Sumário

Hedgehog (Hh) de sinalização desempenha um papel essencial em vários processos de desenvolvimento, e os seus resultados aberrantes de regulação em distúrbios genéticos ou doenças malignas em vários tecidos. Hiperativação da sinalização Hh está associada ao desenvolvimento de câncer de pulmão, e tem havido grandes esforços para investigar como controlar via de sinalização Hh e regulam a proliferação de células cancerígenas. Neste estudo, investigou um papel de CDO, um co-receptor de Hh, no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). A inibição da sinalização de Hh através sant-1 ou siCDO em células de cancro do pulmão e tumorigenicidade reduzida proliferação, juntamente com a redução na expressão de componentes de Hh. A análise histológica com o tecido do rato NSCLC demonstrou que CDO foi expressa em grau avançado do câncer, e precisamente co-localizada com GLI1. Estes dados sugerem que CDO é necessário para a proliferação e sobrevivência das células de câncer de pulmão através de sinalização Hh

Citation:. Leem YE, Ha HL, Bae JH, Baek KH, Kang JS (2014) CDO, um HH-co-receptor , Medeia Lung Cancer proliferação celular e tumorigenicidade através Hedgehog sinalização. PLoS ONE 9 (11): e111701. doi: 10.1371 /journal.pone.0111701

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de junho de 2014; Aceito: 01 de outubro de 2014; Publicação: 04 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Leem et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) de subvenção financiada pelo governo da Coreia (MSIP) (2012R1A1A2005448 para YEL) e (NCR-2011-0017315 para JSK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Hh via de sinalização é uma das vias de sinalização essenciais, que está implicada no desenvolvimento embrionário, a morfogénese e a proliferação de [1], [2], [3], [4], [5], [6]. O mecanismo molecular como regular a sinalização Hh ainda está sob investigação. Geralmente, uma vez Hh ligando se liga ao seu receptor primário, Patched 1 (PTCH1), Smoothened (SMO) é libertado a partir da inibição PTCH1-mediada e migra para cílio primário. Estimulação da SMO desencadeia transdução de sinal sequencial que ativa os fatores de transcrição da família GLI. A forma activa da proteína GLI é translocado para dentro do núcleo e regula a expressão de genes alvo a jusante, incluindo PTCH1 e GLI1 [1], [7], [8].

A perda de sinalização de Hh durante o desenvolvimento embrionário está associada a diversas doenças genéticas, incluindo holoprosencefalia, que é a mais comum malformação do prosencéfalo [9], [10], [11]. Em contraste, a activação constitutiva de sinalização de Hh tem sido conhecida por estar envolvida na iniciação e progressão de vários cancros em pele (carcinoma das células basais esporádicos, CBC), cérebro (meduloblastoma), músculo (rabdomiossarcoma, RMS), tracto gastrointestinal, próstata, pâncreas e pulmão [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23] . A ligação de Hh caminho para a carcinogênese foi inicialmente relatado na síndrome de Gorlin em que a mutação no

gene PTCH1

é responsável pela incidência de câncer [24]. Além disso, a regulação positiva aberrante de Hh sinalização através da perda de PTCH1 ou a mutação de ganho de função em

SMO

foi extensivamente estudado em BCC e meduloblastoma [13], [14].

o significado de sinalização de Hh em carcinogénese também foi explorada na proliferação de cancro do pulmão de pequenas células (SCLC), que é um cancro do pulmão altamente agressivo que constitui cerca de 20-25% de todos os cancros do pulmão [21]. A inibição da actividade de sinalização de Hh utilizando antagonista SMO, ciclopamina resultou na redução do crescimento grave em linhas de células SCLC [21], [23], [25], [26]. Considerando que foi inicialmente sugerido que a sinalização Hh é menos associado com NSCLC, o tipo mais dominante do câncer de pulmão e o tumor maligno mais letal. No entanto, recentemente várias evidências têm indicado que NSCLC é dependente da actividade de sinalização de Hh em proliferação bem como [27], [28], [29], [30].

Embora o principal receptor de Hh é contra PTCH1, existem co-receptores adicionais que assistem a Hh sinalização positiva, como CDO, BOC e GAS1 [31], [33], [34], [35] [32]. sinalização de Hh está envolvido em vários processos celulares e de desenvolvimento, e, consequentemente, os regulamentos apertados são absolutamente necessários para a sinalização de reconhecer e controlar micro-variação no ambiente celular. Enquanto isso, muitas linhas celulares de cancro do pulmão estão a produzir vários níveis de ligando Hh [25], [30]. Mesmo se um baixo nível de ligando HH é visto em algumas células do cancro do pulmão, estas células revelam o aumento na expressão do gene alvo Hh implicando a regulação positiva de sinalização de Hh. Sob estas circunstâncias, a presença de co-receptores Hh pode contribuir para a amplificação da sinalização extracelular fraco em células cancerosas, para além do ajuste fino da sinalização de Hh durante a embriogénese.

Entre os co-receptores, é CDO uma proteína transmembranar que pertence à imunoglobulina (Ig) /fibronectina de tipo III (FNIII) superfamília e desempenha um papel importante na diferenciação muscular, desenvolvimento embrionário e diferenciação neuronal [36], [37], [38], [39]. A análise estrutural demonstraram que as repetições de fibronectina no domínio extracelular de CDO é crítico para a ligação de Hh [39]. A regulação positiva da via de sinalização Hh por CDO foi inicialmente identificado em

Drosophila

. Sabe-se que ihog (ortólogo de CDO em

Drosophila

), juntamente com boi (ortólogo do BOC em

Drosophila

) é importante para a ativação da sinalização Hh no desenvolvimento de asa imaginal disco [ ,,,0],40], [41]. Nos ratos, a deficiência Cdo apresenta vários defeitos congénitos, incluindo Holoprosencefalia, que é o defeito frequentemente, associada com mutações em HH sinalização [39], [42]. Além disso, CDO está envolvido na HH-mediada padronização neural ventral do tubo neural de mamífero [31] e, bem como na proliferação de Hh mediada por células neuronais em grânulos cerebelares progenitores (CGNPs) [43].

Além para o papel de CDO no desenvolvimento de órgãos e diferenciação celular, a associação de CDO a sinalização de Hh, que está implicado na tumorigénese nos curiosos para elucidar um papel de CDO na proliferação de células do cancro do pulmão. No presente estudo buscou-se desvendar a contribuição de CDO para Hh sinalização no CPNPC e, adicionalmente, a proliferação e tumorigenicidade em células de tumor de pulmão. Verificou-se que o nível de CDO foi maior em células NSCLC, e que a inibição da expressão de CDO downregulated sinalização de Hh, e reduziu a proliferação e a tumorigénese em células de cancro do pulmão humano. Além disso, a expressão CDO foi observada em fase avançada de tecidos NSCLC. Tomados em conjunto, os dados sugerem que o CDO, como um co-receptor de Hh, é crucial para a proliferação de células cancerosas e a tumorigenicidade, e, portanto, pode ser considerado como um bom candidato para aplicações terapêuticas anti-cancro.

Materiais e Métodos

culturas e reagentes celular

linhas de células BEAS-2B e NSCLC, A549, H1299, H460 e H520 foram gentilmente cedido pelo Prof. DH Kim (Universidade Sungkyunkwan, Samsung Biomedical Research Institute, Coreia) [44]. A cultura da BEAS-2B seguidas as diretrizes da ATCC. células NSCLC foram cultivadas numa incubadora humidificada com 5% de CO

2 em meio RPMI-1640 (Invitrogen) com soro fetal bovino a 10% (FBS), suplementado com penicilina e estreptomicina. Para medir a expressão do mRNA /proteína ou morte celular em células siCDO-transfectadas, o meio foi mudado para meio RPMI-1640 com FBS a 0,5% um dia após a transfecção, e as células transf ectadas foram cultivadas durante 2 dias adicionais. 50 uM de SANT1 (S4572, Sigma-Aldrich) dissolvida em DMSO ou o volume correspondente do veículo de DMSO foi tratada com células cultivadas em meio RPMI-1640 contendo FBS a 0,5% no ponto de tempo indicado.

experiências de interferência de ARN

Cada linha celular foi transfectada com NSCLC siCDO usando reagente Lipfectamine RNAiMAX (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As seguintes sequências foram utilizados como ARNsi contra CDO. siCDO # 1, sentido, 5′-GGAUCUUGGACCCUUAUGUUU-3 ‘, anti-sentido, 5′-ACAUAAGGGUCCAAGAUCCUU-3’. siCDO # 2, sentido, 5′-CUUCAAAGUCGAAUAUAAAUU-3 ‘, anti-sentido, 5′-UUUAUAUUCGACUUUGAAGUU’. Para

in vivo

ensaio tumorigenicidade, células A549 que expressam de forma estável RNA pequeno hairpin (shRNA) contra o CDO foram preparadas por transfecção com pSUPER-puro-shCDO. pSUPER-puro-shCDO vector foi relatado anteriormente [42].

preparação de RNA total e em tempo real qRT-PCR

O RNA total foi isolado usando o kit de extração de RNA total easyBLUE (Intron Biotecnologia Inc. , Coreia), e o ADNc foi sintetizado utilizando o kit de reagente PrimeScript RT (Takara, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Em tempo real de qRT-PCR foi realizada utilizando SYBR Premix kit ExTaq (TAKARA, Japão) e Thermal Cycler sistema em tempo real dos dados (TP800, TAKARA, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. A frente (F) e inverso (R) iniciadores utilizados neste estudo estão listados abaixo.

SHH

F, 5′-CCAAAAAGCTGACCCCTTTA-3 ‘, R, 5′-GCTCCGGTGTTTTCTTCATC-3’;

PTCH1

F, 5′-CAGCACTGGAAAACTCGTCA-3 ‘, R, 5′-TCTGATGAACCACCTCCACA-3’;

GLI1

F, 5′-AAGGGGTTTCTATCCTTCCAGA-3 ‘, R, 5′-TCCTTTATTATCAGGAAACAGTGTCA-3’;

CDO

F, 5′-GGGAAATACATCTGCGAAGC-3 ‘, R, 5′-CTGAGCAGCATCAGGAAGTG-3’;

18S rRNA

F, 5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3 ‘, R, 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3’. A quantificação relativa de uma expressão do gene foi descrito como vezes de mudanças relativas nos níveis de ARNm em comparação com um controlo, utilizando o 2

-ΔΔCt equação, [ΔΔCt = ΔCt (gene alvo) -ΔCt (gene de referência)]. 18S rRNA foi usado como um gene de referência.

A proliferação celular e a viabilidade de ensaio

As células foram semeadas a uma concentração de 5 × 10

3 ou 1 × 10

4 por células de 96 poços e cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 0,5% de FBS. As células tripsinizadas foram coradas com solução de azul de tripano (TB), e as células viáveis ​​não-coradas foram contadas. Para o ensaio de MTT, 20 uL de 5 mg /ml de MTT (brometo de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] brometo de 2,5-difeniltetrazólio) foi adicionado a 5 x 10

3 ou 1 × 10

4 células por 96 poços. Após 4 horas de incubação, a 37 ° C, o caldo de cultura foi mudado para 200 ul de DMSO. A absorvância foi medida a 595 nm. Para o ensaio de BrdU, as células foram cultivadas com 10? M de bromodesoxiuridina (BrdU; Sigma-Aldrich Corp.) durante 1 h. As células fixadas em 4% de PFA foram sondadas com anticorpo anti-BrdU (Chemicon International Inc.). A fluorescência foi detectada por Alexa Fluor anticorpo anti-rato de cabra 488 (Molecular Probe).

A citometria de fluxo de ensaio de apoptose

A apoptose foi medida usando ApoScan Anexina V kit de detecção de apoptose FITC (BioBud, Coreia ) e de fluxo BD FACS CANTO II citómetro (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante.

Western blot

análises de Western blot foram realizados tal como descrito anteriormente [37]. Os anticorpos primários utilizados neste estudo estão listados como a seguir; Clivada Caspase3 (# 9664, Cell Signaling), Caspase9 (SC-81663, Santa Cruz), Cdk2 (sc-6248, Santa Cruz), ciclina D1 (SC-246, Santa Cruz), ciclina E (sc25303, Santa Cruz), GAPDH (AbFRONTIER, Coreia), p21 (sc-6246), p27 (ab7961, Abcam).

Colony formando ensaio

Cinco mil células foram suavemente misturado com 10% FBS RPMI-1640 meio contendo 0,35% de agarose. A mistura sobreposta no fundo de agarose a 0,5% com meio com FBS a 10% em placas de 6 poços. As células plaqueadas foram incubadas a 37 ° C numa incubadora humidificada, durante 3 semanas, com alimentação de forma a cada segundo dia. A formação de colónias foi visualizado com 0,01% de violeta de cristal e analisadas com um microscópio de dissecação. A quantificação do número de colónias por campo foi determinada utilizando o ImageJ. Cada experimento foi realizado em triplicado e repetido duas vezes

Em viv

o tumorigenicidade ensaio

5 × 10

6 do controle (pSUPER-puro.) – Ou as células A549 pSUPER-puro-shCDO-transfectadas foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus de 6- fêmea 8 semanas de idade. O volume do tumor foi medido a cada 4 dias, e calculado como descrito [45]. Todos os estudos com animais foram revisadas e aprovadas pelo Comité Internacional de Animal Care and Use (IACUC) da SKKU School of Medicine (SUSM). SUSM é uma Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC) instalação credenciada internacional e age de acordo com o Instituto de Pesquisa Animal Laboratory (ILAR) guia.

Ratos e imunohistoquímica

LSL-K-ras

G12D

ratos foram fornecidos pelo Dr. Tyler Jacks (MIT Cancer Center) [46], [47]. As secções de parafina de

LSL-K-ras

G12D

ratos foram imunorreagir com 2B3 (ascite de ratinho contra CDO) e anticorpo anti-GLI1 (1:100; ab49314, Abcam), e detectados utilizando imunofluorescência. A microscopia confocal foi realizada a SKKU Escola de Facilidade de recursos partilhada Medicina-Microscopia com Zeiss LSM-510 microscópio confocal Meta. Todos os estudos com animais foram revisadas e aprovadas pelo Comité Internacional de Animal Care and Use (IACUC) da SKKU School of Medicine (SUSM). SUSM é uma Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC) instalação credenciada internacional e age de acordo com o Instituto de Pesquisa Animal Laboratory (ILAR) guia.

A análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas usando

t

teste de Student. Os dados foram apresentados como média ± SD de pelo menos três experiências independentes e considerado significativo quando

p

valores foram 0,05 (*) ou . 0.01 (**)

Resultados

componentes HH, que estão envolvidos na proliferação de células de cancro de pulmão foram inibidas pela depleção CDO no CPNPC

literaturas anteriores demonstraram que CDO actua como um receptor para o ligando acessório de Hh e regula positivamente a sinalização de Hh [39] , [48]. O próximo relevância da ativação de Hh sinalização para proliferação de células cancerosas nos levou primeiro a testar a expressão CDO em células NSCLC. Para fazê-lo, os ARN totais foram isolados a partir de células A549, H1299 linhas, H460 e H520 NSCLC, bem como a partir de células de pulmão BEAS-2B humano não-cancerosa, e utilizada para a análise de expressão CDO fazendo em tempo real de qRT-PCR. O resultado mostrou que o CDO foi expresso mais elevado em A549, H1299 e H520 células BEAS-2B do que no entanto H460 revelaram relativamente mais baixo nível CDO (Figura 1A). Além disso, foi investigada a expressão de componentes de sinalização de Hh em células NSCLC, executando em tempo real de qRT-PCR. A maior expressão de Shh foi observada em todas as quatro linhas celulares de NSCLC do que na célula de pulmão não-cancerosas. Do mesmo modo, os genes alvo a jusante de sinalização de Hh, PTCH1 e GLI1 foram expressos mais elevados nessas células NSCLC (Figura 1A). A549 mostrou relativamente mais baixo nível de ligando de Hh, em comparação com outras linhas celulares, contudo, revelou o aumento da expressão do gene alvo de Hh (PTCH1 e GLI1). Em H520, CDO, SHH e PTCH1 foram expressos comparativamente mais elevados do que quaisquer outras linhas celulares mas a expressão GLI1 foi bastante baixa.

A. Em tempo real qRT-PCR para os níveis de componentes de sinalização de Hh (CDO e SHH, Ptch1 e GLI1) em linhas celulares de NSCLC (A549, H1299, H460 e H520) BEAS-2B e expressão. Cada nível de expressão foi normalizada para o nível de rRNA 18S. A quantidade relativa de cada componente no CPNPC foi determinada como a quantidade de cada um em BEAS-2B foi ajustado para 1,0. B. O número de células viáveis ​​foi determinada por contagem de células no tempo indicado em A549, H1299, H460 e H520 tratadas com ou sem 50 uM SANT1. C. A viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT em tempo indicado em A549, H1299, H460 e H520 tratadas com ou sem 50 uM SANT1. A absorvância foi medida a 595 nm. D. RT-PCR para CDO em A549, H1299 e H460 transfectadas com o siARN mexidos ou siCDO # 1. E. em tempo real qRT-PCR para componentes de sinalização de Hh em A549, H1299 e H460 transfectadas com o siARN mexidos ou siCDO. O nível de expressão de cada componente foram normalizados para o nível de rRNA 18S. A quantidade relativa de cada componente em CDO-empobrecido CPNPC foi determinada como a quantidade de cada uma das células de controlo foi ajustado para 1,0 (linha vermelha). Todos os valores representam as médias de determinações em triplicado, pelo menos, ± 1 SD. *

p Art 0,05 e **

p

. 0,01

Em primeiro lugar, determinou o efeito inibitório do SANT1 na sinalização de Hh através da análise da expressão de Hh sinalização genes alvo após o tratamento SANT1. SANT1 se liga diretamente a SMO, impedindo a sinalização. Os ARNs totais isolados a partir de DMSO ou A549-tratada SANT1, H1299 e H460 foram usadas para analisar PTCH1 e expressões GLI1 em tempo real por qRT-PCR. Como previsto, a adição de SANT1 resultou na redução de PTCH1 e expressões GLI1 (Figura S1 S1) em arquivo. A fim de determinar o efeito de sinalização de Hh sobre a proliferação de CPNPC, que inibiu a sinalização de Hh em A549, H1299, H460 e H520 usando sant-1. Em seguida, a contagem de células e ensaio de MTT a TB foram realizadas para analisar a proliferação celular e a viabilidade. Os dados mostraram que a adição de 50 uM SANT1 resultou numa redução significativa no crescimento celular e a viabilidade de células NSCLC quatro individuais (Figura 1B e C). O efeito de inibição mediada SANT1 foi mais forte em pontos de tempo de atraso. Estes dados indicam que as células NSCLC testados exigem atividade de sinalização Hh para reter a sua proliferação.

Em seguida, foi perguntado se CDO contribuiu para a atividade de Hh sinalização no CPNPC. Para determinar isto, nós transfectadas três linhas de células diferentes de NSCLC, A549, H1299 e H460 com siCDO ou o siRNA mexidos e avaliou o efeito da deficiência de CDO sobre as expressões de componentes de sinalização de Hh em tempo real de qRT-PCR. A expressão de CDO foi substancialmente reduzida com siCDO em todas as linhas celulares (Figura 1D). Para esgotar expressão CDO, utilizamos duas sequências diferentes de siRNA, siCDO # 1 e # 2. Ambos foram siCDOs mostrando o esgotamento semelhante CDO e os resultados (dados não mostrados), e que está apresentando os dados de siCDO # 1. Os níveis dos componentes de sinalização de Hh, SHH, PTCH1, e GLI1 foram significativamente reduzidos em células de cancro do pulmão com depleção de CDO em comparação com o controlo scrambled (Figura 1E). Estes dados indicam que o CDO actua como um regulador positivo para Hh sinalização em células NSCLC, independentemente do seu nível de expressão.

depleção CDO conduziu a uma inibição da proliferação e indução de apoptose em CPNPC

como mostrado na Figura 1B e C, observou-se que a proliferação de células NSCLC foi bastante sensível ao SANT1. Assim, nós decidido determinar o efeito da sub-regulação de sinalização de Hh por CDO knockdown sobre a proliferação de células de cancro. Para tal, foi avaliada a taxa de proliferação celular de A549, H1299, H460 e H520 sob condição empobrecido em CDO efectuando a contagem das células e TB ensaio MTT (Figura 2 A e D). O resultado mostrou que o CDO knockdown em todas as células NSCLC testadas diminuíram consideravelmente o número de células e viabilidade, em comparação com o controlo scrambled. No entanto, a extensão da redução da proliferação não era mais forte do que no tratamento SANT1 (comparar com a figura 2A e D da Figura 1B e C, respectivamente). A inclinação dos gráficos para o número e viabilidade celular em células cancerosas com depleção de CDO ainda continuou subindo em mais ponto de tempo dia 5, em comparação com a de SANT1 tratamento mesmo que os níveis eram absolutamente muito mais baixos do que aqueles nas células de controle mexidos. Para avaliar o efeito de depleção de CDO na proliferação Além disso, foi realizado um ensaio de incorporação de BrdU. O resultado mostrou que o CDO knockdown em células NSCLC levado a 20-40% de diminuição na proliferação celular (Figura 2B).

. O número de células viáveis ​​foi determinada por células contagem em tempo indicado na controle- ou CDO-empobrecido A549, H1299, H460 e H520. B. A proliferação celular de CDO knockdown A549, H1299, H460 e H520 foi determinada pela incorporação de BrdU. análise de mancha C. Ocidental para a expressão de reguladores do ciclo celular (ciclina D1, ciclina E e Cdk2), repressores (p27 e p21) e marcadores apoptóticos (caspase 3 e caspase 9) no células A549 CDO knockdown controlo ou. GAPDH foi usada como um controlo de carga. ensaio D. MTT para a viabilidade celular do controle- ou A549 siCDO-transfectadas, H1299, H460 e H520 no momento indicado. A absorvância foi medida a 595 nm. E. anexina V-FITC apoptose e citometria de fluxo com o A549, H1299, H460 e H520 transfectadas com o siRNA mexidos ou siCDO. Todos os valores representam as médias de determinações em triplicado, pelo menos, ± 1 SD. *

p Art 0,05 e **

p

. 0,01

A diminuição na proliferação e viabilidade celular nas células NSCLC depleção de CDO poderia ser devido a progressão do ciclo celular reduzida e /ou morte celular aumentada. Para verificar os níveis de ciclo celular reguladores /repressores, células A549 transf ectadas com o mexidos ou siCDO foram examinados por imunotransferência de expressão. Como resultado, os níveis de proteína de reguladores do ciclo celular (ciclina D1, ciclina E e Cdk2) foram diminuiu, enquanto que as expressões de inibidores de CDK (p27 e p21) foram elevados em células A549 tratadas com siCDO em comparação com as células tratadas mexidos- (Figura 2C). Estes dados indicam que a inibição da expressão de CDO parece causar a paragem do ciclo celular em células NSCLC.

Em seguida, foi perguntado se a depleção CDO também foi associada com a morte celular. Imunotransferência contra formas clivadas de caspase-9 e -3 mostrou que estes factores apoptóticos foram detectados em mais forte A549 siCDO-transfectado do que no controlo (Figura 2C). Consistentemente, citometria de fluxo perfil para a apoptose com A549, H1299, H460 e H520 exibiu que a maior percentagem de anexina-V e células positivas duplas PI foi encontrado em quatro CPNPC com depleção de CDO individuais (Figura 2E). Portanto, estes dados sugerem que a diminuição da proliferação de CPNPC após depleção CDO é devido a um aumento da morte celular, bem como a progressão do ciclo celular atenuada.

A inibição da expressão de CDO no CPNPC mostraram a redução de

In vitro

e

in vivo

tumorigenicidade

a proliferação celular diminuída em CDO knockdown nos levou a investigar a influência da depleção de CDO em características malignas de células NSCLC. Para isso, avaliamos a extensão da formação de colónia de A549 siCDO-transfectadas, H1299, H460 e H520 células em agar mole (Figura 3A e B). O resultado apresentado uma redução acentuada na clonogenicidade

in vitro

quando o nível de CDO foi diminuída.

A. A formação de colónias do controle ou CDO knockdown A549, H1299, H460 e H520 em agar mole. B. A análise quantitativa da experiência descrita em A. números de colónias por campo foram determinadas por ImageJ. Os valores representam as médias de determinações em triplicado ± 1 SD. *

p Art 0,05 e **

p Art 0,01. C. representativas do crescimento do tumor 50 dias após a injecção subcutânea de ratinhos nus com a células A549 tratadas com controlo ou shCDO. D. O volume do tumor dos ratinhos nus com a A549 de controlo (n = 8) ou A549 com depleção de CDO (n = 10) descrito em C. Meios são mostrados como barras de erro. E. Os tumores dos ratos nus injectados com o A549 controlo ou células A549 com depleção de CDO mostrado na C.

A fim de apoiar os dados de

in vitro

tumorigenicidade, preparamos a linha celular estável de A549 expressando shRNA contra CDO, e injectados subcutaneamente ou o controlo células CDO-empobrecido para os flancos de ratinhos nus. O tamanho do tumor foi medido periodicamente. Como mostrado na Figura 3C, D, e E, uma diminuição significativa no crescimento do tumor foi observada em ratinhos nus injectados com A549 CDO-knockdown. Em conjunto, estes dados indicam que a CDO é necessária para o

in vivo

crescimento de células NSCLC.

expressão CDO foi detectado com GLI1 juntos em estágios avançados de CPNPC

Para determinar expressão CDO durante a progressão do cancro do pulmão, aproveitamos um modelo de rato NSCLC,

LSL-K-ras

G12D

ratos [46], [47]. Após a inalação intranasal de Ad-Cre para induzir tumorigênese pulmonar espontânea em

LSL-K-ras

G12D

ratos, foi avaliada a expressão CDO no tecido do tumor de pulmão mostrando quatro graus individuais de progressão do tumor por imuno-histoquímica fluorescente. CDO expressão era quase indetectável no grau 1, que é uma fase precoce da progressão do tumor com hiperplasia atípica adenomatosa (AAH) ou adenoma pequeno (Figura S2 no ficheiro S1). No entanto, sua expressão tornou-se enriqueceu como a progressão do tumor tem sido avançado. Em grau 2, em que são detectados os adenomas maiores com um pouco de núcleos aumentados, CDO expressão foi observada no citoplasma das células nas lesões tumorais, e esta expressão elevada foi mantida até que grau-3 (Figura 4). Como os tumores progrediram para ser adenocarcinomas invasivos (grau-4), CDO expressão foi ligeiramente diminuída e detectado na membrana celular. A expressão de CDO nas lesões tumorais levou-nos a investigar a expressão dos componentes da via de Hh no tecido do tumor. imagens confocais de imunofluorescência mostrou que GLI1, um dos factores de sinalização de Hh foi co-localizada com o CDO, e, adicionalmente, a sua expressão foi também altamente observada em lesões de grau-2 e -3 de tumor, não em grau-4 (Figura 4). A deficiência de expressão GLI1 no grau-4 é correspondente aos resultados sugeridos por vários estudos anteriores [23], [29]. Os resultados destas experiências indicam que a expressão CDO pode ser correlacionado com o aumento da regulação da sinalização de Hh em lesões tumorais e CDO também está provavelmente relacionado com a progressão de tumor de pulmão, e não na iniciação do tumor.

detecção de imunofluorescência confocal de CDO (vermelho) e GLI1 (verde) no grau-2, -3 e -4 tecidos tumorais de pulmão de

LSL-K-ras

G12D

modelo. núcleos celulares foram visualizados por DAPI (azul) e as imagens de contraste de fase são mostrados. barra de escala indica 50 um.

Discussão

Na verdade, o significado do CDO na proliferação de células cancerígenas foi um pouco descoberto e referi anteriormente. Hayashi

et al.

[49] fez um esforço para filtrar os genes que codificam proteínas transmembranares, que são altamente expressos em linhas celulares de cancro da próstata. Entre os candidatos, eles se concentraram em 83% de câncer de próstata overexpressed-CDO, e demonstrou que a redução da expressão CDO apoptose induzida e invasão celular inibida no câncer de próstata. No entanto, o mecanismo molecular como CDO está envolvida na proliferação de células de cancro da próstata não foi explicada. Neste estudo, revelou que o ajuste fino e up-regulação da sinalização Hh por CDO é bastante necessário para a proliferação de células do cancro do pulmão. Nós, adicionalmente, observou-se que o nível de ARNm de CDO nas linhas celulares de cancro de pulmão testadas excepto H520 foi maior do que em BEAS-2B, mas esta não foi significativa. Particularmente nível de ARNm em CDO A549 foi cerca de 1,7 vezes maior do que o nível basal de que em BEAS-2B. Mesmo que o aumento não é dramaticamente elevado, é digno de nota, se considerarmos que a expressão CDO é geralmente encontrada durante o desenvolvimento e embriogênese, e dificilmente detectado em tecidos adultos [36].

Ele foi inicialmente presumido que Hh sinalização raramente era ligado a NSCLC porque hh e GLI1 foram observados em um nível relativamente mais baixo em NSCLC. Desde então, os dados, incluindo os dados actuais, de inibição da proliferação NSCLC por um antagonista de SMO sugerido que a activação da sinalização de Hh através do baixo nível de Hh é certamente associadas com tumorigénese em NSCLC. Sob esta circunstância CDO pode desempenhar um papel crítico como um sensor de ligando para uma pequena quantidade de Hh, suportando o receptor principal, PTCH1 e afinal induz a activação da sinalização de Hh.

Enquanto isso, a função de CDO na célula proliferação parece ser ambivalente dependendo do nível de Hh. Delloye-Bourgeois

et ai.

[50], recentemente sugerido que, a nível de Hh é importante para CDO para funcionar como um receptor de dependência, o que está intimamente relacionado com a indução do sinal de pró-apoptótica. De acordo com eles, quando o ligando de Hh é bastante limitada, caspase 3/9 são recrutadas para o local de clivagem da caspase no domínio intercelular de CDO e evocar clivagem proteolítica. Esta clivagem mediada por caspases, eventualmente, desencadeia a apoptose. O papel de CDO como um receptor de dependência em conflito, basicamente com a função de CDO nas células cancerosas com a expressão de Hh, que nós descoberto neste estudo. Portanto, nível adequado de ligante Hh parece ser essencial para determinar a função de CDO como um regulador positivo da Hh sinalização ou um receptor dependência.

A inibição da sinalização de Hh por SANT1 em todas as células NSCLC mostrou uma redução mais substancial da proliferação celular e a viabilidade pelo ponto mais tempo, em comparação com a inibição pela depleção gene CDO (comparar com a figura 1B e C à Figura 2A e D, respectivamente). O efeito limitado de CDO knockdown na inibição da proliferação celular pode ser devido a que os outros co-receptores HH, tais como BOC e GAS1 ainda são expressos e ativa, mesmo que não se pode descartar a possibilidade de o esgotamento CDO transiente com siRNA. Demonstrou-se que todos os co-receptores HH, CDO, BOC, e são colectivamente GAS1 necessária para a activação completa de sinalização de Hh. CDO, BOC e GAS1 fazer individualmente um complexo com PTCH1 e a formação dos complexos é essencial para a proliferação CGNP HH-mediada [43]. Com base nisso, seriam necessários mais tarde entender os papéis de BOC e GAS1 durante tumorigênese HH-mediada.

Detecção de expressão CDO na lesão tumoral de alto grau de rato modelo NSCLC, não na lesão de grau 1 , excitado a curiosidade sobre o papel da sinalização de Hh mediada por CDO na progressão tumoral. Tem sido sugerido que dominantemente a sobre-regulação de sinalização de Hh parece estar correlacionada com o grau do tumor, embora seja controverso, em alguns tipos de cancro. No câncer de próstata, os níveis de mRNA de SHH, PTCH1 e GLI1 se haviam elevado em estágios mais avançados do câncer, e todos os componentes foram intimamente ligada à Gleason score [51]. Por outro lado, Gialmanidis

et ai.

[29] secções de tecido foram analisadas imuno-histoquimicamente embebidos em parafina de pulmão de 80 doentes com NSCLC. Eles descobriram que a activação da sinalização de Hh estava associada com o grau do tumor, e a alta activação da sinalização foi detectada principalmente no bem diferenciadas, moderadamente diferenciado tumores. A expressão robusta do CDO no alto grau de tumor pode levar a uma possibilidade de que CDO como um regulador positivo regula e resulta na activação aberrante de sinalização de Hh em desenvolvimento e progressão do tumor.

Até agora, os esforços para encontrar terapias anticâncer foram visando principalmente SMO, e na verdade vários inibidores SMO têm vindo a aplicar para a clínica [52]. A expressão de CDO é geralmente restrita em desenvolvimento e embriogénese, não na fase adulta. A expressão anormal de CDO no estado canceroso está possivelmente associada com a proliferação celular aberrante.