Abstract

Fundo

A maioria de cancro colorectal (CRC) casos são evitáveis ​​através da detecção precoce e remoção de pré-cancerosa pólipos. Apesar de CRC é o segundo câncer interno mais comum na Austrália, apenas 30 por cento da população considera-se que os fatores de risco participam de programas de triagem de teste baseada em fezes. As evidências indicam um ensaio robusto, baseado em sangue, diagnóstico iria aumentar o cumprimento de triagem. Um número de biomarcadores potenciais de proteína à base de sangue de diagnóstico para CRC têm sido relatados, mas todos falta de sensibilidade ou especificidade para o uso como um stand-alone diagnóstico. O objetivo deste estudo foi identificar e validar um painel de biomarcadores à base de proteínas em coortes independentes que poderiam ser traduzidos a um não-invasivo teste de triagem confiável, baseado em sangue.

PRINCIPAIS CONCLUSÕES

em duas coortes independentes (n = 145 e n ​​= 197), foram avaliados sete biomarcadores individuais no soro de pacientes com CCR e idade /sexo controles pareados que mostrou uma diferença significativa entre os controlos e CRC, mas falta individualmente a sensibilidade para a aplicação de diagnóstico. Usando estratégias de regressão logística, identificou-se um painel de três biomarcadores que discriminou entre os controlos e CRC com uma sensibilidade de 73% a 95% de especificidade, quando aplicado a qualquer um dos dois grupos. Este painel composto de insulina como fator de crescimento de proteína 2 (IGFBP2), Dickkopf-3 (DKK3) e piruvato quinase M2 (PKM2). Vinculativo

Conclusões

Devido à natureza heterogénea do CRC , um biomarcador único é improvável que tenha sensibilidade ou especificidade suficiente para o uso como um teste de rastreio de diagnóstico autónomo e um painel de marcadores pode ser mais eficaz. Nós identificamos um painel 3 biomarcador que tem maior sensibilidade e especificidade para a fase inicial (fase I e II) da doença do que o exame de sangue oculto nas fezes, levantando a possibilidade de seu uso como um teste de diagnóstico, rastreio arterial não invasiva.

Citation: Fung KYC, Tabor B, Buckley MJ, Priebe IK, Puriņš L, Pompeia C, et al. Protein-Based Blood (2015) Painel de biomarcador para a detecção do câncer colorretal. PLoS ONE 10 (3): e0120425. doi: 10.1371 /journal.pone.0120425

Editor do Academic: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemanha |

Recebido: 24 de setembro de 2014; Aceito: 22 de janeiro de 2015; Publicação: 20 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Fung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela CSIRO preventiva Saúde capitânia nacional da pesquisa e do Nacional de Saúde e do Conselho de Investigação médica (número de concessão 1.017.078) (https: //www. nhmrc.gov.au/) para LJC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro tipo de câncer mais comum diagnosticado em todo o mundo onde se constitui aproximadamente 10% de todos os diagnósticos de câncer e tem uma taxa de mortalidade anual estimada mais de 600.000 [1]. Países como Austrália, Nova Zelândia, Europa, os EUA e Reino Unido são relatados para ter a maior incidência da doença, no entanto, a incidência está aumentando em países como o Japão e os da Europa de Leste. A maioria dos casos (até 80%) são esporádicos em que os factores ambientais e de estilo de vida Acredita-se que desempenham um papel no seu desenvolvimento [2]. CRC é uma doença heterogénea, que se desenvolve através de uma acumulação de mutações genéticas e alterações epigenética no epitélio do cólon que, eventualmente, resulta na transformação neoplásica [3-5]. A natureza lenta e progressiva deste processo representa uma oportunidade para implementar programas de triagem e ferramentas de diagnóstico para a detecção precoce da doença que têm o potencial de reduzir a incidência e mortalidade associadas à CRC. Em uma tentativa de reduzir a incidência e para detectar a doença em seus estágios iniciais antes que os sintomas são evidentes, os programas de rastreio têm sido implementadas em muitos países, incluindo os EUA, Reino Unido, Austrália, Japão e Europa [6-8].

Atualmente, as ferramentas de diagnóstico mais amplamente utilizados incluem procedimentos endoscópicos como colonoscopia e retossigmoidoscopia, eo teste baseado guaiac fecal de sangue oculto (gFOBT) ou fecal de sangue oculto imunoquímica (iFOBT), também conhecido como o teste imunológico fecal ( FIT) [9]. Embora a colonoscopia e sigmoidoscopia são os procedimentos mais sensíveis para detecção de tumores colorretais e lesões pré-cancerosas (adenomas e pólipos), e pode ser potencialmente curativa se os pólipos são removidos, estes procedimentos são difíceis de implementar em uma base de toda a população devido ao custo, capacidade de invasão , especialização exigida, ea natureza demorada devido ao preparo intestinal necessário [10,11]. Enquanto barato e não-invasivo, o FOBT e FIT têm menor sensibilidade e especificidade que a colonoscopia (ou seja, estes testes têm taxas de falsos positivos mais elevados) e são mais bem sucedido em detectar doença em estágio final [10,12]. Além disso, o desempenho diagnóstico do FOBT e FIT é variável, com sensibilidades relatados para CRC entre 11-64% para gFOBT (79-98% de especificidade) e 56-89% para o FIT (83-97% de especificidade) [13]. Estes testes também são muitas vezes comprometida pela baixa adesão do paciente, as variações de procedimentos analíticos, tais como diferentes métodos de coleta de fezes e manuseio, a necessidade de múltiplas amostras de teste, e as variações na interpretação dos resultados dos testes [13,14]. Atualmente, apenas o gFOBT foi mostrado para reduzir a mortalidade CRC em grandes estudos clínicos randomizados [8,13].

Muitos estudos têm sido publicados biomarcadores de relatórios que podem ser implementadas como um teste não-invasivo para detectar CRC , especialmente em suas fases iniciais (Fase I e /ou doença pré-maligna). Um certo número de estratégias para a identificação de biomarcadores de proteína à base de sangue têm sido relatados na literatura, incluindo a análise de expressão proteómica e /ou o gene de tecido de tumor colo-rectal e proteínas secretadas. Embora alguns desses estudos identificaram potenciais painéis de proteínas ou genes adequados para a detecção CRC [15-19], os dados de estudos de acompanhamento, por exemplo, em grandes grupos de pacientes, não estão disponíveis. Atualmente, os biomarcadores mais promissoras parecem ser marcadores de metilação do DNA, incluindo septina metilado 9 (mSEPT9) medido em sangue [20-23] e um teste de DNA à base de fezes que consiste em BMP3 metilado, NDRG4, VIM e TFPI2 e uma forma mutante de KRAS [24]. Mais recentemente, um teste de DNA à base de fezes modificado que consiste em BMP3 metilado e NDRG4, KRAS mutantes e ß-actina como controlo, em combinação com a hemoglobina fecal foi testada numa população assintomática rastreio consistindo de 9.989 pacientes [25]. Notou-se que o teste de DNA tinha menor especificidade, uma taxa de falsos positivos superior e sofria de uma taxa de falha técnica maior, devido à sua natureza complexa, que pode dificultar a sua implementação como teste de triagem ampla população. Embora os testes de DNA baseada em fezes têm mostrado resultados promissores para a detecção CRC em ensaios clínicos, eles estão ainda a ser implementada na prática clínica ou como um teste de rastreio de toda a população.

Devido à natureza heterogênea da CRC, a biomarcador único é improvável que tenha sensibilidade ou especificidade suficiente para o uso como um teste de rastreio de diagnóstico autónomo e um painel de marcadores pode ser mais eficaz. Anteriormente, foi avaliado o desempenho e adequação de 32 biomarcadores de proteína no soro e /ou plasma de pacientes com câncer colorretal e controles normais [26] para a sua capacidade de diagnosticar CRC. Embora essa análise identificou 12 proteínas biomarcadores que diferiram significativamente entre os dois grupos, ninguém proteína teve sensibilidade e especificidade adequada para uso como um stand-alone de diagnóstico. Identificou-se também combinações de biomarcadores potenciais que representam diferentes aspectos do processo de doença que pode levar a um teste de diagnóstico para CRC. Aqui nós relatamos sobre a avaliação dos sete desses biomarcadores de proteína (IGFBP2, PKM2, DKK3, MAC2BP, inibidores teciduais de metaloproteinases 1 (Timp1), interleucina 8 (IL8) e interleucina 6 (IL6) como um teste de diagnóstico, rastreio potencial para CRC .

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os protocolos de pesquisa utilizados neste estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética relevantes Humanos investigação no Commonwealth Scientific industrial Research Organisation, Adelaide (CFNS Comitê-Proposta Ética em Pesquisa 17/03 (a) (b)), e do Hospital Royal Melbourne, Melbourne (projeto HREC 2.003,145 . 2.003,146) consentimento informado foi obtido de cada paciente antes da coleta de amostra de sangue

Amostra coleção

casos

os pacientes foram diagnosticados de CRC sem história prévia de doença. o sangue foi obtido antes da cirurgia em clínicas de cirurgia pré-admissão colorretais de uma rede de hospitais associados ao cancro do Biobank vitoriana, Melbourne, Victoria, Austrália, entre 2005 e 2011. Os pacientes que já tinham recebido quimioterapia e /ou radioterapia foram excluídos deste estudo. Para pacientes com CCR, amostras de sangue foram tomadas após o diagnóstico e pelo menos um dia antes da cirurgia. O estadiamento foi realizado de acordo com a classificação TNM para câncer de cólon e rectal [27].

As amostras de soro de pacientes com CRC e idade /sexo controles pareados foram coletados por meio de um procedimento operacional padrão, como descrito anteriormente [28,29]. O sangue foi recolhido em tubos de gel de soro (Scientific Specialties Inc., USA) e cada amostra foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante 30 minutos antes da centrifugação (1,200g, 10 min, temperatura ambiente). A fracção de soro foi então transferida para tubos de 15 mL limpar e centrifugadas novamente (1,800g, 10 min, temperatura ambiente) antes de ser distribuído em alíquotas (250 ul) e armazenados (-80 ° C). Todas as amostras foram processadas e armazenadas dentro de 2 horas de recolha

análise de Biomarcadores e identificação do painel de biomarcador

Os seguintes biomarcadores foram medidos utilizando kits ELISA comercialmente disponíveis de acordo com os respectivos protocolos de fabricante:. IGFBP2 (Diagnostic Systems Laboratories, EUA ou Demeditec Diagnostics GmbH, Alemanha), MAC2BP (Bender MedSystems GmbH, Áustria), PKM2 (Schebo Biotech, Alemanha), DKK3 (R D Systems, EUA) e TIMP1 (R D Systems, EUA) . IL6 e IL8 foram analisados ​​como ensaios baseadas em esferas provenientes de R D Systems (Minneapolis, MN, USA). Para cada ensaio, as amostras foram medidas em duplicado e em casa de amostras de controlo de qualidade (CQ) foram incluídos. As amostras QC consistiu de uma amostra normal reunido (n = 41) e reunidas amostra do paciente CRC (n = 41). Para cada ensaio, os coeficientes de inter- e intra-ensaio de variação (CV) foram inferiores a 10%. Isto é consistente com as especificações do fabricante.

Para os testes ELISA padrão, o sinal de absorvância ou de fluorescência foi detectada utilizando o Wallac Victor

3 1420 contador multilabel (Perkin Elmer, EUA). As concentrações de biomarcadores foram derivados a partir da respectiva curva padrão usando o software WorkOut (versão 2.0). Para IL8 e IL6, dados preliminares foram analisados ​​utilizando o software IS2.3 Luminex (Qiagen, Hilden, Alemanha).

O pacote de software Prism (v6, Graphpad Software Inc., San Diego, CA, EUA) e os pacotes de software estatístico R foram utilizados para análise estatística. O teste de Wilcoxon rank sum não paramétrico foi utilizado para determinar a diferença estatística entre pacientes com câncer e controle e análise das características do operador receptor (ROC) foi realizada para avaliar o desempenho diagnóstico para cada marcador e para determinar a sensibilidade para cada em 95% especificidade. Bootstrap intervalos de confiança com 20.000 resamples de bootstrap para a área sob a curva (AUC) foi realizada utilizando o pacote de R Proc [30].

Os biomarcadores foram selecionados para o painel usando seleção de variáveis ​​stepwise forward e critério de informação Bayesiano (BIC) pena para evitar o excesso de montagem. Este processo de seleção de variáveis ​​e estimativa de coeficientes foi realizado em grupos 1 (conjunto de treinamento) e depois para a coorte 2 (conjunto de dados de teste). O modelo foi então aplicado a ambas as coortes para identificar os melhores painéis de desempenho que cruzam validados.

Resultados

Desempenho de biomarcadores individuais medidas no soro de CRC e controle pacientes

as características clínicas dos pacientes são mostradas coortes na Tabela 1. os níveis de todos os sete proteínas diferiam significativamente entre os grupos de doentes e de controlo, tanto na formação e coortes de teste (Tabela 2 e Fig S1.). Com a excepção de DKK3, todos os marcadores estavam elevados no grupo de pacientes. análise ROC também foi realizado para determinar a capacidade de cada proteína para discriminar entre os grupos de controlo e paciente (Tabela 3 e S2 Fig.). PKM2 foi o melhor biomarcador realização com uma sensibilidade de 56% (p 0,0001) e 59% (p 0,0001) a 95% de especificidade para CRC geral, quando medido nas coortes de treino e de teste, respectivamente. Da mesma forma, PKM2 também provou ser o marcador de maior sucesso na identificação de CRC em cada estágio da doença, quando comparado com a população de controlo neste estudo em particular, incluindo a doença fase precoce (sensibilidade de 48% (p = 0,0008), 52% (p 0,0001 ), 61% (p 0,0001) e 75% (p 0,0001) para as fases I, II, III e IV, respectivamente, na coorte de formação e as sensibilidades de 52% (p 0,0001), 65% (p 0,0001) , 54% (p 0,0001) e 80% (p 0,0001) para níveis I, II, III e IV, respectivamente, no grupo de teste) (Tabela S1). As características de biomarcadores individuais nos grupos de teste de desempenho de formação e pode ser encontrada na Tabela S1. Quando considerados individualmente, nenhum destes biomarcadores tiveram sensibilidade suficiente para diagnosticar CRC.

Identificação de um painel de três biomarcador para o diagnóstico CRC

Usando logística stepwise forward regressão aplicada ao conjunto de dados de treino (grupo 1), foi identificado um modelo de três biomarcador que consiste em DKK3, PKM2 e IGFBP2 que pode diagnosticar CRC com uma sensibilidade de 73% a 95% de especificidade (Tabela 4). Além disso, este modelo de três biomarcador provou ser robusto quando validado no grupo de teste (grupo 2, sensibilidade de 73% a 95% de especificidade), e foi capaz de discriminar entre controlos e pacientes com CCR em diferentes fases TNM com sensibilidade semelhante (Tabela 4). Importante, este modelo biomarcador é capaz de identificar os pacientes com doença de fase inicial com alta sensibilidade (ou seja, 57% e 76% de sensibilidade, a especificidade de 95% para as etapas I e II, respectivamente, na coorte de formação e 59% e 84% para fases I e II, respectivamente, no grupo de teste). FIG. 1 mostra a curva ROC para o modelo de três biomarcadores e as características do modelo de desempenho está detalhado na Tabela 4.

Discussão

Anteriormente, medidos 32 biomarcadores de proteína no plasma e no soro de pacientes e controlos [26] CRC. Estes biomarcadores foram inicialmente identificados como sendo potencialmente útil para o diagnóstico CRC com base na biologia, microarray expressão gênica e de dados de proteômica, de ambos os nossos próprios estudos e da literatura. Em nosso estudo anterior, nós medimos PKM2 no plasma e determinou que ele teve 19% de sensibilidade (a 95% de especificidade), enquanto que no soro observamos sensibilidade de 56% a 95% de especificidade. Quando medido no soro, PKM2 foi o melhor biomarcador para realizar diagnóstico CRC quando comparado com os outros biomarcadores que medidos. Além disso, também foi o melhor marcador de desempenho ao distinguir doença em estágio inicial (sensibilidade 48%). Como uma extensão adicional a este estudo, temos vindo a desenvolver uma avaliação mais aprofundada das sete destas proteínas em duas coortes de caso controle independentes (grupos 1 e 2). Além disso, foram identificados um painel de três biomarcadores de proteína que é capaz de diagnosticar CRC a partir de uma população de controlo com uma sensibilidade de 73% na% de especificidade 95 em ambos os grupos de formação (n = 145) e de teste (n = 197) no nosso estudo. Embora esses estudos iniciais são promissores, estamos actualmente a realizar mais testes de nosso painel de biomarcador em uma coorte de pacientes que inclui doenças não malignas colo-rectal (por exemplo, doença inflamatória intestinal, diverticulutis), adenomas, pólipos benignos e /ou pré-cancerosas e outros tipos de câncer. Isto irá permitir-nos determinar a especificidade do painel para detecção CRC e sua sensibilidade para a fase precoce ou doença pré-maligna.

O nosso painel de três biomarcador consiste em IGFBP2, DKK3 e PKM2, e cada uma dessas proteínas são conhecidas por ser biologicamente importante na doença CRC e progressão e são representativos da heterogeneidade desse tipo de câncer. Por exemplo, existem numerosos relatórios indicando o envolvimento de IGFBP2 na proliferação, migração e invasão de células cancerosas [31], e os níveis elevados de IGFBP2 também foram relatados no soro e no plasma de pacientes de CRC quando comparado com os controlos normais [32- 35]. O silenciamento transcricional de DKK3 devido à hipermetilação do promotor em tecido CRC tem sido relatada [36,37], e isto pode explicar a diminuição dos níveis no soro de pacientes de CRC observou-se neste estudo. No entanto, um nível de expressão elevada de proteína nas células endoteliais de microvasos de tecido de cancro foi também relatada indicando a importância potencial de DKK3 em progressão CRC, devido a angiogénese e neovascularização [38]. PKM2 é uma enzima citosólica envolvido no metabolismo da energia que é expressa por células tanto em proliferação e células cancerosas normais. a expressão elevada da forma dimérica específico de tumor de esta proteína foi relatada em CRC e outros cancros gastrointestinais [39-41] e numerosos estudos têm avaliado a sua utilidade como marcador baseia-sangue fecal ou para o rastreio e /ou diagnóstico de CRC [40 , 42-46]. A principal desvantagem quanto à sua utilidade como um marcador independente de diagnóstico tem sido a sua pouca especificidade para CRC.

O desempenho do modelo de três biomarcadores que consiste em IGFBP2, DKK3 e PKM2 (sensibilidade de 73% a 95% de especificidade ) é equivalente à cotado para FOBT e FIT (sensibilidade 61-79% a 86-95% de especificidade) [12,14,47-49]. Além disso, o painel de biomarcadores que nós identificamos parece desempenhar bem para a detecção de doença de fase precoce (isto é, Fase I e II da doença). Este desempenho superior em fases iniciais, sobretudo na fase I, proporciona uma vantagem importante do nosso painel de biomarcador sobre testes não-invasivos usados ​​atualmente para CRC. Esta é uma consideração importante, pois a detecção precoce de doenças e gestão adequada do paciente melhora a sobrevida global para esta doença. Mais testes do painel em uma grande coorte prospectivo, que inclui pacientes com adenomas de alto risco ou pólipos, são necessárias para compreender plenamente a utilidade potencial do nosso painel para fins de diagnóstico ou de rastreio. É também possível que o painel de biomarcador pode ser utilizado em combinação com modalidades actuais de rastreio, tais como FOBT, ajustar, ou os marcadores de ADN baseados em fezes teste mSEPT9 plasma ou recentemente relatada [20-24], para melhorar ainda mais o desempenho de diagnóstico.

Embora se saiba que os programas de rastreio pode reduzir a mortalidade por CRC, provas emergentes sugerem que um teste à base de sangue não-invasivo, com elevada sensibilidade e especificidade para a doença, em particular a doença fase inicial, pode ser vantajoso para superar percebida barreiras à participação associada com o uso de FOBT [50,51]. Embora não-invasiva, a FOBT não é específico para a CRC e não é capaz de detectar com precisão a doença fase precoce. Além disso, o valor deste ensaio é dificultada pela fraca adesão dos pacientes [50]. Os dados de estudos que avaliam a preferência do paciente para testes de sangue contra endoscopia, incluindo colonoscopia ou sigmoidoscopia, não estão disponíveis. No entanto, estudos investigando a preferência do paciente entre FOBT e mostrar resultados conflitantes colonoscopia. Por exemplo, Schroy et ai. indicam que os pacientes têm uma preferência para testes nas fezes para exames de rotina, devido à sua conveniência e natureza não-invasiva [52]. Outro estudo realizado por Hol et al. concluiu que despistagem mediante a utilização de técnicas de endoscopia eram preferíveis entre uma população de triagem devido à certeza do diagnóstico e redução no risco de doença [53]. Isso indica que, para ser implementada com sucesso na comunidade, alta sensibilidade e especificidade para diagnosticar com precisão e confiabilidade CRC e informar os procedimentos de acompanhamento do paciente são características importantes de qualquer teste de diagnóstico que deve ser considerado.

Informações de Apoio

S1 fig. gráficos de dispersão para as sete biomarcadores avaliados nos grupos de treinamento e teste

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120425.s001

(PDF)

S2 Fig. operador receptor curvas características para os sete biomarcadores avaliados nos grupos de treinamento e teste

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120425.s002

(PDF)

S1 Table. As características de desempenho dos biomarcadores individuais nos grupos de treinamento e teste

doi: 10.1371. /journal.pone.0120425.s003

(PDF)

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao cancro do Victorian Biobank (Melbourne, Victoria) por sua assistência com recolha de amostras.