodologia. A este respeito, o nosso estudo mostrou um menor número de genes regulados para ambas as linhas celulares de cancro do pulmão e melanoma em comparação directa com HBECs (ver abaixo). genes fase S foram relatados para ser induzida pela infecção do anúncio em células HeLa, incluindo

Cdc25A

(1,8 a 10 h),

UNG

(1,6) e genes de histonas [28], o que foi também em HBECs. Sobreposições também são encontrados em genes reprimidos:

MYC

(-1,9 contra -2,4 em HBEC);

THBS1

(trombospondina-1; -2,6 contra -9,4 em HBEC);