Abstract

epibrassinolídeo (EBR) é um composto derivado e biologicamente ativa esteróide poliidroxilado dos brassinosteróides. Além papéis bem descritas no crescimento das plantas, EBR induz a apoptose em células de cancro da próstata LNCaP que expressam o receptor de androgénio funcional (AR). Portanto, sugere-se que EBR pode ter um potencial inibitório na via de sinalização do receptor de androgénio. No entanto, o mecanismo pelo qual EBR exerce os seus efeitos sobre LNCaP é mal compreendida. Para resolver esta lacuna no conhecimento, usamos uma abordagem imparcial proteômica globais, ou seja, a rotulagem de isótopos estáveis ​​por aminoácidos em cultura de células (SILAC). No total, foram identificadas proteínas únicas 964, 160 das quais foram diferencialmente expressos após 12 h de tratamento EBR. A quantificação de proteínas expressas diferencialmente revelou que a expressão da proteína de chaperona resposta proteína desdobrada (UPR), calreticulina (Calr), foi dramaticamente regulada negativamente. A diminuição na expressão Calr também foi validado por imunotransferência. Porque os nossos dados revelaram o envolvimento da UPR em resposta à exposição EBR, avaliamos a expressão de outras proteínas UPR. Nós demonstramos que o tratamento EBR subregulado calnexin e regulada BiP e IRE1α níveis de expressão e induzida translocação CHOP do citoplasma para núcleo. A translocação de CHOP foi associado a caspase-9 e caspase-3 a activação após um tratamento EBR 12 h. Co-tratamento de EBR com rapamicina, um inibidor de mTOR a montante, impedido EBR induzida por perda de viabilidade celular e a clivagem de PARP em células de cancro de próstata LNCaP, sugerindo que poderia induzir EBR ER stress nestas células. Além disso, observou-se resultados semelhantes em células DU145 com receptor de androgénio não funcional. Quando a degradação proteossómica de proteínas foi bloqueada por co-tratamento MG132, o tratamento EBR induzida ainda PARP clivagem em relação ao tratamento da droga sozinho. EBR também induziu Ca

2 + sequestro, que confirmou a alteração da via ER devido ao tratamento medicamentoso. Portanto, sugerimos que EBR promove estresse ER e induz a apoptose

Citation:. Obakan P, Barrero C, Coker-Gurkan A, Arisan ED, Merali S, Palavan-Unsal N (2015) SILAC-Based Espectrometria de Massa análise revela que epibrassinolídeo induz apoptose via Activar Retículo endoplasmático estresse em células de câncer de próstata. PLoS ONE 10 (9): e0135788. doi: 10.1371 /journal.pone.0135788

editor: Mohammad Saleem, Instituto Hormel da Universidade de Minnesota, Estados Unidos

Recebido: 04 de agosto de 2014; Aceito: 27 de julho de 2015; Publicação: 09 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Obakan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:.. Este estudo foi apoiado pelo Centro de Suporte Istambul Kultur Universidade Projetos científicos e da Universidade Temple Fels Institute of Cancer and Molecular Departamento de Biologia, utilizando os seus próprios recursos

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Brassinosteroids (BRs) são moléculas esteróides derivados com numerosos efeitos fisiológicos, incluindo a regulação da hormonal equilíbrio, a activação de proteína e síntese de ácido nucleico, actividade enzimática, o ciclo celular e crescimento celular [1, 2]. Para além dos efeitos bem descritos em plantas, os seus papéis em células de mamífero são mal compreendidas e actualmente a ser investigados como agentes anti-cancro [3-5]. O entendimento recente é que EBR, um membro dos brs, induz apoptose com maior eficácia no receptor da hormona nuclear (NHR) -expressing linhas celulares de cancro, tais como a próstata LNCaP [com receptor de androgénio (AR)] [4] ou MCF-7 de mama linhas celulares de cancro [com o receptor de estrogénio (ER)] [3]. A semelhança estrutural de EBR com esteróides de mamífero [6] tem sido sugerida como possível razão para a especificidade hormonal. No entanto, a base molecular da especificidade EBR não tem sido elucidado. A nossa experiência anterior indicou que embora EBR (25? M) foi um forte indutor de apoptose em células LNCaP (AR +) células de cancro da próstata, também foi surpreendentemente eficaz na indução de apoptose em células DU 145 (Ar). Importante, EBR tratamento não foi citotóxico para as células epiteliais da próstata PNT1a normais [4]. Para esclarecer melhor o potencial terapêutico da EBR, investigamos todo o proteoma de células LNCaP com ou sem tratamento EBR.

O uso de abordagens proteômicas quantitativos é susceptível de fornecer informações sobre as assinaturas moleculares básicas e compreensão detalhada do os alvos envolvidos [7]. SILAC (Stable Isotope Labeling por Aminoácidos em cultura celular) análise é uma espectroscopia de massa (MS) -combined abordagem proteômica sem marcação radioactiva. SILAC baseia-se na incorporação de um dado “luz” (

12C marcada da L-lisina ou L-arginina) ou forma “pesada” (

13C marcada da L-lisina ou L-arginina) do aminoácido na proteínas. Depois de um certo número de divisões celulares, cada um determinado aminoácido é substituído pelo seu análogo isótopo e incorporada em proteínas sintetizadas de novo [8]. Neste estudo, foi utilizada a abordagem SILAC para explorar o romance potencial apoptótica de EBR em células cancerosas andrógeno responsivo LNCaP próstata.

Observamos que EBR afetado significativamente o perfil de expressão de 160 proteínas envolvendo em diferentes funções celulares (celular citoesqueleto, o ácido nucleico e o metabolismo energético, morte celular e ubiquitinação de proteínas) em comparação com amostras de controlo não tratadas. Retículo endoplasmático (ER) residente calreticulina (Calr), uma proteína de chaperona, foi significativamente regulada negativamente entre estas 160 proteínas. Determinou-se que os níveis de proteínas do stress ER foram alterados após tratamento EBR em LNCaP AR (+), e o mesmo perfil foi também observada na linha celular de cancro não-funcional que expressam AR DU145 próstata. As alterações nos biomarcadores do stress ER desencadeada apoptose em cada linha de células; em células LNCaP, a apoptose foi induzida por CHOP transactivação e a translocação para o núcleo. A adição de rapamicina, como um repressor traducional de mTOR (alvo da rapamicina em mamíferos), ou MG132, um inibidor de proteassoma que reduz a degradação de proteínas de ubiquitina conjugada, a apoptose induzida por EBR alterada, sugerindo que o stress ER foi activado após o tratamento EBR em células LNCaP. Para provar a relação entre o mecanismo de morte celular mediada por ER após o tratamento EBR, foi realizada a transfecção de plasmídeo Calr. perda de viabilidade celular induzida por EBR foi impedido em células LNCaP Calr +. Além disso, quando as células Calr + LNCaP foram tratadas com EBR, não observamos estresse ER mediada por indução de apoptose, sugerindo que Calr é um alvo importante da EBR.

Materiais e Métodos

Chemicals e anticorpos

lisina pesado e arginina [(13C6, 15N2) -L-lisina e (13C6) -L-arginina] foram obtidos a partir de Cambridge Isotope (Andover, MA); aminoácidos luz (L-lisina e L-arginina) foram obtidos de Sigma (St Louis, MO). O cocktail de inibidores de protease foi obtido a partir de Sigma (St Louis, MO). Os anticorpos contra o estresse ER (BIP, CALNX, Calr, costeleta, IRE1α, Perk, ATF4, ATF6 e PDI) e apoptose (caspase-12, caspase-3, caspase-9 e PARP) foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Tunicamicina foi adquirido de Sigma (St Louis, MO) e dissolveu-se em DMSO (10 mg /ml). O plasmídeo CHOP pmCherry-etiquetado foi comprado de Addgene (promotor CHOP (-649 /+ 136) pmCherry-1, 36035). Cálcio corante verde para determinar o Ca intracelular

2+ níveis foi adquirido a partir de Molecular Probes (Eugene, OR, EUA). Rapamicina e MG132 foram adquiridos de Tocris (Ellisville, MI, EUA) e Sigma (St Louis, MO), respectivamente.

celular cultura

LNCaP (CRL-1740) e DU 145 ( HTB-81) linhas de células de cancro da próstata humano foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC). As células HEK-293 (CRL-1573) foram utilizados para o isolamento de ARNm de tipo selvagem Calr e obtido a partir de ATCC. As células foram cultivadas em meio DMEM (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), suplementado com 10% de soro bovino fetal (PAN Biotech, Aidenbach, Alemanha) e 10000 U de penicilina /ml e 10 mg de estreptomicina /mL (PAN Biotech, Aidenbach , Alemanha). As células foram cultivadas a 37 ° C em um umidificado CO 5%

2 incubadora (HERAcell 150; Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, EUA).

cultura celular no SILAC media

SILAC DMEM (Pierce Biotechnology) foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino dialisado (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA), 1% de estreptomicina /penicilina. O meio pesado foi suplementado com

13 C

6 L-arginina e

13 C

6,

15 N

2-L-lisina. O meio de luz foi suplementado com L-arginina normal e L-lisina. Para experiências SILAC, as células LNCaP foram cultivadas em paralelo na luz ou mídia pesada durante 5 dias, com a substituição de mídia a cada 24 h.

1-D separação SDS-PAGE e em gel digestão com tripsina

de proteína celular total foi isolado a partir de células LNCaP utilizando tampão RIPA (25 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 1% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS). quantificação de proteínas foi realizada de acordo com o método de Bradford (Bio-Rad Protein Assay) [9]. As amostras contendo uma combinação de 40 ug de proteína total (20 ug ‘ “pesado” e 20 ug’ “luz”) foram diluídas com tampão de amostra de Laemmli (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) contendo 5% β-mercaptoetanol. A mistura foi em seguida aquecida durante 5 min a 90 ° C e carregou-se 10% de separação de poliacrilamida gels.1-D SDS-PAGE foi realizada com o mini-sistema Protean II (Bio-Rad) a 200 V durante 45 min. As bandas foram visualizadas com azul Simplesmente segura Mancha (Life Technologies, CA, EUA), e as faixas foram cortados em secções de 12, que foram cortados em quadrados de 1×1 ~ mm. Após distaining com 50% v /v de acetonitrilo (ACN) em tampão de bicarbonato de amónio 25 mM (tampão de bicarbonato), proteínas em pedaços de gel foram reduzidas com ditiotreitol 10 mM (DTT) em tampão de bicarbonato e alquilado por incubação com 50 mM de iodoacetamida em tampão de bicarbonato . Após a desidratação do gel com 100% de ACN, pedaços de gel foram cobertas com cerca de 50 ul de 12,5 ug /ml de tripsina em tampão de bicarbonato de digestão em gel. A incubação para a digestão foi realizada a 37 ° C durante 12 h. A tripsina foi inactivada com ácido fórmico ao volume final de 2%, e os péptidos foram extraídos e limpo utilizando uma coluna C18 da ponta (ZipTips, Millipore, Medford, MA, USA), como previamente descrito [10].

GeLC- MS /MS e análise de dados

Os péptidos foram secas numa centrífuga de vácuo e ressuspenso em 20 ul de 0,1% de ácido v /v trifluoroacético (TFA) /H

2O. amostras de peptídeos foram carregados 2? g de armadilhas peptídicas capacidade (CapTrap; Michrom Bio-Recursos) e separados utilizando uma coluna capilar C18 (15 centímetros 75 mm Agilent) com uma bomba LC Agilent 1100 entregando fase móvel em 300 nl /min. Eluição em gradiente utilizando fases móveis A (1% /0,1% de ácido fórmico ACN, equilibrar H

2O) e B (80% de ácido fórmico ACN /0,1%, o balanceamento do H

2O) era como se segue (percentagens de B, Um equilíbrio): linear de 0 a 15% em 10 min, linear a 60% em 60 min, linear até 100% em 65 min. O nano ESI MS /MS foi realizada usando um espectrómetro de massa de armadilha de iões Ultra HCT (Bruker). ESI foi entregue utilizando uma ponta de sílica de revestimento por pulverização distai (ID de 20 mm, a ponta interior ID de 10 um, New Objective, Ringoes, NJ). Os espectros de massa foram adquiridos em modo positivo, a tensão capilar na -1100 V e cobrar ion trap digitalização de controle ativo 300-1500 m /z; usando uma comutação automática entre os modos de MS e MS /MS, MS /MS de fragmentação foi realizada nos dois iões mais abundantes em cada espectro, usando a dissociação induzida por colisão com exclusão activa (excluído após dois espectros e libertado após 2 min). O sistema completo foi totalmente controlado por Hystar 3,2 software.

processamento de dados em massa espectros foi realizada utilizando Mascot Distiller (versão 2.4.3.3), com pesquisa e quantificação opções de caixa de ferramentas. A lista de pico de-isotoped gerado foi submetido a um servidor Mascot in-house 2.4.0 para a pesquisa contra o SwissProt banco de dados versão 2013_01 (538849 sequências; 191337357 resíduos). parâmetros de busca Mascot foram definidos da seguinte forma: espécie, Homo sapiens (20.233 sequências); enzima, tripsina com 2 máximo perdeu clivagem; modificação fixa: carbamidomethylation cisteína; modificações variáveis: oxidação da metionina, Gln piro-Glu (N-terminal Q), Glu piro-Glu (N-termo E), Editora: 13C (6) 15N (2) (K), e a etiqueta : 13C (6) (R); tolerância de massa 0,90-Da para os iões peptídicos precursor; e 0,6 Da para iões do fragmento de MS /MS. SILAC quantificação foi realizada em Mascot Distiller usando o método SILAC K + 8 + 6 R quantificação; rácios SILAC para pares de peptídeos pesadas e leves foram calculados pelo método de integração Simpsons, um peptídeo mínima com a sequência única e 0,05 de limiar significativo. Os seguintes critérios foram utilizados para avaliar a identificação de proteínas: uma ou mais originais peptídeos com pontuação ion ≥45 e dois ou peptídeos mais originais com pontuação ion ≥30 (p 0,05 limiar); proteínas identificadas foram extraídos utilizando MS Data Miner (MDM) [11]. proteínas quantificadas com ≥ 2 e ≤ mudança 0,5 vezes foram selecionadas e agrupadas por funções biológicas, via e análise de rede utilizando software (IPA) Ingenuity Pathway Analysis (www.ingenuity.com) para análise bioinformática.

Construção de p-EGFP Calr plasmídeo

o ARN total foi isolado a partir de células HEK-293 células de rim embrionário humano, utilizando TriPure (Roche) de acordo com as indicações do fabricante. O ADNc da primeira cadeia foi transcrito utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad). Calr ADNc foi amplificado utilizando iniciadores concebidos Calr de clonagem específicos do gene: 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 ‘; reverso, 5’-GCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3 ‘. O protocolo incluiu um passo de desnaturação inicial a 94 ° C durante 3 min, seguido de 30 ciclos com 30 segundos. de desnaturação a 94 ° C, 30 s de recozimento a 55 ° C e 45 seg. de alongamento a 72 ° C, seguido por um passo final de alongamento a 72 ° C durante 10 min. Dez microlitros de produto de PCR e 1 ug plasmídeos pEGF-LC3.1 foram digeridos com 10 U /ul de EcoRI e BglII (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha) durante 30 minutos a 37 ° C. Os produtos de digestão foram sujeitos a electroforese em gel de agarose a 1,5% e depois extraiu-se do gel de agarose. A ligação do produto de PCR: plasmídeo foi produzido usando 1: 1, 1: 3 e 1: 5 com razões de ADN-ligase de T4 (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha). ADN recombinante foi transformado em células HB101 que foram preparados usando o

2 Método de CaCl. Os clones positivos foram selecionados usando placas de ágar ampicilina (Amp) LB. Todas as colónias foram repicadas e cultivadas em 1 ml de LB Amp + e incubou-se durante a noite a 37 ° C. Os plasmídeos de cada colónia foram isoladas usando colunas QIAprep spin Miniprep (Qiagen, Valencia, CA, EUA). Os plasmídeos a partir de colónias seleccionadas dez foram utilizados como moldes para amplificar o gene Calr utilizando iniciadores de clonagem em PCR. Um plasmídeo positivo amplificado seleccionado foi sequenciado para confirmar a estrutura de leitura aberta (ORF) do gene de fusão de EGF-Calr (İontek, Turquia). O plasmídeo recombinante foi sequenciado usado para as experiências superexpressão.

transfecção transiente do plasmídeo pEGFP-Calr

Células LNCaP foram semeadas durante a noite em placas de 6 poços a uma densidade de 3×10

5 células /poço. Cerca de 1 ug /ul de ADN pCMV-Calr na presença de reagente de transfecção (HD Fugene, Roche, Mannheim, Alemanha) foi preparada em meio isento de soro. A mistura foi incubada durante 15 minutos à temperatura ambiente e cuidadosamente adicionada gota a gota sobre as células. Depois de 48 h plasmídeo de transfecção, as células foram tratadas com 25? M EBR, e o ARN total foi isolado para análise de expressão de proteína Calr ou extracção por western blotting.

transfecção transiente de promotor CHOP (-649 /+ 136) pmCherry -1 plasmídeo

para determinar a actividade de CHOP, as células LNCaP foram transfectadas com o constructo repórter promotor CHOP (-649 /+ 136) pmCherry-1 (Addgene plasmídeo 36035) usando Fugene HD de acordo com as instruções do fabricante ( Roche, Mannheim, Alemanha), e os clones resistentes à canamicina (500 ng /ml Sigma, St Louis, MO, EUA) foram gerados.

Avaliação da morte celular por apoptose por coloração com anexina V-FITC

células LNCaP foram semeadas em placas de 6 poços-(3×10

5 células /poço) e tratou-se com EBR 25 uM, durante 24 h. Ambas as células flutuantes e aderentes foram recolhidas, ressuspensas em tampão de ligação de anexina V e incubadas com Anexina V-FITC e PI, seguindo as instruções do fabricante (BD Biosciences, Bedford, MA). Mil eventos por amostra foram adquiridos na Accuri C6 (BD Biosciences). emissões de fluorescência foram coletados através de 530 nm e 570 nm filtros passa-banda para FITC e PI, respectivamente. Os dados são apresentados como gráficos de pontos (fluorescência Anexina no eixo dos x; fluorescência do PI no eixo dos Y). Os números presentes nos quatro quadrantes representam a porcentagem de viabilidade (inferior esquerdo), necrótica (superior esquerdo), no início de apoptose (inferior direito), e as células avaliadas utilizando software BD Accuri C6 (BD Biosciences) apoptótica tarde (canto superior direito).

Western blot análise

As células foram cultivadas em 60-mm de pratos de Petri em meio completo. Os meios foram descartados, e as células foram lavadas com gelo frio 1x PBS e lisadas com tampão de lise ProteoJET célula de mamífero (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha). Os níveis totais de proteína foram determinadas usando o método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) [9]. Os lisados ​​celulares totais foram separadas por 12% de gel SDS-PAGE e electrotransferidas para polyvinylidenedifluoride (PVDF) membranas (Roche, Mannheim, Alemanha), submetido a electroforese. As membranas foram lavadas em solução salina tamponada com Tris com Tween-20 (TBS-T) [mM de Tris-HCl a 10 (pH 8,3), 0,05% de Tween-20] (Tween 20, Sigma Ultra, St. Louis, MO, EUA). As membranas foram bloqueadas em 5% de leite desnatado contendo leite TBS-T durante a noite a 4 ° C. As membranas de PVDF foram incubadas com tampão contendo 5% (v: v) desnatado solução de leite com anticorpos apropriados Calr, CALNX, BiP, IRE1α, CHOP, ATF4, ATF6, PERK, PDI, caspase 12, caspase 9, caspase 3, PARP, PARP clivada β-actina (cada diluído 1: 1000) e incubou-se a 4 ° C durante a noite. anticorpo secundário anti-coelho foi preparado diluição 1: 1000 em 5% (v: v) de leite desnatado solução (CST, Denvers, MA, EUA). As membranas foram enxaguadas com TBS-Tween 20 e incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP, a 4 ° C durante a noite. Após a adição do reagente de quimioluminescência aumentada, os sinais a partir dos anticorpos com HRP acoplado, foram detectados utilizando ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Todos os resultados foram replicados pelo menos três vezes e borrões representativos foram dadas.

Medição do Ca intracelular

2 + níveis

células cancerosas da próstata LNCaP foram tratadas com EBR durante 12 h, e intracelular Ca

2 + foram determinadas por níveis de cálcio verde-1 (1 nmol /L, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) coloração por 30 minutos. A análise de citometria de fluxo de células coradas foi realizada com um citómetro de fluxo Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Cálcio células-1-manchadas verdes foram observados por microscopia de fluorescência (excitação 506 nm, emissão: 531 nm).

A análise estatística

A significância estatística foi avaliada utilizando o unicaudal teste t não pareado . P 0,05 foi tomado como um nível de significância. resultados de Western blot foram repetidas pelo menos três vezes. intensidades das bandas foram quantificados usando software ImageJ e normalizadas para beta-actina.

Resultados

Proteome de células LNCaP tratados com EBR

Para obter uma perspectiva global das alterações na inteira proteoma, as células LNCaP foram tratados com EBR (25 uM) e submetido a tratamento SILAC. No total, 964 proteínas específicas foram identificadas por meio desta técnica. Mudanças maiores do que 2 vezes (≥ 2 e ≤ 0,5) entre a luz e as proteínas pesadas foram consideradas significativas de acordo com os pontos de corte de estudos anteriores [10]. A análise quantitativa entre amostras pareadas revelou que entre as 964 proteínas, 160 foram significativamente alteradas após 12 h de tratamento EBR (S1 Tabela).

Caracterização funcional de proteínas e bioinformática identificados análise

A seguir, analisadas 160 proteínas expressas diferencialmente no que diz respeito à função biológica, e via rede usando o software IPA. Como mostrado na figura 1, de acordo com a análise de função biológica, as proteínas alteradas-EBR têm funções no crescimento e proliferação celular (16,6%), morte celular e sobrevivência (14%), a montagem celular e organização (13,3%), a função celular e manutenção (13,3%), o metabolismo do ácido nucleico (5%), a replicação de ADN (4%), a síntese de proteínas e proteínas de dobragem (3,7 e 1%, respectivamente) (Figura 1). A análise de vias canónicas (p ≤ 0,05) identificado sinalização aldosterona nas células epiteliais, bem como vias metabólicas celulares (incluindo a biossíntese de UDP-N-acetil-d-galactosamina, a gluconeogénese, a biossíntese de ácidos gordos, mecanismo de ubiquitinação de proteínas, sinalização citoesqueleto e outros) (Figura 2). Calr exibiu uma alteração significativa após 12 h de tratamento EBR com pontuação de 150, 11 partidas, um rácio pesado /leve de 0.4372 e 4 peptídeos (S1 tabela). Além disso de acordo com as moléculas associadas com o Calr resultados da análise SILAC foi regulada negativamente por 2,287 em comparação com amostras de controlo (Tabela 1).

O gráfico da torta apresenta as 160 proteínas diferencialmente expressas.

o gráfico representa as funções das células hospedeiras com a maior pontuação (eixo y) em função do número de proteínas diferencialmente regulados. Reproduzido de Análise Ingenuity Pathways sob uma licença CC BY, com a permissão da QIAGEN Silicon Valley, original do copyright 2000-2013.

modulação induzida por EBR de expressão Calr

diferencialmente proteínas expressas após o tratamento EBR foram mapeados para 7 redes funcionais específicas com cada rede contendo 11 ou mais membros “focus”. As redes de interesse correspondeu à morte celular e sobrevivência, montagem celular e organização, comprometimento celular, a função celular e manutenção, o metabolismo de drogas, metabolismo lipídico, a morfologia celular e função celular. Calr foi encontrada uma proteína principal na resposta celular, montagem de redes celulares e organização (Fig 3A). Porque Calr é uma proteína chaperone e por alterações na liderança expressão Calr à resposta proteína desdobrada e estresse ER, detectamos as interações de Calr com outras moléculas para detectar evidências da UPR após o tratamento EBR em células de cancro da próstata LNCaP. Enquanto que executar IPA para análise via EBR após o tratamento, o sistema previsto que a família de proteínas de choque de calor também pode chaperona sido envolvidos em condições de stress induzida por EBR, como mostrado na figura 3B. Além disso, a comparação do efeito de IPA EBR com outros agentes anti-cancro conhecidos que causam efeitos semelhantes indicaram que EBR pode actuar como um indutor de stress ER como tunicamicina e é capaz de alterar proteínas de choque de calor e Calr (Fig 3C).

A) Red, up-regulamentados proteínas; verdes, proteínas significativamente regulada negativamente; branco, proteínas conhecidas para a rede, mas não identificado no nosso estudo. A intensidade da cor indica a magnitude da alteração nos níveis de expressão da proteína. As formas são indicativos da classe molecular (isto é, família de proteína). B) IPA mostrando as vias pode envolver em alterações celulares induzidas por EBR, C. tunicamicina, como um agente anti-cancro que causa um efeito semelhante. Linhas que ligam as moléculas indicam relações moleculares. Os estilos de seta indicam relações moleculares específicas e da direcionalidade da interação. Reproduzido de Análise Ingenuity Pathways sob uma licença CC BY, com a permissão da QIAGEN Silicon Valley, original do copyright 2000-2013.

Validação de identificação de proteínas e quantificação

Uma vez que a rede de interação de proteínas e análise de caminho revelou a alteração da resposta UPR em células de cancro da próstata expostos a EBR, nós próxima determinados os níveis de expressão de outras proteínas UPR por western blotting. Constatou-se que as alterações nas proporções de Calr em células LNCaP foram consistentes com aqueles derivados a partir de estudos SILAC (figura 4A, painel da esquerda). Como se mostra na figura 4, embora o tratamento EBR regulada negativamente o nível de expressão CALNX, a chaperona molecular BiP foi regulada positivamente. Uma acumulação excessiva de proteínas mal enroladas em ER provoca a dissociação da BiP de receptores localizado-membrana do RE, como IRE1α, vantagens e ATF6 como uma resposta significativa ER stress. De acordo com o perfil de expressão alterada BiP, IRE1α, vantagens e ATF6 foram regulados positivamente após tratamento EBR em células LNCaP (figura 4A, painel da esquerda). Também determinou os níveis de outras proteínas relacionadas com o stress do ER, tais como CHOP, ATF4 e PDI expressão nos lisados ​​de proteína total. Observou-se que a exposição de células LNCaP para EBR aumentou a expressão de CHOP em ambas as fracções citoplasmática e nuclear (Fig 4C). Curiosamente, PDI, uma proteína do stress abundante no ER, não elevada em resposta ao tratamento EBR. ER stress excessivo e prolongado desencadeia a apoptose. Consistente com este achado, EBR tempo-dependente activado caspase-12, caspase-9 e caspase-3 induzida e a clivagem de PARP (Fig 4A, painel da esquerda). Resultados semelhantes foram observados em células de cancro da próstata DU145 expostos a EBR (figura 4A, painel da direita). Anexina-V /PI resultados de coloração confirmou que EBR induzida apoptose em células LNCaP (figura 4B). Estes resultados indicam que a apoptose induzida EBR via UPR eixo em ambas as células de cancro da próstata, independentemente da expressão de AR funcional.

A) A proteína total foi isolado após tratamento EBR, e os perfis de ER de stress biomarcadores, caspases e expressão clivagem de PARP foi determinada por imunotransf erência utilizando anticorpos apropriados. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. B) Aproximadamente 2 x 10

5 as células foram semeadas numa placa de seis poços e tratadas com EBR durante 12 e 24 h. coloração de anexina V-PI foi realizada para determinar as populações de células apoptóticas. sinais de fluorescência a partir de anexina V-FITC e de PI são relatados no eixo dos x e do eixo y, respectivamente. Os números apresentados nos quatro quadrantes representam a percentagem de viabilidade (inferior esquerdo), necrótica (superior esquerdo), precoce de apoptose (inferior direito) e células apoptóticas final (direita superior). C) Após 12 horas de tratamento EBR, citosólicas e proteínas nucleares foram isolados e separados num gel de SDS 12%, transferidas para uma membrana de PVDF e colocados a hibridar com um anticorpo anti-CHOP. D), as células LNCaP foram transfectadas com o constructo promotor CHOP repórter (-649 /+ 136) pmCherry-1. A activação CHOP foi visualizado por microscopia de fluorescência. Excitação: 575 nm Emissão: 601.

Para verificar se o resultado da apoptose induzida por EBR foi relacionada com as células UPR, LNCaP foram transfectadas com a construção repórter do promotor de CHOP (-649 /+ 136 ) 1-pmCherry plasmídeo. Como mostrado na Fig 4D, EBR claramente actividade induzida CHOP e o padrão de pontos lacrimais, resultando em células LNCaP. Para validar ainda mais o efeito de EBR em ER apoptose relacionada ao estresse, que inibiu mTOR por rapamicina tratamento para bloquear a síntese de proteínas

de novo

mRNA e. A inibição da síntese de ARNm conduz à acumulação de proteínas desdobradas /mal dobradas no ER e, portanto, pode potencialmente aliviar ER morte celular induzida por stress [12]. Observou-se que o co-tratamento com rapamicina preveniu a perda significativamente induzida por EBR a viabilidade celular (figura 5A) e apoptose (Figura 5B, painel da esquerda) em células LNCaP. Em contrário, 26S do proteassoma MG132 inibidor co-tratamento aumentou ainda mais a perda de viabilidade celular (figura 5A) e apoptose (Figura 5B, painel da direita). De acordo com os dados obtidos, que sugerem que a presença de MG132 impediu a degradação induzida por EBR de proteínas deformadas e exacerbou a resposta apoptótica em células de cancro da próstata LNCaP. Colectivamente, estes resultados suportam a hipótese de que o mecanismo de morte celular induzida por EBR é mediada pela RPU em células de cancro da próstata.

A) perda de viabilidade celular após co-tratamento com rapamicina (10 nM) ou pré-tratamento com MG132 (10 uM) na presença de EBR (25 uM) durante 12 h foi medido pelo ensaio de MTT. B) O efeito da rapamicina ou MG132 +/- EBR foi determinada por imunotransf erência de PARP. β-actina foi usado como um controle de carga.

Calr é um alvo importante da EBR

Para começar a entender o mecanismo molecular por trás UPR, nós células LNCaP transfectadas transitoriamente induzida por EBR com um plasmídeo pCMV-Calr GFP (Figura 6A). Concomitantemente utilizamos tunicamicina como um controlo positivo para activar ER stress em células LNCaP sensíveis-AR. Embora a superexpressão Calr impediu a perda dependente de EBR de viabilidade celular, que não exerceu efeito mesmo após o tratamento com tunicamicina (Figura 6B). Embora tunicamicina activado o circuito do estresse ER por upregulating a expressão de Calr, CALNX, BiP e CHOP, o tratamento EBR única induziu a regulação positiva de CHOP, mas reprimidos Calr e CALNX. Calr superexpressão diminuiu o efeito potencial de EBR em jogadores ER sinalização, que indicava que Calr é um alvo crítico da EBR em células LNCaP. Além disso, sugerimos que EBR difere de tunicamicina através da activação diferentes alvos das máquinas ER estresse (Fig 6C).

A) O efeito de 12 h de tratamento EBR após pEGFP-Calr plasmídeo transfecção foi visualizado através de GFP pontos em células LNCaP. tunicamicina tratamento foi realizada como controlo positivo. B) O efeito de EBR em células LNCaP transfectadas com plasmídeo pEGFP-Calr seguinte de 12 h de tratamento EBR foi determinada pelo ensaio do MTT. C) O efeito de EBR no ER stress e biomarcadores de apoptose em células LNCaP Calr-transfectadas foi determinada por imunotransf erência. Os lisados ​​de células tratadas com tunicamicina foram usadas como controlo positivo; β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

Em seguida, determinou-se a eficiência de EBR apoptótica em ambas as células wt + e Calr LNCaP. Como mostrado na Fig 6C, EBR activado caspase-12, que culminou com a clivagem de PARP em células wt LNCaP, mas não em células Calr + LNCaP (Fig 6c). Como Calr é um importante regulador de Ca intracelular

2 + capacidade de tamponamento, que também desencadeia a apoptose, examinamos Ca

2 + níveis após o tratamento EBR (Fig 7). Observou-se que o tratamento EBR aumentar a liberação de Ca

2 + por 6 vezes em células LNCaP.

As células foram tratadas com EBR durante 12 horas e corados com verde cálcio. A intensidade de fluorescência foi determinada com o fluxo FACS e microscopia de fluorescência (excitação 506 nm, emissão: 531 nm).

Finalmente, propusemos que EBR apoptose em células cancerosas da próstata induzida pela causando estresse ER relacionadas com Calr downregulation e Ca

2 + liberar para o citosol (Fig 8).

Discussão

EBR, um regulador de crescimento da planta, foi recentemente sugerido como um medicamento quimioterápico candidato porque