Abstract

Fundo

A resposta das células epiteliais ao estresse envolve a transmissão de sinais entre células contíguas que pode ser visualizado como uma onda de cálcio. Em alguns tipos de células, esta onda é dependente da libertação de trinucleótidos extracelulares a partir de células lesionadas. Em particular, o ATP tem sido relatada como sendo crítica para a resposta das células epiteliais ao stress e, recentemente, tem sido mostrado para ser regulada positivamente em tumores in

in vivo

.

Metodologia /principais conclusões

Aqui, nós identificamos stanniocalcina-1 (STC1), uma proteína secretada pleiotrophic, como um mediador fundamental da propagação da onda de cálcio em monocamadas de pulmonar (A549) e as células epiteliais da próstata (PC3). A adição de STC1 reforçada e bloqueando STC1 diminuiu a distância percorrida por uma onda de cálcio dependente de ATP extracelular. Foram observados os mesmos efeitos de cálcio quando foi estimulada pela adição de ATP exógeno. Nós descobrir um ciclo de feedback positivo, em que STC1 promove a liberação de ATP a partir de células

in vitro

e

in vivo

.

Conclusões /Significado

A STC1 resultados indicaram que desempenha um papel importante na resposta precoce à lesão mecânica por células epiteliais através da modulação de sinalização de ATP extracelular. Este é o primeiro relatório para descrever STC1 como um modulador ou sinalização do receptor purinérgico

Citation:. Bloquear GJ, DiMattia GD, Prockop DJ (2010) stanniocalcina-1 regula Extracelular ATP-Induzidas ondas de cálcio em células cancerosas epiteliais humanas ao estimular ATP lançamento de células Espectador. PLoS ONE 5 (4): e10237. doi: 10.1371 /journal.pone.0010237

editor: Neil A. Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido

Recebido: 16 de dezembro de 2009; Aceito: 16 de março de 2010; Publicação: 20 de abril de 2010

Direitos de autor: © 2010 Block et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Apoiado por NIH subvenções P40 RR 17447 e HL P01 075161. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. os autores declararam que nenhum concorrente existem interesses.

Introdução

stanniocalcina-1 (STC1) é uma proteína de 247 amino ácidos que é segregada a partir de células como um homodímero glicosilado. STC1 foi originalmente descrito como um regulador do sistema endócrino de homeostase do cálcio e fosfato em peixes [1], [2]. Nos vertebrados, STC1 pode regular o metabolismo mineral [3] por meio da modulação da sua resorprtion fosfato no rim [4] e do intestino [5]. STC1 também foi implicado no desacoplamento da fosforilação oxidativa [6], a inibição da migração de macrófagos

in vitro

[7] e

in vivo

[8], a prevenção da permeablization vascular [9], e ambos os efeitos pró e anti-apoptóticos [10], [11], [12]. Até à data, um mecanismo pelo qual STC1 exerce os seus efeitos pleiotrópicos não foi estabelecida. Mais recentemente, tornou-se claro que STC1 é um factor responsivo estresse (Chang et al., 2003), consistente com observações recentes de que a transcrição STC1 é rapidamente regulada para cima seguintes sinais prejudiciais [10], [13], [14] .

o papel de STC1 na homeostase do cálcio e lesão dos tecidos sugere que pode estar envolvido no movimento de cálcio e de sinalização que são provocadas por uma variedade de agressões mecânicas e outros para células. Por exemplo, a reparação de monocamadas epiteliais seguinte ruptura mecânica é dependente de uma onda de cálcio intercelular propagado a partir do local da perturbação para as células adjacentes [15], [16], [17], [18], [19]. A propagação da onda de cálcio tem sido atribuída a transferência GAP-junção mediada de cálcio ou de baixo peso molecular segundos mensageiros, ou para a libertação de nucleótidos intracelulares das células que, em seguida, se ligam a receptores em células vizinhas [20], [ ,,,0],21], [22]. Vários relatórios demonstraram que extracelular trifosfato de adenosina (ATP) reparação nas culturas interrompidas promovida pela estimulação da proliferação e migração das células epiteliais [15], [18]. Recentemente, o aumento dos níveis de ATP extracelular foram visualizados no desenvolvimento de tumores in

in vivo

, e pode contribuir para a sobrevivência de células de cancro [23].

nucleótidos extracelulares modular de cálcio intracelular através da ligação a uma família de receptores chamados receptores purinérgicos P2, cada um dos quais tem uma afinidade diferente para nucleotídeos específicos. Existem duas sub-classes de receptores de P2: os receptores P2X triméricos canais fechados de iões e os receptores da proteína G-acoplada (GPCRs) P2Y. Ligação a um receptor P2X conduz a uma alteração conformacional no canal que permite o influxo de cálcio e outros iões, ao passo que P2Y é um receptor acoplado a proteína G que utiliza a energia de GTP-hidrólise para fosforilar a fosfolipase C (PLC) a seguir à ligação do ligando . PLC pode então clivar o lípido, fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2), em inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacil-glicerol (DAG). IP3 liga-se canais de iões de cálcio específicos no retículo endoplasmático para a libertação de cálcio para o citosol. Dos 12 receptores P2Y, única P2Y

2 foi mostrado para tanto ATP e ligam-se par com a subunidade G

q de proteína G para iniciar a libertação de cálcio a partir de armazenamento intracelular [24].

aqui demonstramos que o pré-tratamento de células epiteliais em cultura de monocamada com STC1 aumentada dramaticamente a propagação da onda de cálcio após ruptura mecânica das culturas. O mesmo aumento foi observado quando as células foram pré-tratadas com STC1 e expostos a ATP exógeno. Os dados mostram que as células sensibilizadas STC1 em ATP a montante do PLC, e que o bloqueio STC1 endógena utilizando um anticorpo neutralizante progressão da onda de cálcio inibida. Este trabalho fornece a primeira evidência de que STC1 pode modular um evento de sinalização precoce após uma lesão mecânica, e implica STC1 como um regulador da sinalização do receptor purinérgico.

Resultados

STC1 avançado cálcio Propagação de Ondas Seguindo Mecânica estimulação das células A549

para investigar o efeito da STC1 na modulação de cálcio induzida por lesão, monocamadas confluentes de pulmão células epiteliais (A549) foram mecanicamente estimulados a iniciar uma onda de cálcio. propagação da onda foi visualizado por pré-incubação a monocamada com um corante que fluoresce permeável membrana mediante ligação de cálcio (Fluo-4).

Figura 1A (Filme S1 e S2) mostra imagens representativas de propagação de uma onda de cálcio originário do local para raspar as células adjacentes ao longo de 30 segundos. A distância foi quantificada através da medição da distância entre o local de corte e o bordo de ataque da onda de cálcio em cada ponto de tempo. O pré-tratamento de monocamadas com STC1 resultou em um aumento de 4 vezes da propagação da onda de cálcio em 40 segundos pós-raspa (Figura 1B) que continuaram a propagar passado a 40 s ponto de tempo (Filme S2). Para testar se o efeito era tipo específico de célula, repetiu-se estes estudos em uma linha de células de cancro da próstata (PC3; Filme S3, S4). STC1 também reforçada a propagação da onda de cálcio em células PC3.

A) monocamadas A549 confluentes foram marcadas com Fluo-4 e pré-incubadas com ou sem 500 ng /mL STC1 durante 10 min antes da ruptura mecânica. Mostram-se imagens obtidas -1, 0, 10, 20 e 30 s após a interrupção. Imagens de cada grupo foram manipuladas igualmente utilizar a função de limite no Adobe Photoshop, a fim de cor falsa a onda de clareza (vermelho). Seta aponta para a vanguarda da onda. B) a distância percorrida pela onda de cálcio ao longo do tempo nos grupos de tratamento STC1 controle e de bares A. erro = DP média. * = P 0,05. n = 5 filmes. C) A média de distância máxima atingida pela onda de cálcio com ou sem pré-tratamento com 500 ng /mL STC2. NS = não significativo. n = 3.

A seguir, investigou se STC2, o único outro membro da família stanniocalcina de proteínas [25], poderia afetar a progressão da onda de cálcio sob as mesmas condições. STC2 não afetou a onda de cálcio (Figura 1C).

O cálcio Propagação de Ondas foi independente da Gap Junções mas Dependente O ATP extracelular

propagação da onda de cálcio entre as células adjacentes já havia sido atribuída a pequena molécula transferência pela comunicação gap junção intercelular (GJIC) [20], [26]. Para investigar se a CIJH foi responsável pela propagação da onda de cálcio, monocamadas A549 foram pré-tratadas com 10, 25 ou 50 uM de ácido glicirretínico (GA), um inibidor conhecido da CIJH mediada por conexina [27]. A propagação da onda de cálcio não foi afectada, indicando que a resposta de cálcio era independente da CIJH (Figura S1).

Outros relataram que a propagação da onda de cálcio era dependente da libertação de ATP a partir de células lesadas para o ambiente extracelular [18], [28]. Para confirmar que as células lesadas divulgados ATP, monocamadas foram raspadas com uma ponta de pipeta e do meio condicionado foi medido para o conteúdo ATP. O meio condicionado continha 400 vezes mais do que o ATP meio condicionado a partir de células que não tinha sido lesionado (Figura 2A). Para confirmar que as células A549 foram capazes de responder aos ATP por iniciar uma resposta de cálcio, Fluo-4 monocamadas marcadas foram tratadas com ATP e ensaiaram-se por microscopia de fluorescência de células vivas. ATP tratamento aumentou rapidamente a média de intensidade de pixel da região medidos de interesse (Figura 2B). Para investigar se o ATP libertado a partir de células raspadas foi responsável pela resposta de cálcio em células viáveis, os meios foram removidos a partir de monocamadas de A549 e substituída com PBS. A monocamada foi deixado em repouso para gerar ‘Não Injury’ meio condicionado, ou ferido por raspagem para gerar meio condicionado «prejuízo». Nenhum meio de lesões e condicionada foi então colocada sobre as células de Fluo-4 A549 marcados frescos e a resposta de cálcio foi medido por microscopia fluorescente. Lesão meio condicionado induziu uma resposta de cálcio mais robusto do que o controlo Sem prejuízo (Figura 3A; primeiras duas linhas). Pré-tratamento da lesão de meio condicionado com uma enzima que hidrolisa trinucleótidos para mononucleótidos (250 mU /mL de apirase) aboliu completamente a resposta de cálcio. Os mesmos dados foram obtidos através da medição da resposta de cálcio em células individuais. Mais uma vez, pré-tratamento da lesão meio condicionado com apirase aboliu a resposta de cálcio (Figura 3B). Lesão meio condicionado também aumentou a resposta de cálcio no máximo em relação ao controlo sem lesão em células medidos individualmente, o que foi abolido por pré-tratamento com apirase (Figura 3C).

a) Média de ATP conteúdo de meio condicionado de controlo ou mecanicamente A549 monocamadas estimuladas. RLU, unidades relativas de luciferase. As barras de erro = SD. * = P 0,05. n = 3. B) ATP (50 mM) só foi adicionado ao confluentes Fluo-4 células A549 rotulados (linha vertical). resposta de cálcio foi medido por microscopia fluorescente. n = 4 filmes.

A) O meio condicionado a partir viáveis ​​(sem lesão), mecanicamente interrompidos (lesão) ou lisado interrompida mecanicamente tratados com 250 mU /mL apirase durante 10 min. (Lesão + Apirase) foi colocado sobre uma camada confluente de células de Fluo-4 A549 marcados. Coluna da esquerda: Antes da adição de meio condicionado. coluna da direita: 10 s após o tratamento com o meio condicionado. Ampliação = 4 ×. Inset para cada um: Pixel perfil de intensidade para todo campo de visão. inserir imagens para cada grupo de tratamento foram manipulados igualmente usando a função limiar no Adobe Photoshop, a fim de falsa cor dos picos para maior clareza (vermelho). n = 3 filmes. resposta B) de cálcio de 10 células individuais após a adição de lesão ou ferimento + Apirase (250 mU /mL durante 10 min) tratados meio condicionado. Black Arrow: A adição de meio condicionado. Red Arrow: Fundo medida de intensidade. C) a intensidade máxima média para células individuais após a adição de nenhum ferimento, lesão ou ferimento + Apirase meio condicionado. * = P 0,05; n = 30.

STC1 melhor resposta de cálcio Induzido por ATP

Para investigar se STC1 afetou a resposta de cálcio induzida por ATP, Fluo-4 monocamadas A549 marcadas foram pré-tratadas com 500 ng /STC1 mL durante 10 minutos e depois estimuladas com ATP 50 uM. A resposta de cálcio foi então medida por microscopia de fluorescência. STC1 reforçada a fluorescência média de uma região definida de interesse por mais do que 2 vezes (Figura 4A). Para corroborar nossos resultados de microscopia, que quantificou a resposta de cálcio usando espectroscopia fluorescente, o que nos permitiu testar uma ampla gama de concentrações de ATP e STC1. As células A549 foram pré-incubadas com 0, 50, 250, ou 500 ng STC1 durante 10 minutos. Na sequência de uma 4-segunda leitura de linha de base, o ATP foi injectada automaticamente em poços a uma concentração final de 0,5, 2, 10, e 50 uM. STC1 aumentou a resposta de cálcio de uma maneira dependente da dose; No entanto, em doses mais elevadas de ATP, STC1 foi necessária em concentrações superiores a ter um efeito de aumento. Os dados são apresentados como média extremidade resposta de cálcio (Figura 4B), bem como um ensaio contínuo que abrange 30 s (Figura 4C).

a) Média de resposta de cálcio de monocamadas confluentes de Fluo-4 marcadas de células A549 foram analisados ​​pela microscopia de células vivas após a adição de 50 uM de ATP para controlar (ATP) ou de monocamadas de pré-tratadas com 500 ng /mL durante 10 min STC1 (ATP + STC1). As barras de erro = SD. * = P 0,05. n = 3 filmes. B) A média de resposta de cálcio de Fluo-4 monocamadas A549 marcados analisados ​​por espectroscopia de fluorescência após a adição de várias concentrações de ATP e STC1. Os dados são apresentados como a intensidade média do sinal em 25 s depois da adição de ATP. As barras de erro = SD. * = P 0,05. N = 4 para cada condição. C) Ensaios contínuo a partir de B). n = 3 para B, C. D) Medição de células individuais de A revelou oscilações de cálcio prolongados em STC1 pré-tratados amostras.

Notamos que ATP induzida oscilações de cálcio em uma fração pequena (~ 20%) de células em cada condição. Quando as células foram tratadas com STC1, essas oscilações continuou passado três minutos, enquanto que as células de controlo não oscile mais de 1.5 minutos. Não houve diferença observável na frequência das oscilações (Figura 4D).

STC1 avançado cálcio Response Upstream de PLC Activation

nucleotídeo sinalização levando à liberação de cálcio intracelular pode ser induzida pela ligação de ATP quer para a família de receptores P2X canais de iões, ou os receptores P2Y acoplados à proteína G [24]. Para investigar quais destas vias eram responsáveis ​​pela indução de cálcio no nosso modelo, Fluo-4 monocamadas A549 marcadas foram tratados com um antagonista de P2X (NF023), ou antagonistas da via de P2Y (específico do fosfatidilinositol (PI) inibidor PLC, D609, e inibidor PLC , U73122). D609 e U73122 reduzida a distância e a intensidade da onda de cálcio após a estimulação mecânica a 20 s pós raspagem (Figura 5A, B); No entanto, a medição da distância máxima percorrida pela onda revelou que apenas U73122 inibiu completamente a onda de cálcio (Figura 5C). D609 e U73122 também inibiram a activação de cálcio após a adição de ATP exógeno, enquanto que a adição de NF023 não teve qualquer efeito (dados não mostrados). Embora D609 reduzida a distância e a intensidade da onda de cálcio, pré-incubação de células com STC1 restaurada a distância da onda. STC1 foi incapaz de aumentar a onda de cálcio após incubação com U73122 STC1 indicando que era dependente da activação de PLC canónica (Figura 5D).

A) de Fluo-4 células A549 marcadas foram mecanicamente estimuladas na ausência (controlo) ou presença de qualquer um inibidor P2X (50 mM NF023), PI-PLC inibidor da via (50 mM D609) ou inibidor da PLC (12,5 mM U73122) t = 20 s pós-lesão. n = 5. B) Quantificação da distância percorrida pela onda de cálcio a partir de A a t = 20 s. As barras de erro = SD. * = P 0,05. n = 5. C) Fluo-4 células A549 marcados pré-tratadas durante 30 min com NF023, D609, ou U73122 foram incubadas com 500 ng /mL STC1 durante 10 min antes de raspar. A distância máxima da onda de cálcio é apresentada. As barras de erro = SD. * = P 0,05. n = 3.

STC1 foi necessária para a propagação de Mecânica e cálcio ATP Induzida Onda

A observação de que STC1 estava agindo a montante do PLC nos levou a investigar o efeito da STC1 endógena na propagação da onda de cálcio após a estimulação mecânica. As células A549 foram pré-incubadas com anticorpo anti-STC1 1 ug /mL de anticorpo policlonal que se tinha mostrado previamente para ser eficaz em bloquear STC1 [10]. As células foram então estimuladas mecanicamente e a distância da onda de cálcio foi medida. Pré-tratamento das células com anticorpo anti-STC1 reduzida a distância percorrida pela onda de cálcio em comparação com células pré-tratadas com um anticorpo de controlo de isotipo. Da mesma forma, o pré-tratamento das células com apirase reduzida a distância percorrida pela onda de cálcio (Figura 6A, B). Além disso, o grupo tratado com anti-STC1 exibida uma recessão rápida da onda de cálcio (Figura 6B), bem como a diminuição na resposta de cálcio adjacente ao local de raspagem, tal como medido por microscopia de fluorescência (Figura 6C; Filme S5).

a) de Fluo-4 monocamadas A549 marcadas foram mecanicamente estimuladas na presença de anticorpo de isotipo (controlo), um anticorpo STC1 bloqueio (anti-STC1; 1 ug /ml) ou apirase (250 mU /ml) e ensaiadas por células vivas microscopia. B) Distância do cálcio propagação da onda de bares A. erro = SD. * = P 0,05. C) Quantificação de intensidade de sinal adjacentes para raspar local após a estimulação mecânica. As barras de erro = SD. * = P . 0,05

STC1 reforçada a libertação de ATP a partir de células

in vitro

e

in vivo

Estamos próximos testaram se STC1 afetou a liberação de ATP a partir de células epiteliais não estimuladas. Média a partir de células A549 foi substituído com meio isento de soro com ou sem 500 ng /ml durante 10 minutos STC1 e um ensaio do ATP foi realizado. Médio de células tratadas STC1 continha duas vezes mais ATP (Figura 7A). Nenhuma diferença significativa foi observada em lisados ​​destas células. os níveis de ATP foram normalizados para o teor de ADN em cada poço. Resultados semelhantes foram obtidos a partir de fibroblastos de rato embrionários a partir de tipo selvagem e ratinhos transgénicos STC1 (Figura 7B). As células A549

A) foram estimuladas com 500 ng /ml durante 10 minutos STC1. O meio condicionado foi recolhido e ensaiado para o ATP. As células aderentes foram lisadas e medido para o ATP e o teor de ADN. Os valores de ATP foram normalizados para a fluorescência de ADN. * = P 0,05; n = 3. B) As células A549 foram estimuladas com ATP 10 uM durante 2, 5 e 10 minutos. Ensaio de meio condicionado e celulares lisados ​​de tipo selvagem e STC1 sobre-expressar MEFs. * = P 0,05; n = 3. C) O soro foi isolado a partir de tipo selvagem e ratinhos transgénicos STC1 e ensaiadas para teor de ATP. * = P 0,05; n 17.

Os resultados sugerem a possibilidade de que o nível sistémico de ATP pode ser elevado em ratinhos transgénicos STC1. Para investigar esta hipótese, o plasma do tipo selvagem e ratinhos transgénicos que sobre-expressam STC1 foram recolhidas e um ensaio do ATP foi realizado. Os ratos que expressam o transgene STC1 humana mostraram aumento dos níveis de ATP sanguínea em comparação com os controlos de tipo selvagem (Figura 7C).

Discussão

Observações anteriores sugeriram que STC1 é a proteína de resposta ao estresse. A proteína STC1 é 80% idêntica entre os peixes e humano, e 98% idêntica entre murganhos, ratos, seres humanos e outros mamíferos [29]. camundongos knockout STC1 não exibir qualquer fenótipo evidente [30]; No entanto, o aumento dos níveis de STC1 pode alterar a função muscular e o desenvolvimento de osso e diminuição reprodução [31], [32]. Os níveis de ARNm STC1 foram rapidamente regulado positivamente durante hipoxia e após a exposição a várias citóquinas incluindo o factor alfa de necrose tumoral, factor de crescimento transformante beta, e factor de crescimento de fibroblastos-2 (G. bloco, dados não publicados). Tomados em conjunto, estas observações suportam ainda mais a conclusão de que STC1 modula a sinalização durante os primeiros eventos de a resposta celular ao stress.

De modo a investigar o papel de STC1 em stress, que empregue um modelo de lesão em que epitelial monocamadas foram interrompidas com um estímulo mecânico recapitular os eventos iniciais da reparação da ferida [15], [28], [33]. Descobrimos que STC1 aumentou a velocidade e a distância máxima da propagação de uma onda de cálcio dependente de ATP. STC2 não afectar a progressão da onda de cálcio uma vez que o pré-tratamento de células com STC2 não alterou a distância máxima percorrida pela onda. Nós também deduzir-se que STC1 era dependente da activação de PLC numa via do receptor P2Y acoplados à proteína G desde o inibidor PLC, U73122, foi capaz de bloquear a propagação da onda de cálcio na presença ou ausência de STC1. Além disso, o bloqueio funcional de STC1 endógena utilizando um anticorpo inibiu a propagação da onda de cálcio.

A ubiquidade da sinalização de nucleótidos é reflectida pela vasta distribuição de receptores P2 em vários tipos de células [24]. A nossa observação de que STC1 pode mediar a activação de cálcio a jusante de ATP em células epiteliais do pulmão podem também ser aplicável a outros tipos de células e tecidos. Por exemplo, as observações que STC1 agiu como um inibidor da L-canal selectivo [34] paralelo as primeiras observações que o ATP pode reduzir a frequência cardíaca após choque traumático [35], [36]. Além disso, o envolvimento de ATP extracelular na regulação da quimiotaxia de macrófagos [16], [18], [37], [38], [39] foi semelhante foi definido para STC1 [7]. Além disso, os nossos resultados sugerem que a modulação da sinalização STC1 purinérgico podem contribuir para os fenótipos evidentes exibidos pelos ratinhos transgénicos que expressam constitutivamente STC1.

Embora STC1 melhora a resposta de cálcio a jusante de nucleotídeos extracelulares em células epiteliais, o mesmo pode não ser verdadeiro em outros tipos de células. Por exemplo, STC1 foi mostrado activar a sinalização de cálcio em células endoteliais [9], mas inibir a sinalização de cálcio em resposta a MCP-1 em macrófagos [7]. No nosso ensaio, STC1 não teve efeito sobre a dinâmica do cálcio quando adicionado sozinho a células A549 (Filme S6). Além disso, o ATP não pode induzir a libertação de cálcio em todos os tipos de células, uma vez que o ATP é um potente supressor de activação de cálcio em neurónios do hipocampo [40], [41]. Os efeitos variáveis ​​de ATP também estão reflectidas na sensibilidade das células ao ATP, tal como tipos de células diferentes requerem diferentes concentrações de ATP extracelular para eliciar um efeito. Enquanto as células A549 responder a tão pouco quanto 0,5 ^ M de ATP, macrófagos geralmente precisam de 100? M, a fim de responder [42]. STC1 pode desempenhar um papel na sensibilização ou células a várias concentrações de ATP dessensibilizar.

As consequências a jusante da ativação STC1 mediada por uma resposta de cálcio induzida por ATP poderia ter ramificações importantes para pistas microambiente levando ao estresse-respostas normais a insultos mecânicas e, potencialmente, tóxicos. Por exemplo, o papel de STC1 na reparação de uma ferida epitelial pode ser com base na sua capacidade para promover ou prevenir a apoptose de células de ATP [43] estimulada. O papel de STC1 na sinalização purinérgico das membranas celulares ou organelos pode ter implicações importantes para o movimento de cálcio dentro e a jusante entre células lesadas. Este tem sido um desafio, em parte, por causa da falta de bioensaios disponíveis para STC1. O trabalho que apresentamos aqui estabelece um bioensaio para a atividade STC1 para facilitar uma compreensão mais profunda da sua estrutura e função em uma variedade de tipos de células e situações fisiológicas.

Declaração de Ética Materiais e Métodos

os ratos foram alojados e utilizado de acordo com os protocolos aprovados pelo Conselho Universitário on animal Care da Universidade de Western Ontario.

Cultura de células e Reagentes

A549 Humano epitelial câncer de pulmão células cancerosas e células da próstata PC3 foram obtidas a partir da American Type Tissue Culture Colecção (Manassas, VA; www.atcc.org). Fibroblastos de rato e de plasma embrionários foram obtidos a partir de ratinhos transgénicos de tipo selvagem e STC1 humana como descrito anteriormente [44]. Todas as células foram mantidas em Minimal Essencial Meios de Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA; www.invitrogen.com) contendo soro fetal bovino a 10% (Atlanta Biologicals, Norcross, GA; www.atlantabio.com) e 100 U de penicilina /100 ug de estreptomicina (Invitrogen). Os reagentes foram compras nas seguintes fontes: ATP a partir de Teknova (Hollister, CA; www.teknova.com); apirase a partir de New England Biolabs (Ipswich, MA; www.neb.com); ácido glicirretínico a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO; www.sigmaaldrich.com); STC1 humana recombinante e STC2 como uma proteína de fusão FLAG-Tagged preparado a partir de células humanas a partir de BioVendor (Modrice República Checa; www.biovendor.com); anticorpos policlonais de cabra e monoclonal (clone 380715) STC1 anti-anticorpo de R D Systems (Minneapolis, MN; www.rndsystms.com) e os inibidores NF023 e D609 da Sigma Aldrich

O cálcio Dye Labeling

para medir alterações nos niveis de cálcio intracelular, as células foram marcadas com corante Fluo-4 n-lavagem (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, corante liofilizada foi reconstituída com 10 ml de tampão de ensaio (1X HBSS sem cálcio e magnésio, com tampão HEPES 20 mM), e suplementado com 100 ul de ácido probenecida para evitar que o corante de vazar a partir das células, de acordo com as instruções do fabricante. As células cultivadas em placas de cultura de 48 poços foram incubadas em 200 ul de Fluo-4 durante 30 min antes da visualização por microscopia de células vivas ou ensaio contínuo por espectroscopia de fluorescência.

inibidor e anticorpo bloqueador Ensaios

NF023 (50 uM), D609 (50 uM), U73122 (12,5 pM), e anti-STC1 (1 ug /mL) foi adicionada directamente ao 200 uL de Fluo-4 tampão de ensaio contendo Fluo-4, e incubou-se ao lado do Fluo -4 durante 30 minutos antes da coleta de dados como as células assumiu o corante. Todas as concentrações de inibidor foram optimizadas em experiências preliminares utilizando duas diluições em série a partir de 100 uM a 50 nM. A concentração eficaz foi determinada como a menor concentração de exercer um efeito, embora no caso de NF023, nenhum efeito foi já observada. As experiências iniciais utilizando ácido glicirretínico (5 uM a 100 uM) foram realizados por pré-incubação das células durante 30 minutos ao mesmo tempo que estavam a ser incubadas com Fluo-4 corante.

Imagens de células vivas e ruptura mecânica

As células foram fotografadas ao vivo usando um Ti Eclipse Nikon invertido microscópio de fluorescência (Nikon Instruments Inc .; Melville, NY; www.nikoninstruments.com). Células e microscópio foram envolto em uma câmara ambiental de 37 ° C (In Vivo Científico; St Louis, MO; www.invivoscientific.com). As imagens foram tiradas a 2 quadros /seg durante pelo menos 1 minuto, utilizando software de NIS Elementos. Um objetivo 4X foi usada (CFI Plano Fluor 4X /0,13 17,1 milímetros; Nikon Instruments). Fluo-4 foi animado utilizando um filtro de excitação de 488 nm, e detectada a 520 nm de emissão

A estimulação mecânica de células A549 foi realizada manualmente, criando um arranhão linear com uma ponta de pipeta p200 dobrada (epTIP;. Eppendorf, Hamburgo Alemanha, www.eppendorf.com). A fim de exibir as ondas de cálcio em cada figura com mais clareza, todas as imagens em cada condição foram ajustados simultaneamente usando a função limite Adobe Photoshop de modo que os pixels acima de um limite arbitrariamente definida ficou vermelho.

espectroscopia de fluorescência

Fluo-4 cultivadas células marcadas em 48 ou placas de 96 poços foram incubadas a 37 ° C num espectros otómetro de fluorescência equipado com dois injectores de reagentes (Fluostar Omega, o BMG Labtech, Offenburg, Alemanha; www.bmglabtech.com). O primeiro injector foi programado para entregar doses crescentes de ATP após a leitura de base 4 seg. O segundo injector foi programado para entregar tampão reagente antes do ATP de modo que o volume para cada leitura permaneceu constante. Os poços foram testados a emissão 480 exitation /520. Os dados de cada linha de base subtraída condição. medições de intensidade de fluorescência foram tomadas a cada 0,5 segundos a 480 atividade e analisados ​​utilizando o software de análise de dados BMG Omega Software e Microsoft Excel.

In Vitro

ATP Ensaios

ATP foi ensaiada utilizando um protocolo com base em luciferase de acordo com as instruções do fabricante (CellTitre-Glo, Promega; www.promega.com). A fim de quantificar indirectamente o número de células, 20 mL de reagente de luciferase foi suplementada com 50 uL de um corante intercalante de ADN (CyQUANT; Invitrogen). Um único volume de reagente foi adicionada a um volume igual de meio condicionado. Metade da amostra foi, em seguida, ensaiados quanto a luciferase e o resto por fluorescência (480/520 exitation /emmision) utilizando um leitor de placas capaz de detectar tanto fluorescência e luminescência (Fluostar Omega, o BMG Labtech).

ATP no Ensaio rato Plasma

o sangue foi coletado de ratos STC1 humano transgénico masculino (linha 2) [32] e os machos do tipo selvagem (2-4 meses de idade) do mesmo fundo genético (C57BL /6 x CBA), utilizando heparina para impedir a coagulação. Tipicamente, 300-400 uL foi recolhido por ratinho e imediatamente misturado com solução de paragem à temperatura ambiente para minimizar a libertação de ATP a partir de plaquetas e a degradação do ATP pela ATPase [45]. A solução de paragem foi EDTA 3 mM, NaCl 118 mM, KCl 5 mM, tampão de tricina 40 mM, 5 nM nitrobenzilo tioinosina, 10 uM de forscolina, 100 uM isobutilmetilxantina. O sangue foi imediatamente centrifugado a 13000 × g durante 3 minutos à temperatura ambiente e 50 mL de plasma foi utilizado em duplicado, para realizar medições indirectas ATP usando o CellTiter-Glo Assay (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. O sinal luminescente foi medida utilizando um luminómetro Berthold Lumat LB9507 e as unidades de luz relativas foram convertidas em concentrações de ATP utilizando uma curva padrão.

e análise de imagens do filme

A análise de imagem foi realizada utilizando o software Nikon NIS Elementos (Nikon) ou ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij). A fim de quantificar a distância da onda de cálcio, as imagens foram obtidas 10, 20, 30 e 40 s após a raspagem. Para cada imagem, 5 linhas foram traçada perpendicularmente à borda da raspagem com a ponta da onda de cálcio. Distâncias das linhas foram gravadas e em média por mais de 5 filmes por condição.

Análises Estatísticas

Onde dois meios são objecto de comparação, uma t-teste bilateral foi realizada usando o Microsoft Excel. Em circunstâncias em que mais de dois meios foram sendo comparados, a hipótese nula foi rejeitada através de uma análise de variância. As contagens foram analisados ​​por meio de uma tabela de contingência e qui-quadrado de teste multi-variável usando software estatístico InStat.

Informações de Apoio

Figura S1.

cálcio Propagação de Ondas foi independente da Gap junção intercelular comunicação. As monocamadas foram mecanicamente A549 estimuladas seguinte com pré-incubação com 10, 25 ou 50 uM de ácido glicirretínico e ensaiaram-se por microscopia de células vivas. . Ampliação = 40 ×

doi: 10.1371 /journal.pone.0010237.s001

(0,30 MB TIF)

Filme S1.