Sumário

cancro renal metastático manifesta várias assinaturas de expressão gênica. Desvio de expressão de miARN maduro tem sido associada a cancros humanos. Importância de miR-21 em carcinomas de células renais é proposta a partir de estudos de perfil usando amostras de tecido do tumor. No entanto, o papel de miR-21 em função de causar a proliferação de células do cancro renal e invasão ainda não foi mostrado. Usando células cultivadas de carcinoma renal, que demonstram uma maior expressão de miR-21 maduro juntamente com pré-e pri-miR-21 por transcrição aumentada em comparação com as células epiteliais tubulares proximais normais. A sobre-expressão de miR-21 da esponja para extinguir níveis endógenos de miR-21 inibiu a proliferação, a migração e a invasão de células de cancro renal. Na ausência de uma mutação no gene supressor de tumor PTEN, os níveis de proteína PTEN são frequentemente regulados negativamente no cancro renal. Mostra-se que a região de miR-21 alvos de ARNm de PTEN 3’untranslated para diminuir a expressão da proteína PTEN e aumenta a fosforilação de Akt em células de cancro renal. Regulação negativa de PTEN, bem como a sobre-expressão da quinase Akt constitutivamente activos inibem a inibição induzida pela esponja de miR-21 da proliferação de células do cancro renal e migração. Além disso, mostramos que o miR-21 inibiu a fosforilação da esponja inactivação da proteína supressora de tumor tuberina e atenuado activação TORC1. Finalmente, foi demonstrado que a expressão de TORC1 constitutivamente activa atenuada supressão miR-21 Esponja mediada por proliferação e migração de células de cancro renal. Nossos resultados descobrem uma camada de regulação pós-transcricional de PTEN pela ativação transcricional de miR-21 para forçar o canônica oncogênico Akt /TORC1 conduta de sinalização para conduzir a proliferação de células de câncer renal e invasão

Citation:. Dey N, Das F, Ghosh-Choudhury N, Mandal CC, Parekh DJ, Bloco K, et al. (2012) microRNA-21 governa TORC1 Activation em Câncer Renal proliferação celular e invasão. PLoS ONE 7 (6): e37366. doi: 10.1371 /journal.pone.0037366

editor: Soumitro Pal, do Hospital Infantil de Boston Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Dezembro, 2011; Aceito: 20 de abril de 2012; Publicação: 04 de junho de 2012

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. A United States National Institutes of Health (NIH) SR1 DK50190 subvenção para GGC apoiaram este trabalho. Parte deste trabalho foi apoiada também por VA Research Service concessão Mérito Review para GGC. GGC é também apoiada pela Juvenile Diabetes Research Foundation 1-2008-185 subvenções e é destinatário da VA Scientist Award Carreira Investigação Senior. NGC é suportado por VA Mérito Review, NIH RO1 AR 52425 subvenções e Ronald Award P. Williams Ortopédica Oncologia Developmental Uma pesquisa da terapia do cancro e Centro de Pesquisa, San Antonio, Texas. KB, BSK e HEA são suportados por concessões, NIH RO1 CA 131272 (KB), NIH RO1 DK 077.295 (BSK), NIH RO1 DK078971 (HEA), NIH RC2a 036.613 (BSK) e VA Prêmio Pesquisador serviço de carreira (KB) e mérito Revisão concessões (KB, BSK e HEA)

competir interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma renal representa a mais comum. malignidade renal; cerca de 70.000 novos casos foram relatados no ano de 2011 (www.cancer.gov). Entre os cinco subtipos, carcinoma de células renais claras (RCC) é responsável por cerca de 70% dos casos [1]. Cerca de 30% dos pacientes com CCR desenvolver doença invasiva comumente metástases para o osso, pulmão, cérebro e fígado [2], [3]. A perda de expressão de proteína de VHL (Von Hippel-Lindau) devido a uma mutação de linha germinal, a mutação somática biallellic ou hipermetilação do locus do gene coloca um elevado risco de claras de carcinoma de células renais, os hemangiomas e feocromocitomas [4], [5]. expressão BVS defeituoso provoca a estabilização de factores de transcrição Hifα, que contribuem para o aumento da expressão do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) para manter a natureza vascular do tumor. Além disso, Hifα regula a respiração anaeróbica frequentemente encontrada em RCC [5]. Hifα função independente de VHL foi reportado na condução de carcinoma do rim, incluindo a regulação da senescência [5], [6]. Além disso, a BVS tumores renais positiva utilizar mecanismos alternativos para aumentar fatores de transcrição Hifα para a expressão de VEGF, e, Hifα independente de regulação positiva do receptor do factor de crescimento [5], [7].

miRNAs são oligonucleotídeos não-codificantes curtas com complementaridade imperfeita predominantemente para a região 3’untranslated (UTR) de mRNAs alvo [8], [9], [10]. Cerca de 1000 miARNs em humanos regular a expressão de um terço do transcriptoma total de codificação de proteínas ao nível pós-transcricional e translacional [9]. miARNs predominantemente actuam por inibição da tradução do mRNA, embora a degradação do mRNA e a clivagem de mRNA também pode contribuir para a regulação negativa dos níveis de proteína. expressão inapropriada de miARNs têm sido associados à oncogénese [10], [11]. miARNs são codificados pelas sequências intrónicas e intergénicas, bem como de exões no genoma [12]. Eles são sintetizados predominantemente pela RNA polimerase II transcrição dependente para produzir pri-miRNA hairpin, que liga complexo Drosha /DGCR8. A cadeia dupla de proteína de ligação a ARN DGCR8 reconhece as bases proximais (~ 10 pb) do pri-miARN caule, seguido pela sua clivagem pela enzima ARNase III Drosha para libertar o gancho de cabelo curto pré-miARN [13]. Exportina-5 e o seu parceiro Ran-GTP induzir exportação nuclear do pré-miR para o citoplasma, onde é processado pela ARNase III Dicer /TRBP para se obter ± 22 nucleótidos de ARN pequeno duplex. O fio guia, então é incorporada efetoras Argonaute complexo para formar RISC (complexo de silenciamento induzido por ARN) e de se ligar com a complementaridade imperfeita ao mRNA para a repressão de translação [12].

Relatórios recentes estabeleceram um papel firme específica miARN assinatura na tumorigénese renal. experimentos de perfil mostrou que mais miRNAs são regulados negativamente em RCC do que regulada [14], [15], [16], [17]. Por exemplo, em uma tela inicial de 470 miARNs, apenas seis miARNs foram encontrados para ser regulada positivamente em carcinoma de células renais, enquanto 15 foram regulados negativamente [16]. Em outro estudo, apenas dois foram miARNs aumentada no CCR incluindo miR-21 ao passo que a expressão de 17 miARNs foi diminuída [17]. Da mesma forma, um relatório mais recente mostrou um aumento da expressão de miR-21 entre 9 miARNs enquanto que a expressão de 26 miARNs foi suprimido [14]. Recentemente, um estudo extensivo utilizando um grande número de amostras de cancro de tumores sólidos diferentes 31 descrito um aumento significativo de miR-21 sugerindo a sua função na oncogénese [18]. No entanto, o seu papel funcional em muitos cancros, incluindo carcinoma renal não foi elucidado. No presente estudo, nós achamos aumento da expressão de madura, pré e pri-miR-21 em células de cancro renal em comparação com as células epiteliais tubulares proximais normais. Este aumento de miR-21 estava associada com níveis diminuídos de PTEN. Neutralização de miR-21 impediu a proliferação, migração e invasão destas células com o aumento concomitante de PTEN e reduzida tuberina fosforilação e activação mTORC1.

Resultados

aumento da expressão de miR-21 em células renais Carcinoma

perfil de expressão de miARN usando amostras tumorais de pacientes com carcinoma renal foi avaliado. Em três estudos, foi encontrada a expressão de miR-21 a ser aumentado [14], [17], [19]. No entanto, em outro estudo no carcinoma renal de células claras 16 e as amostras de carcinoma renal 4 chromophobe, miR-21 não foi detectado [16]. Foi utilizado um painel de tecidos de tumor a partir de carcinomas de células renais claras para detectar a expressão de miR-21 madura. em tempo real de qRT-PCR revelou marcadamente aumentou a expressão de miR-21 madura em todos grau 2 (3 de 3) e de grau 3 (3 de 3) amostras de carcinoma das células renais (Fig. S1A e S1B). Em seguida, foi investigada a expressão de miR-21 em células de carcinoma renal ACHN. Encontramos aumentou significativamente a expressão de miR-21 madura em células ACHN, em comparação com as células normais HK2 proximais epiteliais tubulares (Fig. 1a). Resultados semelhantes foram obtidos em uma outra linha celular de cancro renal Caki-2 (Fig. S2). Relatórios recentes mostram que o miR-21 é regulada ao nível da maturação [20]. Portanto, nós examinamos os níveis de pré-miR-21. em tempo real de qRT-PCR mostrou marcado expressão de pré-miR-21 em células em comparação com ACHN HK2 células (Fig. 1B). De modo semelhante, a expressão aumentada de pri-miR-21 também foi detectado nas células ACHN (Fig. 1C). Este aumento na pri-miR sugerido um mecanismo transcricional da expressão de miR-21. Para examinar directamente a regulação da transcrição de miR-21 de expressão, utilizou-se um miR-21-driven promotor construção repórter de luciferase de pirilampo (de miR-21-Luc). Os ensaios de transfecção transiente em células ACHN revelou aumento significativamente a transcrição do gene repórter (Fig. 1D). Estes resultados indicam que o aumento dos níveis de miR-21 madura em células de carcinoma renal pode resultar do aumento da transcrição de gene de miR-21 para produzir pri-mir-21

(A – C). Os ARNs totais de proximal HK2 células epiteliais tubulares e células de cancro renal ACHN foram usadas para detectar madura miR-21 (painel a), pré-miR-21 (painel B) e pri-miR-21 (painel C) por tempo real de qRT-PCR, como descrito no Materiais e métodos. Média ± EP de 4 medições é mostrado. Nos painéis A e B, * P = 0,004 vs células HK2. No painel C, * p = 0,02 contra células HK2. (D) As células ACHN HK2 e foram transfectadas com o repórter miR-21-Luc, juntamente com o plasmídeo de Renilla nula. Os lisados ​​celulares foram usados ​​para determinar a actividade de luciferase tal como descrito nos Materiais e Métodos. Média ± SE de 6 medições é mostrado. * P = 0,001 vs células HK2. (E) aumento da fosforilação de p65 de NFkB em células de cancro renal. Os lisados ​​de células HK2 e ACHN foram imunotransferidas com anticorpos fosfo-p65 (Ser-536), p65 e de actina. (F) p65 mutante S536A inibe a transcrição de miR-21. células de câncer renal ACHN foram cotransfectadas com miR-21-Luc e vector de expressão de p65 S536A. A actividade de luciferase foi determinada nos lisados ​​celulares. Média ± SE de medições em quadruplicado é mostrado. * P = 0,02 vs vetor. painéis inferiores mostram a expressão do p65 marcada com HA S536A e actina.

A transcrição do gene de miR-21 foi recentemente mostrado para ser regulada por NFkB [21]. NFkB é regulada no cancro renal [22], [23]. A actividade de transcrição da subunidade p65 de NFkB é dependente da sua fosforilação de Ser-536 [24]. Assim, examinamos a fosforilação de p65. Como mostrado na Fig. 1E, fosforilação de p65 em Ser-536 foi significativamente aumentado nas células de cancro renal ACHN em comparação com as células HK2. Além disso, níveis elevados de p65 também foram observadas (Fig. 1E, painel do meio). Em seguida, testou-se o envolvimento de NFkB na transcrição de miR-21 em células de cancro renal. repórter miR-21-Luc foi co-transfectadas quer com o mutante S536A de p65 ou com um plasmídeo vector. Expressão de p65 S536A inibiu significativamente a actividade repórter nas células ACHN. Estes dados indicam que a regulação positiva de miR-21 pode ser em parte devido ao aumento da actividade NFkB em células de cancro renal.

miR-21 regula a proliferação e invasão de células de câncer renal

miR-21 é considerado ser um onco-miR em muitos cancros. No entanto, o seu papel no carcinoma de células renais não tem sido explorado. Portanto, testou-se o envolvimento de miR-21 em mitogénese de células ACHN, utilizando um vector de plasmídeo que expressa sete cópias do local de ligação de miR-21 abaulada colocado na extremidade 3 ‘de CMV-driven promotor GFP ARNm (Fig. S3) [ ,,,0],25]. A expressão deste construto serve como uma “esponja” que mata os níveis de endógena miR-21 [25], [26]. ACHN células foram transfectadas com esta construção (miR-21 da esponja). a síntese de ADN foi medida como

incorporação de 3H-timidina. Expressão de miR-21 Esponja síntese de ADN significativamente inibida em células ACHN (Fig. 2A e Fig. S4A). Para confirmar esta observação, foi realizado ensaio de proliferação através da contagem do número de células após a transfecção de miR-21 da esponja. Expressão de miR-21 Esponja suprimiu o crescimento celular (Fig. 2B e Fig. S4B).

ACHN células foram transfectadas com o miR-21 esponja ou plasmídeos vectores. células privadas de soro (A) foram incubadas com

3H-timidina e a sua incorporação no ADN foi determinada tal como descrito nos Materiais e Métodos [115]. A média ± SE de 12 medições é mostrado. * P = 0,004 vs sozinho vetor. (B) As células foram contadas em períodos de tempo indicados, tal como descrito nos Materiais e Métodos. Diamond e símbolos quadrados representam vector e as células miR-21 Sponge-transfectadas, respectivamente. Média ± SE de medições em triplicado são mostrados. * P 0,05 vs vector sozinho. (C) As células privadas de soro foram semeadas sobre a membrana numa câmara de trans-bem. ensaio de migração foi realizada e as células que migraram no lado oposto da membrana foram coradas, como descrito nos Materiais e Métodos [111]. (D) As manchas nas células migradas no painel C foram eluidas, tal como descrito nos Materiais e Métodos [111]. Média ± SE de medições em triplicado é mostrado. * P 0,0001 contra células transfectadas com vector. (E) células privadas de soro transfectadas foram semeadas sobre a membrana incorporado por colágeno em uma câmara de trans-bem. ensaio de invasão foi realizada e as células invadidas no lado oposto da membrana foram coradas, como descrito nos Materiais e Métodos [111]. (F) As manchas nas células invadidas no painel E foram eluidos como descrito nos Materiais e Métodos [111]. Média ± SE de medições em triplicado é mostrado. * P . 0,001 vs células transfectadas com vector

carcinoma de células renais é muitas vezes altamente metastático. Testou-se se o miR-21 controla a migração de células usando o ensaio de câmara de ACHN-trans bem. As células cultivadas em meio isento de soro, na parte superior da membrana migrado para a parte inferior da membrana (Fig. 2C, painel A). Expressão de miR-21 Esponja impediu a migração de células ACHN (Fig. 2C e Fig. S4C). A quantificação destes resultados mostra uma inibição significativa da migração de células de cancro renal em resposta a miR-21 da esponja (Fig. 2D).

O passo inicial na metástase consiste de invasão local por células cancerosas (intravasamento). Para examinar o potencial metastático de células de câncer renal ACHN, que empregou um ensaio de invasão usando membranas embebidos em colágeno em Trans-poços. transfectadas com vector ACHN células mostrou invasão acentuada (Fig. 2E, painel a). Expressão de miR-21 Esponja bloqueou a invasão de células de tumor (Fig. 2E e a Fig. S4D). Quantificação mostrou inibição significativa da invasão de células ACHN por miR-21 Sponge (Fig. 2F).

miR-21 Alvos PTEN em células de cancro renal

A mutação no gene supressor de tumor PTEN ou a sua reduzida expressão contribuir para a tumorigénese e metástase de muitos cancros [27], [28]. No entanto, a mutação PTEN não é freqüentemente encontrado em carcinoma de células renais [29]. PTEN foi validado para ser um alvo de miR-21 [30]. Nós investigamos os níveis de PTEN em células de cancro renal ACHN. Como mostrado na Fig. 3A, a abundância de PTEN em ACHN foi significativamente reduzida quando comparada com a HK2 em células. Resultados idênticos foram obtidos em Caki-2 linha de células de carcinoma renal (Fig. S5A). PTEN reduz os níveis de PIP

3, que controla a fosforilação /activação de Akt [27], [31], [32]. PTEN níveis reduzidos em ACHN e células Caki-2 foram associados com o aumento da fosforilação de Akt na Thr-308 e Ser-473 (fig. 3B e fig. S5B), indicando a sua activação [32].

(A ) Os lisados ​​de células a partir de três poços independentes de células HK2 e ACHN foram imunotransferidas com anticorpos PTEN e actina. (B) Os mesmos lisados ​​celulares foram coradas imunologicamente com anticorpos (Ser-473) e Akt, fosfo-Akt fosfo-Akt (Thr-308).

Em seguida, examinamos se miR-21 alvos PTEN . Foi utilizado um constructo repórter em que o 3 ‘UTR do ARNm de PTEN é clonado a jusante do gene da luciferase do pirilampo (Luc-PTEN 3’ UTR) [25]. ACHN células foram transfectadas com este vector e repórter ou miR-21 plasmídeo de expressão. Expressão de miR-21 inibiu significativamente a actividade repórter (Fig. 4A e Fig. S6A). Para confirmar esta observação, foi utilizado miR-21 Esponja. Expressão de miR-21 aumentou acentuadamente a esponja a actividade da luciferase de PTEN 3 ‘UTR-Luc (Fig. 4B e Fig. S6B). Estes resultados sugerem que em células de cancro renal, PTEN pode ser um alvo a jusante de miR-21. Para testar isso, nós examinamos o nível de proteína PTEN em células ACHN miR-21 Sponge-transfectadas. miR-21 aumentou a esponja de abundância de PTEN (Fig. 4C e a Fig. S6C), concomitante com a diminuição da fosforilação de Akt na Thr-308 e Ser-473 (Fig. 4D).

(A e B) ACHN células foram transf ectadas com pCMV-miR-21 plasmídeo de expressão de (A) ou o miR-21 da esponja (B) e o vector, juntamente com a construção repórter PTEN 3’UTR-Luc. Os lisados ​​celulares foram usados ​​para determinar a actividade de luciferase tal como descrito nos Materiais e Métodos. Média ± SE de 6 medições é mostrado. No painel A, * p = 0,02 contra o vector sozinho. No painel B, * p = 0,002 vs sozinho vetor. (C e D) Os lisados ​​de células ACHN miR-21 Esponja-transfectadas foram coradas imunologicamente com PTEN e anticorpos de actina (painel C), e fosfo-Akt (Ser-473), anticorpos (thr-308) e Akt fosfo-Akt (painel D).

miR-21 Regula Câncer renal proliferação e migração celular via PTEN /Akt Axis

Os resultados acima sugerem que miR-21 promove a ativação da Akt, diminuindo os níveis de PTEN em renal células de cancro (Fig. 4). Para investigar directamente o papel desta via de sinalização na proliferação de células do cancro renal, que as células transfectadas ACHN e Caki-2 com miR-21 de esponja e siRNAs segmentação PTEN (siPTEN). Como esperado, o miR-21 Esponja inibiu a síntese de ADN (Fig. 5A e a Fig. S7A). Em contraste, a transfecção de siPTEN preveniu significativamente a inibição induzida pela esponja de miR-21 da síntese de ADN (Fig. 5A e as Figs. S7A, S7B e S7C). Da mesma forma, siPTEN reverteu a diminuição na proliferação de células induzida por ACHN miR-21 da esponja (Fig. 5B e Fig. S8). Em seguida, determinou-se o efeito de siPTEN em ACHN e migração de células Caki-2. Expressão de miR-21 diminuiu a migração de esponja de ambas as linhas de células de cancro renal. siPTEN suprimiu significativamente o efeito inibitório de miR-21 esponja sobre a migração de células (Figs. 5C, 5D e as Figs. S9 e S10).

ACHN células foram transfectadas com o miR-21 juntamente com esponja piscinas siRNA alvejando ARNm de PTEN como indicado. (A)

incorporação de 3H-timidina foi determinada como descrito nos Materiais e Métodos [115]. Média ± SE de 6 medições é mostrado. * P 0,05 vs vector; ** P 0,05 vs células miR-21 Esponja-transfectadas. (B) As células transf ectadas foram contadas em períodos de tempo indicados. O diamante símbolos, quadrado e cruz representam vetor, miR-21 Esponja e miR-21 Sponge além de piscina siRNA contra PTEN, respectivamente. Média ± SE de medições em triplicado é mostrado. * P 0,05 vs vector sozinho; ** P 0,01 vs sozinho miR-21 da esponja. (C) As células transfectadas foram semeadas em câmaras para uma membrana de trans-poço e as células que migraram foram corados tal como descrito nos Materiais e Métodos [111]. (D) As manchas de as membranas em painel C foram eluídos e a absorvância a 590 nm foi medida. Média ± DP de 3 câmaras independentes é mostrado. * P 0,001 vs vector sozinho; ** P . 0,001 vs miR-21 Esponja

A actividade da fosfatase lipídica de PTEN é conhecido por regular a fosforilação de Akt [27]. Nós mostramos anteriormente que o nível reduzido de PTEN em células de cancro renal está associada com o aumento da fosforilação de Akt (Fig. 3 e Fig. S5). Uma vez que o miR-21 regula o nível de proteína PTEN, que por sua vez activa Akt, testou-se o papel desta cinase na proliferação de células de cancro renal em relação a miR-21. Nós transfectadas células ACHN e Caki-2 com constitutivamente ativa Gag-Akt, juntamente com miR-21 Sponge [33]. A expressão de gag Akt inverteu significativamente a inibição da síntese de ADN induzida por miR-21 da esponja (Fig. 6A, Fig. S11A e a Fig. S12). A expressão de gag Akt também inverteu a proliferação celular por miR-21 da esponja (6B e as Figs. S13A). Da mesma forma, Akt constitutivamente activos inibem significativamente a inibição da migração de células ACHN em resposta a miR-21 da esponja (Figs. 6C, 6D e a Fig. S13B). Resultados idênticos foram obtidos com Caki-2 células de cancro renal (Figs. S14A, S14B e S14C). Estes resultados indicam que o miR-21 alvos de ARNm de PTEN para suprimir a expressão de proteínas, o que leva à proliferação de Akt-dependente e migração de células de cancro renal.

ACHN células foram transfectadas com o miR-21 de esponja, juntamente com Gag constitutivamente activa plasmídeos de Akt como indicado. (A)

incorporação de 3H-timidina foi determinada como descrito nos Materiais e Métodos [115]. Média ± SE de 6 medições é mostrado. * P 0,01 vs vector; ** P 0,001 vs sozinho miR-21 da esponja. (B) As células transf ectadas foram contadas em períodos de tempo indicados. O símbolos do diamante, quadrado e cruz representam vetor, miR-21 esponja e miR-21 Sponge mais Gag Akt plasmídeos de expressão, respectivamente. * P 0,01 vs vector sozinho; ** P 0,001 vs sozinho miR-21 da esponja. (C) As células transfectadas foram semeadas em câmaras para uma membrana de trans-poço e as células que migraram foram corados tal como descrito nos Materiais e Métodos [111]. (D) As manchas de as membranas em painel C foram eluídos e a absorvância foi medida. Média ± DP de 3 câmaras independentes é mostrado. * P 0,001 vs vector sozinho; ** P . 0,001 vs miR-21 Sponge

miR-21 modula TORC1 de atividades para induzir o câncer renal proliferação e migração celular

Se ativa Akt fosforila o supressor tuberina proteína tumor na Thr -1462 levando a sua inactivação e activação de TORC1 [34], [35], [36] Rheb-mediada. Nós estabelecemos que a regulação negativa de PTEN, devido ao aumento da expressão de miR-21 em células de cancro renal activa Akt (Fig. 3), o que contribui para a proliferação e a migração dessas células (Figs. 5 e 6). Testou-se o papel de miR-21 na fosforilação tuberina. ACHN células foram transfectadas com o miR-21 da esponja. Devido ao aumento da activação de Akt, células ACHN exibir fosforilação aumentada de tuberina (Fig. 7A, pista 1). Expressão de miR-21 inibiu a fosforilação da esponja de tuberina (Fig. 7A e Fig. S15A). Semelhante a um aumento da tuberina fosforilação, as células ACHN mostrou a fosforilação aumentada de quinase S6 na Thr-389 (Fig. 7B, pista 1), medido como um substituto para a actividade TORC1. miR-21 Esponja bloqueado quinase S6 fosforilação (Fig. 7B). Esta redução na fosforilação da cinase S6 por miR-21 de esponja foi associada com a inibição de fosforilação de mTOR na Ser-2448 (Fig. 7C). Estes resultados sugerem que o miR-21 regula a actividade TORC1 nas células de cancro renal. Para examinar se a inibição da mTOR miR-21 Esponja-dependente é devido à inactivação de Rheb, que co-transfectadas células ACHN com miR-21 de esponja e um plasmídeo de expressão Rheb constitutivamente activa e os resultados foram comparados com os que, em miR-21 células esponja-transfectadas. activação de mTOR foi examinada em lisados ​​celulares. Expressão de Rheb constitutivamente activa reverteu o efeito inibidor do miR-21 Esponja na fosforilação da cinase S6 (Fig. 7D e a Fig. S15B). Do mesmo modo, a fosforilação da mTOR reduzida por miR-21 de esponja também foi impedido por Rheb constitutivamente activa (Fig. 7E e a Fig. S15C). Estes resultados demonstram conclusivamente que miR-21 mediada por fosforilação /inativação de tuberina ativa Rheb para aumentar a atividade da mTOR.

células ACHN foram transfectadas com miR-21 Esponja ou vector. Os lisados ​​celulares foram coradas imunologicamente com fosfo-tuberina (Thr-1462), tuberina (painel A), fosfo-S6 quinase (Thr-389), S6 cinase (painel B), fosfo-mTOR (Ser-2448) e mTOR (painel C). miR-21 usa a ativação Rheb para a atividade TORC1. células ACHN foram cotransfectadas com miR-21 Esponja e plasmídeo CA Rheb. Os lisados ​​celulares foram coradas imunologicamente com fosfo-cinase S6 (Thr-389), S6 cinase (painel D), fosfo-mTOR (Ser-2448) e mTOR (painel E).

Para elucidar se -miR-21 activada TORC1 contribui para a proliferação de células cancerosas renais, que co-transfectadas células ACHN e Caki-2 com miR-21 de esponja e um vector de expressão de mTOR constitutivamente activa.

foi determinada a incorporação de 3H-timidina. Expressão de mTOR constitutivamente activos inibem significativamente a inibição da síntese de ADN por miR-21 da esponja (Fig. 8A, Fig. S16 e a Fig. S17). Similarmente, a mTOR constitutivamente activa inibiu o decréscimo de miR-21 Esponja mediada por células em proliferação ACHN (Fig. 8B e Fig. S18A). Em seguida examinámos o efeito de mTOR constitutivamente activa sobre a migração de células de cancro renal. miR-21 Esponja aboliu a migração de ACHN e células Caki-2 (Fig. 8C, a Fig. S18B e a Fig. S19). No entanto, a co-expressão de mTOR constitutivamente activa com o miR-21 inverteu esponja significativamente a inibição da migração de ambas as linhas celulares de cancro renal em resposta a miR-21 da esponja (Fig. 8C, 8D e a Fig. S19). Tomados em conjunto estes resultados demonstram que o miR-21 contribui para a proliferação de células do cancro renal e migração através TORC1.

ACHN células foram transfectadas com o miR-21 Esponja juntamente com plasmídeos de mTOR constitutivamente activa, tal como indicado. (A)

incorporação de 3H-timidina foi determinada como descrito nos Materiais e Métodos [115]. Média ± SE de 6 medições é mostrado. * P 0,001 vs vector; ** P 0,001 vs sozinho miR-21 da esponja. (B) As células transf ectadas foram contadas em períodos de tempo indicados. O diamante símbolos, quadrado e cruz representam vetor, miR-21 Esponja e miR-21 Sponge mais (CA) plasmídeos de expressão mTOR constitutivamente activos, respectivamente. * P 0,01 vs vector sozinho; ** P 0,001 vs sozinho miR-21 da esponja. (C) As células transfectadas foram semeadas em câmaras para uma membrana de trans-poço e as células que migraram foram corados tal como descrito nos Materiais e Métodos [111]. (D) As manchas de as membranas em painel C foram eluídos e a absorvância a 590 nm foi medida. Média ± DP de 3 câmaras independentes é mostrado. * P 0,001 vs vector sozinho; ** P 0,001 vs miR-21 Sponge

Discussão

Nas células de cancro renal, nós fornecemos evidências para a expressão de pri-miR-21 para produzir pré e maduro. miR-21, o que contribui para a proliferação e a migração /invasão. Mostramos uma correlação inversa entre miR-21 níveis e PTEN abundância. Nós demonstramos que PTEN miR-21-sensível regula a proliferação e migração de células de cancro renal através da activação de Akt. Por fim, estabelecemos um papel para TORC1 estimulada miR-21 na proliferação de células de câncer renal e migração (Fig. 9).

Avançado miR-21 atenua os níveis de proteína PTEN, resultando em ativação da Akt, que inativa tuberina para aumentar a atividade TORC1 levando a proliferação, migração e invasão de células de cancro renal.

controles de expressão de genes alterados sinalização redes para regular as saídas biológicas, que contribuem para a célula de transformação e metástase. Embora a regulação da transcrição de genes para a produção de mRNAs medeia uma contribuição substancial para a oncogénese, recente descoberta de miARNs que jogam um papel semelhante para factores de transcrição de ligação de ADN é estabelecida na regulação da expressão de genes alvo por um mecanismo pós-transcricional. Muitos miARNs foram identificados e caracterizados como promotores de tumor, bem como supressores de tumores. Por exemplo, o ubiquamente expressa miARN, miR-21, é frequentemente sobre-regulada em muitos cancros, incluindo mama, pulmão, neuroblastoma, glioblastoma, leucemia, cancro gástrico, o colangiocarcinoma, o cancro do cólon e cancro hepatocelular [37], [38], [39] , [40], [41], [42]. No entanto, as informações sobre o papel funcional de miR-21 está disponível apenas a partir de

in vitro

estudos. Apenas recentemente a

In vivo

papel de miR-21 no desenvolvimento do cancro tem sido demonstrada em linfoma de células pré-B e carcinoma do pulmão de células não-pequenas. Em ambos os cancros, a expressão de miR-21 é significativamente aumentada [43], [44], [45]. Utilizando modelos de ratinho de sobre-expressão, bem como a eliminação de miR-21, Medina et ai e Hatley et al mostraram recentemente um papel altamente específico deste miARN no desenvolvimento de linfoma de células pré B e o carcinoma do pulmão de células não pequenas, respectivamente [ ,,,0],46], [47].

miR-21 regula a proliferação e vias apoptóticas mitocondriais controlados por proteínas supressoras de tumor, reguladores do ciclo celular e factores de crescimento [48], [49]. miR-21 é expressa abundantemente nos túbulos proximais do rim [50]. Em modelos animais, o aumento da expressão de miR-21 está associado com doenças fibróticas do rim e lesão renal isquémica [51], [52], [53], [54]. Recentemente, têm relatado um aumento da expressão de miR-21 em um modelo de tipo 1 nefropatia diabética [25]. Mostrámos que o miR-21 regula hipertrofia das células epiteliais tubulares proximais, indicando o papel patológico deste miARN em doenças renais [25]. Do mesmo modo, estudos de perfis de miARN identificado aumento da expressão de miR-21 em ambas as células claras e carcinomas renais papilares [14], [19], [55]. Em contraste, numa análise de microarray recente de 30 graus 1 e 2 de tecido de carcinoma de células renais claras, miR-21 foi relatada a ser regulada negativamente por mais do que duas vezes [56]. Curiosamente, uma correlação recíproca fraco foi detectado entre a sobrevivência de pacientes com carcinoma renal de células claras e expressão de miR-21 [55]. Neste relatório downregulation de miR-21 foi encontrado na linha BVS deficiente RCC4 renal de células de câncer [55]. Reconstituição de VHL resultou num aumento da expressão de miR-21 de uma maneira Hifα-independente. Deve notar-se que 42% dos tumores de células claras mostram mutação VHL e 10% dos tumores realizar a metilação do promotor de VHL [57], [58], [59]. No presente estudo, nós mostram um aumento significativo na expressão de miR-21 no ACHN positivo BVS e Caki-2 células de cancro renal em comparação com as células epiteliais tubulares proximais normais (Fig. 1 e Fig. S2) [60]. Além disso, os nossos resultados demonstram melhorado significativamente a expressão de miR-21 em 100% de grau 2 e grau 3 tecidos renais tumorais em comparação com o tecido de controlo combinado (Fig. S1). Além disso, usando uma linha celular de cancro renal negativa BVS, 786-O, foi encontrado um aumento significativamente a expressão de miR-21, em comparação com HK2 células epiteliais tubulares proximais (Fig. S20). Estes resultados demonstram que, independentemente do status da BVS, as células de cancro renal expressam altos níveis de miR-21.

células de carcinoma renal metastático exibir aumentou TGF-dependente Smad 2/3 sinalização [61]. Recentemente, um papel de TGFp no aumento dos níveis de miR-21 madura tem sido relatada [62]. Estes autores descreveram uma função independente de transcrição de proteínas Smad específicos de TGF-p, que são recrutados para o RNase III Drosha através da interacção com p68 RNA helicase. Este complexo microprocessador recruta pri-miR-21 para facilitar a produção de pré-miR-21, aumentando assim os níveis de maturidade miR-21 [62]. Este estudo não encontrou qualquer aumento na pri-miR-21 em resposta a TGF. Mais recentemente, o mesmo grupo relatou a presença do elemento de ligação de TGFp-específica Smad na região da haste da pri-miR-21, que recruta Smad directamente ao Drosha microprocessador /PRI miR-21-complexo para o aumento do processamento para produzir pré-miR S4. 5A. S4. 6B.