: PLOS ONE

Sumário

Mecanismos de fosforilação de proteínas anormais que regulam a invasão celular e metástase no câncer de pâncreas permanecem obscuros. Neste estudo, foram utilizados matriz fosforilação de alto rendimento para testar duas linhas celulares de cancro do pâncreas (células PC-1 com um baixo e células PC-1.0 com um elevado potencial de invasão e metástase). Notou-se que um total de 57 proteínas revelou uma expressão diferencial (dobre mudança ≥ 2,0). Seis proteínas candidatas foram ainda validado por Western blot com os resultados encontrados para estar de acordo com a matriz. De 57 proteínas, 32 proteínas up-regulamentados (por exemplo CaMK1-a e P90RSK) foram principalmente envolvidos na ErbB e neurotrofina vias de sinalização, conforme determinado usando o software DAVID, enquanto que 25 proteínas regulada para baixo (por exemplo, BID e BRCA1) foram estreitamente associados à apoptose e vias de sinalização de p53. Além disso, quatro proteínas (AKT1, Chk2, p53 e p70S6K) com diferentes sítios de fosforilação foram encontrados, não só entre os up-regulamentada, mas também entre proteínas regulada para baixo. Importante, locais de fosforilação específicos podem afectar as funções biológicas de células. software CentiScaPe calculada características topológicas de cada nó na interação proteína-proteína (PPI) da rede: descobrimos que AKT1 possui os graus máximos de nós e intermediação na rede PPI proteína-regulação (26 nós, caminho médio: 1,89, graus de nó : 6,62 ± 4,18, betweenness: 22,23 ± 35,72) e p53 na rede PPI proteína sub-regulação (17 nós, caminho médio: 2,04, graus de nó: 3,65 ± 2,47, betweenness: 16,59 ± 29,58). Em conclusão, a identificação de fosforilação de proteínas anormais relacionadas com invasão e metástase pode permitir-nos identificar novos biomarcadores em um esforço para desenvolver novos alvos de drogas terapêuticas para o tratamento do câncer de pâncreas

Citation:. Tan X, Liu P, Huang Y, Zhou L, Yang Y, Wang H, et al. (2016) Fatores de Análise Phosphoproteome de invasão e metástase-relacionadas em células de cancro do pâncreas. PLoS ONE 11 (3): e0152280. doi: 10.1371 /journal.pone.0152280

editor: Dong Wang, Harbin Medical University, CHINA

Recebido: 14 de novembro de 2015; Aceito: 12 de março de 2016; Publicação: 25 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Tan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Liaoning Natural Science Foundation da China (No. 2014021006)

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

O câncer de pâncreas é uma doença altamente maligno com um prognóstico muito pobre. Apesar dos avanços consideráveis ​​em técnicas de ultra-som radiológicos e endoscópicos, que muitas vezes apresenta-se como uma doença localmente avançada ou metastática na maioria dos pacientes, e apenas cerca de 10-20% dos pacientes são considerados candidatos à cirurgia [1, 2]. Para além da cirurgia, não existem outros métodos eficazes de tratamento, e a taxa de sobrevivência para os pacientes ressecados também é extremamente baixa. A principal razão para um mau prognóstico é recidivas locais e /ou metástases à distância após a cirurgia. Isto sugere que a compreensão dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos na invasão e metástase de câncer de pâncreas é importante e requer uma maior exploração.

No entanto, modificações de proteínas pós-tradução em linhas celulares de cancro do pâncreas, que pode desempenhar um papel essencial na regulação de respostas celulares, não foram claramente demonstrados. Por conseguinte, é importante identificar quaisquer eventos de fosforilação e para determinar perfis de fosforilação de proteínas inteiras de células tumorais. Recentemente, comparando os phosphoproteomes em vários estágios de desenvolvimento de cancro da pele em ratinhos, foram identificadas proteínas associadas com respostas celulares precoces e tardios, fornecendo novas perspectivas sobre a progressão da doença [3]. Batchu et ai. descobriram que o tratamento de miR-26a pode restaurar as funções do tipo selvagem de p53 mutante via fosforilação em resíduos seus Ser9 e Ser392, resultando na inibição do crescimento celular [4]. Portanto, a fosforilação específica de sítio de proteínas desempenha um papel importante na regulação de processos celulares.

No entanto, tanto quanto sabemos, os estudos não analisados ​​os perfis phosphoproteome das duas linhas celulares homogéneas (CP-1 com um baixa, e PC-1.0 com um elevado potencial de invasão e metástase) [5, 6] na pesquisa do câncer pancreático. O nosso objectivo é comparar as alterações em 582 locais de fosforilação de proteínas 452 entre o PC-1 e células PC-1.0, utilizando tecnologia de matriz Phospho Antibody Explorador. Além disso, as vias e redes que relacionadas com fosfoproteínas identificados no nosso estudo mostram variações importantes em seus componentes.

Materiais e Métodos

linhas de células e cultura de células

Dois hamster foram utilizadas linhas celulares de cancro do pâncreas: as células fracamente invasivos e metastáticos (PC-1), e células altamente invasivos e metastáticos (PC-1.0). A linha de células PC-1 foi estabelecida a partir de adenocarcinomas do ducto pancreático induzidos por BOP em um hamster dourado sírio. A linha de células PC-1.0 foi estabelecida a partir de um tumor subcutâneo produzido após a inoculação de um hamster, células PC-1 [5,6].

In vitro

, as células PC-1.0 são principalmente células individuais, enquanto que as células PC-1 crescem como colônias de células ilha-like.

In vivo

, invasão local por células PC-1.0 e expansão local de células PC-1 foram observados [7].

células PC-1.0 e PC-1 foram incubadas em RPMI-1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY, EUA), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Bioserum, Canterbury, Victoria, Austrália), 100 U /mL de penicilina G e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2/95% de ar.

perfis Phospho-proteína por Phospho Explorador Anticorpo de matriz

lisados ​​

de células obtidas a partir de células de PC-1 e PC-1.0 foram aplicados numa Phospho Antibody Explorador array (Full Moon Biosystems, Sunnyvale, CA, EUA). A matriz continha 1318 anticorpos. Cada um dos anticorpos tem duas repetições que são impressos em revestido lâmina de vidro, juntamente com vários controlos positivos e negativos. Em resumo, os lisados ​​celulares foram extraídos com o Kit de Ensaio de Anticorpo matriz que continha um inibidor de cocktail de inibidores de protease e fosfatase, e foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante. 25? G de lisados ​​celulares foram marcadas com 3 ul de biotina. Anticorpo lâminas de microarray foram bloqueados primeiro de uma solução de bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente, lavada com água grau de Milli-Q, e secou-se com azoto comprimido. E, em seguida, incubadas com lisados ​​de células marcadas com biotina no acoplamento solução à temperatura ambiente durante 2 h. lâminas de matriz foram lavadas quatro vezes com 60 ml de 1 × solução de lavagem e lavou-se extensivamente com água grau de Milli-Q antes da detecção de proteínas biotinilada ligada utilizando estreptavidina conjugada com Cy3. As lâminas foram digitalizados em um scanner de 4000 GenePix e as imagens foram analisadas com GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA).

A alteração do índice de fosforilação foi calculado com base na seguinte equação onde a expressão de fosforilada proteínas foi normalizado para a expressão da proteína correspondente não fosforilado em ambos experimental (PC-1.0) e os dados de referência (PC-1). As proteínas fosforiladas foram consideradas como sendo expressas diferencialmente quando um aumento (≥ 2,0) ou diminuir (≤ 0,5) ocorreu na proporção dos níveis de expressão entre o PC-1.0 e células PC-1. dados de fosforilação da proteína foi confirmada por Western blot.

Anticorpos e Reagentes

os anticorpos policlonais de coelho produzidos contra epítopos de ABL1 humano, pAbl1-Tyr204 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), ITGB4 , ITGB4-Tyr1510 (Abcam, Cambridge, MA, EUA), Myc, pmyc Ser62, Fos, PFOs-Thr232, IRS-1, Pirs-1-Ser636, RAF1, pRaf1-Tyr341 e ß-actina (Santa Cruz Biotechnology, Dallas , TX, EUA) foram utilizados como anticorpos primários. Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano ou anticorpos fluorescentes marcados com FITC (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA) foram utilizados como anticorpos secundários para a transferência de Western. FOS e do IRS-1 ARNsi foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EUA). inibidor RAF1 (GW5074) foi adquirido a partir de Selleck Chemicals (Houston, TX).

Western blot

transferência de Western foi realizada como descrito anteriormente [7]. As células foram recolhidas em gelo utilizando tampão RIPA suplementado com um cocktail inibidor de protease e um inibidor de fosfatase, durante 30 minutos. Em resumo, as amostras de proteína total equivalente (20 ug) foram corridos num gel de poliacrilamida a 5% e transferido para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad, Anaheim, CA, EUA). As membranas foram incubadas com anticorpo primário, diluído em 0,1% de Tween-20 /PBS, durante a noite a 4 ° C. As manchas foram então incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (diluído 1: 5000) em 0,1% de Tween-20 /PBS. As proteínas foram visualizadas utilizando reagentes de detecção de quimioluminescência aumentada (Santa Cruz Biotechnology).

In vitro

ensaios de invasão e migração

células PC-1.0 foram transitoriamente transfectadas com diferentes siRNAs usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY), ou foram suprimidos usando inibidor RAF1. Para a invasão ensaios Transwell, as células transfectadas (5 × 10

4 células /mL) em meio livre de soro foram adicionados às câmaras superiores, que foi comprado a partir de Costar (8 uM filtros de tamanho de poro, Nova Iorque, NY) e revestida com Matrigel (dilution1: 4). As câmaras inferiores foram cheias com meio RPMI-1640 contendo 10% de soro. Após 24 h de incubação, as células restantes nas câmaras superiores foram removidas e as células invasoras nas câmaras inferiores foram fixadas com paraformaldeído a 4% (Sigma-Aldrich), coradas com violeta de cristal à temperatura ambiente, e contados sob um microscópio. Para o ensaio de migração de cicatrização de feridas, as células transfectadas foram semeadas em placas de 6 poços, durante 24 h. Uma ferida de largura-1mm foi feita através da monocamada com a ponta de uma pipeta de 200 uL. Então, fotos foram tiradas às 0, 6 e 12 h, usando um microscópio. As células PC-1.0 foram realizados como anteriormente descrito como um controlo. Cada experiência foi realizada em duplicado e por três vezes. Para confirmar o nível de três proteínas na célula knockdown, as células foram sujeitas a PCR em tempo real e análise de Western blot utilizando iniciadores e anticorpos específicos, respectivamente. Os iniciadores utilizados para a amplificação de FOS e IRS-1 estão listadas na Tabela S1.

Gene Ontologia e Enciclopédia Kyoto de genes e genomas via (KEGG) analisa e Ferramenta de Pesquisa para a recuperação de genes que interagem /Proteínas

Para a detecção de Gene Ontology (GO) termos significativamente enriquecido, foi usado o plugin Cytoscape BINGO [8,9]; proteínas fosforiladas foram diferencialmente expressos automaticamente montada a categorias de processo biológico, função molecular ou componente celular. GO grupos com uma corrigido

P

-valor 0,01 foram indicados para os diferentes níveis de significância. analisa Caminho de proteínas fosforiladas diferencialmente expressos foi realizado utilizando DAVID (o banco de dados para anotação, visualização e descoberta Integration) recursos de bioinformática (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [10] bioinformática e vias de sinalização significativamente alterados foram selecionados com base em um

P

-valor 0,01, e FDR (False Descoberta Rate) 10%. Enriquecimento poderia, portanto, ser quantitativamente medida usando o teste exato de Fisher modificado. Usando uma ferramenta de busca para a recuperação de genes que interagem /Proteínas (STRING) (https://www.string-db.org/) do banco de dados, obtivemos uma rede de interação proteína-proteína (PPI) [11]. Uma rede PPI foi construído quando uma pontuação de confiança de mais de 0,9 mostrou que apenas interações com um alto nível de confiança foram considerados como links válidos na rede PPI.

análise topológica da rede PPI

para uma melhor compreensão da rede PPI, o software CentiScaPe [12] foram utilizados para analisar as características topológicas da rede e para calcular a distribuição nó grau, comprimento de percurso médio, coeficiente topológica e intermediação. Poderíamos analisar diretamente redes de interação molecular usando ferramentas visualizadas, e obteve proteínas-chave interessantes. Além disso, um servidor web GeneMANIA (https://www.genemania.org/) foi utilizado para prever as redes. Tal ferramenta de servidor web fez previsões função do gene eficientes, incluindo a co-expressão, interações físicas, as vias e redes previstos, que são baseados em dados relatados anteriormente experimentais [13]. Neste relatório, utilizamos um método de ponderação selecionado automaticamente e humano usado como uma espécie de fonte de prever redes.

Estatísticas Análise

A análise estatística e gráficos foram realizadas utilizando GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego CA). Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). Comparações de dados quantitativos foram analisados ​​por Student

t

teste ou análise de variância entre os dois grupos (de duas caudas;

P

-Valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativo).

Resultados

diferencialmente expressos fosforilação de proteínas identificadas por PEX100 em células pancreáticas altamente (PC-1.0) e fracamente (PC-1) invasivos e metastáticos

proteínas fosforiladas Para identificar diferencialmente expressos sinalização associados entre altamente (PC-1,0) e fracamente (PC-1) células de cancro invasivo e metastático, os níveis de proteínas específicas fosfo-anticorpo nas duas linhas de células do cancro do pâncreas de expressão foram comparados. Dos 1318 anticorpos analisados ​​em experiências de microarray, um total de 57 proteínas mostrou expressão diferencial usando uma proporção ≥ dobra 2 como o critério de corte. Destes 57 proteínas, os níveis de expressão de 32 proteínas estavam acentuadamente aumentadas em PC-1,0, em comparação com as células PC-1 (Tabela 1 mostra os dez proteínas mais upregulated). Em contraste, os níveis de expressão de 25 proteínas foram significativamente menores no PC-1,0, em comparação com as células PC-1 (Tabela 2 mostra os dez proteínas mais regulada negativamente). Os rácios apresentados representam os níveis de expressão em células PC-1.0 em comparação com os níveis de expressão em células PC-1. CaMK1-α foi sobre-expresso em níveis elevados em células PC-1.0 Smad1 Considerando que foi regulada para baixo, revelando uma baixa intensidade de matriz. Além disso, quatro proteínas (AKT1, Chk2, p53 e p70S6K) com diferentes sítios de fosforilação foram encontrados, não só entre os up-regulamentada, mas também entre proteínas regulada para baixo. As imagens reais de chips matriz foram mostrados em S2 Mesa e a expressão de todas as proteínas foram listadas na Tabela S3.

Validação de proteínas de fosforilação por western blot e proteínas diferencialmente desempenhar um papel importante na migração celular e invasão de PC-1.0 metastático

Para validar os dados de fosforilação de proteínas, os níveis de expressão de seis proteínas seleccionadas aleatoriamente a partir de comparações de PC-1.0 e PC-1 células foram re-examinados por western blot (Fig 1). Western blots revelou que todas as seis proteínas mostrou aumento da fosforilação em células PC-1.0 consistentes com os dados de matriz, confirmando assim a fiabilidade deste último. Para compreender as relações funcionais da alteração diferencial de fosforilação da proteína em células altamente metastáticas PC-1.0, ensaios de invasão e de migração foram efectuados. análises de transferência de Western e PCR em tempo real foram realizados para confirmar a eficiência de inibidor de siRNA ou a regulação negativa (como mostrado na Tabela S3). Foi observada uma forte inibição da migração de FOS, IRS-1 e RAF1 utilizando siRNA ou anticorpo de bloqueio (Fig 2A), e em relação a invasão, FOS, IRS-1 e RAF1 também causou uma redução significativa na capacidade de invasão (Fig 2B).

Como se mostra, a expressão total de cada proteína foi igual em ambas as linhas de células, enquanto que no nível de fosforilação, a expressão das seis proteínas foi mais forte em células PC-1,0 do que as células PC-1. Os marcadores moleculares são indicados.

(A) Efeito de três proteínas sobre a migração após o uso de siRNA ou anticorpo de bloqueio em células altamente metastáticas PC-1.0. As células foram incubadas durante 24 h. A migração percentual foi calculada e representada graficamente. * Em comparação com o PC-1.0,

P

-valor 0,01. (N = 3) (B) Quantificação do Transwell ensaio para o grupo tratado e grupo de controlo. As células foram contadas em poços em triplicado e em três experiências idênticas, * Comparado com o PC-1,0,

P

-valor 0,01. (N = 3)

Classificação funcional, de rede e análise de caminho

Para entender os processos biológicos similares que se correlacionam com invasão e metástase de células de câncer de pâncreas, exploramos estes novamente usando o on-line ferramenta de anotação funcional, DAVID, e incluindo KEGG vias análise. análise termo GO mostrou que os alvos foram enriquecidos em muitos processos (Tabelas 3-5), incluindo a fosforilação de aminoácidos e modificação de proteínas pós-translacional. As análises revelaram via tais objectivos supra-regulados foram enriquecidas em 27 vias KEGG (Fig 3A), que eram essenciais para o metabolismo da via de sinalização da insulina (e do ciclo celular), Immunity (receptor de células T via de sinalização) e desenvolvimento (ErbB via de sinalização). Proteínas de formar uma rede de PPI e estão implicados na alteração e controlo invasão celular em diversos sistemas biológicos. Os dados são mostrados na Figura 3B e 3C. Fig 4A e 4D mostram a rede de interação construída em STRING após consultar o 32-regulada e 25 proteínas down-regulados encontrada em células PC-1.0. Além disso, quando a pontuação de confiança foi 0,900, CAMK1-α, MKK7 PIM-1 e /MAP2K7 já não estavam incluídos numa rede de sobre-regulada, bem como MAPKAPK2, citoqueratina 8, GATA1, GRK1, ACC1, PDGFRA e Smad1 numa rede regulados para baixo. Markov (MCL) e K-Means algoritmos de agrupamento foram então usados ​​para analisar melhor redes PPI. Em comparação, obtivemos uma consequência aproximado de cluster em que o corte MCL foi 2 e o corte K-médio foi de 4 em ambos regulado para cima (Fig 4B e 4C) e regulada para baixo (Fig 4E e 4F) redes PPI. Proteínas com menos ou nenhuma interação foi encontrado mais em direcção à periferia da rede. Outras investigações experimental é necessária destas proteínas não relacionadas, a fim de compreender a sua verdadeira função em uma rede de PPI.

KEGG e BioCarta via anotações funcionais do diferencialmente expressos up-regulada (A, C) e regulada para baixo (B (proteínas)

P

-Valores 0,01, Benjamin 0,05). pontuações de enriquecimento correspondentes a cada percurso fornecido pela ferramenta de anotação DAVID são exibidos como -log

P

-Valores. proteínas que foram BioCarta pathway anotações funcionais só foram enriquecidos na sinalização apoptótica, em resposta a danos no ADN sub-regulada.

(A) Uma rede PPI, como mostrado na vista interactivo, gerado por uma base de dados STRING para revelar as interacções funcionais entre proteínas up-regulamentados. Cada nó representa uma proteína, e cada aresta representa uma interação (

P

-Valores = 6.06E-12); (B)-regulada algoritmos de agrupamento MCL das proteínas derivadas usando STRING. MCL = 2; (C) algoritmos de agrupamento K-significa “proteínas reguladas para cima. K-Means = 4; mesmas consequências aproximados por dois clusters; (D) Uma rede PPI revela interações funcionais entre proteínas reguladas por baixo (

P

-valor = 1.47E-6); (E) para baixo-regulado algoritmos de agrupamento proteins’MCL. MCL = 2; (F) algoritmos de agrupamento K-significa “proteínas regulada para baixo. K-Means = 4.

Além disso, o software CentiScaPe, que calcular características topológicas de cada nó, foram usadas para obter uma compreensão em profundidade das características biológicas PPI da rede, mas não incluindo proteínas não relacionadas. A rede de PPI-regulação consistiu de 26 nós com um comprimento médio caminho de 1,89. grau nó era 6,62 ± 4,18 e 22,23 ± betweenness foi 35,72 (Tabela 6). Com o mesmo método, a rede de infra-regulação PPI exibido 17 nós com um comprimento médio de 2,04 caminho. grau nó era 3,65 ± 2,47 e 16,59 ± betweenness foi 29,58 (Tabela 7). Proteínas de alto valor eram mais importantes na rede e isso sugeriu um papel central na manutenção funcionalidade e a coerência dos mecanismos de sinalização. Em nossa rede de PPI-regulada, as proteínas do cubo com alto grau de nó e intermediação ( meios) foram AKT1, CTNNB1, FOS, NFkB-p65, SYK, TP53 e MYC. Por outro lado, a rede regulada para baixo incluídos BRCA1, LCK, AKT1, e TP53 (Fig 5). Notavelmente, AKT1 e TP53 exibida a pontuação mais alta para todas as centralidades computados, sugerindo seu papel regulador central na up-regulada proteínas e em uma rede regulada para baixo.

Todos os nós que têm um valor centralidade maior ou igual ao limite são destacados com uma cor cinza claro na tela de rede. (A) proteínas regulado para cima; (B) proteínas regulada para baixo.

Em seguida, fosfoproteínas diferencialmente expressos foram enviados para uma ferramenta GeneMANIA de prever uma rede de co-expressão. Como resultado, 20 genes foram adicionados à rede (Figura 6, Tabela 8). Uma tal rede de co-expressão contribui para explicar os processos distintos encontrados em linhas de células do cancro do pâncreas. Em geral, tais propriedades topológicas da rede podem melhorar a nossa compreensão dos genes-chave associadas com a invasão.

Uma rede de genes diferenciais foi gerado usando GeneMANIA. A rede de esquerda representa genes regulados positivamente e a rede direita representa genes regulados negativamente. Além disso, existem cinco genes em ambos os das redes para cima e para baixo-regulados (TP53, CHEK2, AKT1, RPS6KB1, RAF1). genes de consulta são indicados por pontos pretos e co-expressão é indicado por linhas de cor de rosa. nós cinza indicam genes previsto.

(Peso ≥ 0,04).

Discussão

Nos últimos anos, muitos pesquisadores têm utilizado endoscópica fina guiada por ultra-som aspirativa por agulha (EUS-FNA) como método diagnóstico pré-operatório para reduzir os procedimentos cirúrgicos desnecessários, em um esforço para atingir as taxas de sobrevivência mais elevadas [14,15]; no entanto, os resultados foram insatisfatórios. Como reduzir a invasão e metástase de câncer de pâncreas ainda é uma área de intensa pesquisa e contínuo problema. A fosforilação é o mais importante e está envolvida em muitos processos celulares (por exemplo, proliferação, diferenciação, transdução de sinal, o metabolismo, a apoptose,-sinalização celular, regulação transcricional e translacional) [16-23].

Conforme descrito na nossa estudo anterior, nós estabelecemos duas linhas celulares de cancro do pâncreas de um modelo de cancro pancreático experimental [5,6]. As células dissociadas não-células (PC-1) e dissociados (PC-1.0) mostram elevadas semelhanças histológicas mas diferem nas suas capacidades invasivas e metastáticas. Nós racionalizado que o uso de tais linhas celulares iria minimizar a influência da utilização de células de diferentes origens de tecidos. Portanto, a análise de phosphoproteomes diferencialmente expressa em duas linhas celulares (PC-1.0 e PC-1) é particularmente importante para o estudo de mecanismos de invasão e metástase do cancro do pâncreas.

De modo a entender melhor as diferentes funções biológicas produzidas por diferentes modificações de fosforilação da mesma proteína nas duas linhas celulares (PC-1.0 e PC-1), uma técnica de matriz fosforilação de alto rendimento foi usada nas nossas análises. A matriz detectados níveis de fosforilação de proteínas de resíduos de aminoácidos específicos (por exemplo, Ser, Thr, Tyr), e fornecida precisa e eficiente phosphoproteome perfis de cada linha celular de cancro pancreático. Depois de mineração de dados, observamos que as proteínas de expressão diferencial de 57 assinaturas, seis genes codificados 12 proteínas, com a fosforilação que ocorrem em diferentes locais (isto é, NFkB-p65, p70S6K, Smad2, Chk2, p53 e AKT1). A fosforilação específica de sítio de proteínas normalmente resulta em funções biológicas diferentes [24]. Mas as funções de vários locais de fosforilação em uma única molécula de proteína não ter sido claramente elucidadas. Portanto, Guo et ai. usados ​​imunoensaio proteômica nanofluidic (NIA) para analisar e caracterizar fosforilação de proteínas de vários sites diferentes [25]. Em comparação com o Guo et al. estudo, os nossos resultados indicam que a fosforilação em Thr72 e Ser124 de AKT1 têm um papel mais importante e podem estar intimamente relacionadas com a invasão e metástases do cancro do pâncreas.

De um modo geral, as quimiocinas são pequenas proteínas que desempenham um papel importante no controle a migração de diversas células [26]. Nossos resultados mostram que 10 proteínas que identificamos poderia ser classificado como quimiocinas (ie ITGB4, PLCG2, IRS-1, FOS, CTNNB1, PLCG1, CD227, PKD1, p53 e ACTC1), de acordo com https://www.phosphosite.org [27]. Outros tipos de proteínas relacionadas com a invasão foram fatores de transcrição (MYC, Rb, FOS, CTNNB1, NFkB-p65, p53, BRCA1, GATA1, Smad1 e Smad2) e proteínas do citoesqueleto (lamin A, citoqueratina 8 e ACTC1).

Através de análises KEGG via, verificou-se que estas proteínas de expressão diferencial existia em duas principais vias de sinalização (ErbB e neurotrofina vias de sinalização, como mostrado na Fig 2A). Entre a via alterada, encontramos PI3K e MAPK como principais intervenientes no processo de motilidade celular. Nos nossos estudos anteriores, verificou-se que a activação do EGFR mediada MEK /ERK via de sinalização induzida por invasão celular em células PC-1, pelo contrário, o inibidor de EGFR AG1478 poderia inibir acima via e reduzir a invasão celular em células PC-1.0 [28] . Neste estudo, detectou-hiperfosforilação de ErbB3, ErbB4, RAF1, P90RSK, MSK1, myc e FOS nas células PC-1.0 em comparação com as células PC-1, mas alterações em Grb2, MEK, ERK e Elk1 não foram observadas. Além disso, foram empregados RAF1 inibidor e FOS siRNA para estudar a relação entre a proteína e invasão. Os resultados revelaram que o knockdown de FOS ou RAF1 inibiu significativamente a migração e invasão das células PC-1.0. Nossos resultados, Grb2 /MEK de sinalização /ERK não foram observadas, talvez resultar de limitações metodológicas. Os nossos dados mostraram que P90RSK foi hiperfosforilada, no entanto, Kang et ai. informou que P90RSK2 promovido invasão e metástase de cabeça humana e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) [29]. P90RSK pode estar envolvido na regulação da invasão de células de cancro do pâncreas e metástase.

A outra via de sinalização (PI3K /AKT) envolve geralmente na proliferação de células e ciclo celular [30]. Em nossos dados, testamos vários reguladores a montante da PI3K /AKT tais como VEGFR1 /2/3, ErbB2 /3/4, PDGFRα, MET, EGFR, FLT3, KIT e IGF-1R. Entre estas proteínas, ErbB3 e ErbB4 são altamente fosforilada, em contraste, e PDGFRα kit são significativamente diminuída. Entretanto, observou-se que a fosforilação do IRS-1 em Ser 636 foi marcadamente aumentada, mas o IGF-1R não foi alterada. Notavelmente, a fosforilação do IRS-1 pode ser regulado negativamente por activação de p70s6k na via de sinalização de PI3K /AKT /mTOR [31]. Neste estudo, verificou-se um aumento na p70S6K fosforilação em Ser371 e Thr 421, e diminuição em Ser 418 fosforilação. Portanto, nossos estudos sugerem que PDGFRα e KIT downregulation no câncer de pâncreas leva à diminuição da p70S6K fosforilação de Ser 418, e aumentou IRS-1 fosforilação de Ser 636 via aumento de sinalização PI3K /AKT mTOR /p70S6K. Hiperfosforilação de IRS-1, posteriormente, mediada ativação da via PI3K /AKT. A descoberta pode indicar o mecanismo de resistência em câncer pancreático, como resultado, combinação de ensaios clínicos em câncer de pâncreas deve ser considerada.

Em resumo, identificando phosphoproteomes diferencialmente expressos, como revelado no nosso estudo, irá apontar para o mecanismos subjacentes à invasão e metástase de câncer pancreático. No futuro, precisamos prestar mais atenção à identificação do phosphoproteome ativado, em particular resíduos de aminoácidos específicos. Tomados em conjunto, a identificação de fosforilação de proteínas anormais, que está relacionada com a invasão e metástase, pode permitir-nos identificar novos biomarcadores para a detecção precoce do câncer de pâncreas.

Informações de Apoio

Tabela S1. As sequências dos iniciadores e o inibidor utilizado no ensaio.

-PCR em tempo real foi realizado para analisar o nível de FOS ou ARNm do IRS-1 em linhas celulares de knockdown. O nível de RAF1 knockdown foi confirmada utilizando Western blot

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152280.s001

(DOCX)

S2 Table. A matriz Phospho Explorador Antibody foi digitalizado em um scanner GenePix 4000

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152280.s002

(DOCX)

S3 Tabela. A expressão de todas as proteínas da matriz Phospho Explorador de anticorpos foram apresentados

As coordenadas e as proteínas foram indicados na tabela

doi:.. 10.1371 /journal.pone.0152280.s003

(XLSX)