Abstract

metástase promovido pela inflamação crônica tem sido considerado como um grande desafio na terapia do cancro. citocina pro-inflamatória TNF pode induzir a invasão e metástase do cancro associado com a transição epitelial-mesenquimal (EMT). No entanto, os mecanismos subjacentes não são totalmente claras. Neste estudo, mostraram que o TNFa induz EMT em células HCT116 humanas e assim promove o cancro colorectal invasão (CRC) e metástase. EMT induzida por TNFa foi caracterizado por adquirir mesenquimais morfologia fusiforme e aumento da expressão de N-caderina e fibronectina com uma diminuição concomitante da E-caderina e ocludina Zona-1 (ZO-1). tratamento TNFa também aumentou a expressão do fator de transcrição Snail, mas não Slug, ZEB1 e Twist. A sobre-expressão de Snail induz uma mudança de E-caderina para a expressão de N-caderina nas células HCT116, que é uma característica de EMT. Por outro lado, knockdown de Snail atenuou significativamente EMT induzida por TNFa, em células HCT116, sugerindo que Snail desempenha um papel crucial na EMT induzida por TNFa. Curiosamente, a exposição a TNF rapidamente aumento da expressão do caracol proteína e localização nuclear Snail mas não mRNA nível supra-regulação. Finalmente, demonstrou-se que o TNFa elevada estabilidade do caracol, activando Akt e subsequentemente reprimir a actividade de GSK-3β e diminuindo a associação de caracol com a GSK-3β. Knockdown da GSK-3β verificou ainda mais a nossa conclusão. Tomados em conjunto, estes resultados revelam que a AKT /estabilização GSK-3β-mediada de Snail é necessário para EMT induzida por TNFa, em células de CRC. O nosso estudo fornece uma melhor compreensão da inflamação induzida por CRC metástase

citação:. Wang H, Wang H-S, Zhou B-H, Li, C-G, Zhang M, Wang X-F, et al. (2013) epitelial-mesenquimal de transição (EMT) induzida por TNF-α Requer AKT /GSK-3β Mediada Estabilização de Snail em cancro colo-rectal. PLoS ONE 8 (2): e56664. doi: 10.1371 /journal.pone.0056664

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Agosto, 2012; Aceito: 14 de janeiro de 2013; Publicação: 19 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa, No. 2011CB935800) e da National Science Foundation Natural da China (No. 30873032 e No. 81.071.712). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

inflamação crónica tem sido identificada estar intimamente associada a tumorigénese [1], [2]. evidências crescentes provaram que o microambiente do tumor inflamatória desempenha um papel crucial no desenvolvimento tumoral e metástase [3]. Microambiente tumoral é largamente orquestrado por células inflamatórias, que facilitam a desagregação da matriz extracelular, a angiogénese, remodelação de tecidos e, assim, promover a motilidade de células tumorais [4]. Além disso, as células tumorais em si podem secretar citocinas pró-inflamatórias que contribuem directamente para a progressão maligna [5]. As interacções complexas entre o tumor e células inflamatórias mediadas por citoquinas inflamatórias são um aspecto essencial do microambiente do tumor [6]. Factor de necrose tumoral α (TNFa), uma citoquina pró-inflamatória predominantemente produzido por macrófagos, é uma molécula-chave que regula os processos inflamatórios na promoção de tumores. Montagem evidências sugeriram que o TNFa medeia muitos processos críticos de progressão tumoral, incluindo a activação de oncogenes, lesão do ADN, e metástases de tumores [7].

tecido

epitelial-mesenquimal transição (EMT), uma conversão fenotípica essencial durante o desenvolvimento embrionário, remodelação, e cicatrização de feridas, desempenha um papel indispensável na invasão tumoral e metástase [8] – [10]. EMT é um processo reversível que muitas vezes ocorre na frente invasiva de muitos cancros metastáticos [11]. EMT pode ser desencadeada por diferentes sinais recebidos a partir microambiente do tumor, tais como TGF-p, EGF, e WNTs entalhe [12]. Durante os processos de EMT, células epiteliais perda de adesão intercelular, adquirem características semelhantes a fibroblastos e aumentar as propriedades migratórias e invasivos [13]. Uma das características mais bem definidas de EMT é a perda da expressão de E-caderina [8]. Um grupo de factores de transcrição, incluindo caracol, Slug, ZEB1, torção, tem sido implicado no controlo da EMT [14]. Snail, um factor de transcrição dedo de zinco identificado pela primeira vez em Drosophila, tem sido provado como um regulador chave EMT [15]. Estudos mostraram que Snail reprime a transcrição de E-caderina através da ligação ao local do E-box no promotor da E-caderina [16] – [18]. Os papéis de Snail na regulação EMT têm sido relatados em muitos tipos de cancro, tais como carcinoma da mama, carcinoma do ovário, etc [14], [18], [19]. O silenciamento de Snail por interferência de ARN estável induz a mesenquimais completa a transição epitelial (TEM) em células MDCK-Snail, que se associa com a inibição da invasão [20]. Além disso, a alta expressão de Snail também se correlaciona com o grau do tumor, recorrência, metástase nodal e maus resultados em pacientes [21] – [25]. Diversos mediadores inflamatórios, tais como TGFp, hipoxia e IL-6 pode regular positivamente caracol e, por conseguinte, desencadear EMT [3]. Estes resultados destacam a importância do microambiente na regulação do Caracol e na iniciação da EMT.

O câncer colorretal (CRC) é um importante problema de saúde em todo o mundo. A maioria das mortes de CRC são devidos a metástases que são resistentes a terapias convencionais. EMT é uma questão altamente relevante para CRC metástase [26]. No entanto, o papel do TNFa em EMT da CRC é raramente investigado e o mecanismo molecular subjacente permanece obscura. Aqui mostramos que EMT-TNFa induzida por meio da estabilização do caracol em HCT116 e células Caco-2. Também demonstramos que o TNFa estabiliza Snail ativando Akt e, assim, inibir a actividade de GSK-3β e diminuindo a associação de GSK-3β e Caracol.

Materiais e Métodos

produtos químicos e reagentes

NF-kB inibidor BAY11-7082, PD98059 inibidor de ERK, inibidor de p38 MAPK SB-203580, inibidor de PI3K LY294002, lítio inibidor de GSK-3β (LiCl) e inibidor de proteassoma MG132 foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Os anticorpos primários contra a E-caderina, Zona ocludina-1 (ZO-1), Snail, ZEB1, p-GSK-3β (Ser9), GSK-3β, P-Akt (Ser473), Akt, e β-catenina foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (MA, EUA). O anticorpo primário contra Histona H2A.X foi obtido a partir de Bioworld (Tecnologia Bioworld, Minneapolis, MN, EUA). A proteína A /G-Sepharose e os anticorpos primários contra N-caderina, ubiquitina, β-actina, α-tubulina foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). O anticorpo primário a fibronectina foi obtido a partir de Boster Biological Engineering. A peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário, Alexa Fluor 488/594 de anticorpo secundário conjugado, DAPI e Lipofectamine 2000 foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). proteína TNF humano recombinante foi comprado de PeproTech. PrimeScript® RT Kit de reagentes e SYBR® Premix Ex Taq ™ foram produtos de TaKaRa. E.Z.N.A® HP Total RNA Kit foi comprado de Omega Bio-Tek (Doraville, EUA). piscina inteligente siRNA contra Snail humana e GSK-3β eram de RIBOBIO.

Cultura de Células

O HCT116 e Caco-2 linhas de células de carcinoma colorretal foram obtidos a partir Type Culture Collection da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). As células HCT116 foram mantidas em meio de cultura McCoy’5a (Gibco BRL) suplementado com soro fetal bovino a 10%, e células Caco-2 foram cultivadas em meio de cultura DMEM (Gibco BRL) suplementado com soro fetal bovino a 10% sob uma humidificada com 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C na incubadora.

Transwell migração e invasão Ensaio

Migração e ensaios de invasão foram realizados em câmaras de Boyden. Os filtros de policarbonato (tamanho de poro 8 pm, Corning) pré-revestidas com Matrigel Matrix (BD Biosciences) foram usadas para o ensaio de invasão, e filtros não revestidas foram usadas para o ensaio de migração. As células (1 x 10

5) em 300 ul de meio (contendo 0,1% de FBS), com ou sem 20 ng /ml de TNFa foram semeadas na câmara superior. Em seguida, 600 ml de meio com FBS a 10% foi adicionado para a câmara inferior e serviu como um agente quimiotáctico. Após 24 horas de incubação, para a migração, as células migraram e aderido para a câmara inferior foram fixados em paraformaldeído a 4% durante 20 minutos, corados com hematoxilina e contados sob microscópio vertical (5 campos por câmara). Para a invasão, as células na câmara superior foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 20 min. Em seguida, o matrigel foi mecanicamente removida do filtro com um cotonete. As células que aderiram ao lado inferior do filtro foram coradas com hematoxilina e contados sob microscópio vertical (5 campos por câmara). Cada ensaio de migração e invasão foi repetida em três experiências independentes.

Gene (2 × 10

5 células e sobre-expressão de ARN de interferência

As células foram semeadas numa placa de 6 poços /poço) e deixou em cultura até ao dia seguinte. Eles foram então transfectadas com 2 ug de plasmídeo ou vector de 100 pmol siRNA oligómero misturado com reagente Lipofectamine 2000 no soro médio reduzido de acordo com as instruções do fabricante. O meio foi mudado para meio completo de cultura de 6 horas mais tarde, e as células foram incubadas a 37 ° C num

2 incubadora de CO durante mais 24 a 48 h antes da colheita.

quantitativa PCR em Tempo Real

ARNm total das células foi extraído após o tratamento durante o tempo indicado. A primeira cadeia de síntese de ADNc foi gerado a partir de 500 ng de ARN total. Quantificação de alvo e genes de referência (GAPDH) foi realizada em triplicado em LightCycler® 480 II (Roche, Applied Science). Os iniciadores utilizados em cada reacção foram como se segue: E-caderina directo 5′-TACACTGCCCAGGAGCCAGA-3 ‘e inverso 5′-TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3′; N-caderina, directo 5’-CGAATGGATGAAAGACCCATCC-3 ‘e inverso 5′-GGAGCCACTGCCTTCATAGTCAA-3’; Caracol, frente 5’GACCACTATGCCGCGCTCTT-3 ‘e reverso 5′-TCGCTGTAGTTAGGCTTCCGATT-3′; ZEB1, directo 5’-TACAGAACCCAACTTGAACGTCACA-3 ‘e reverso 5′- GATTACACCCAGACTGCGTCACA-3′; Torção, directo 5’-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3 ‘e inverso 5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′; Slug, directo 5’-TTCGGACCCACACATTACCT-3 ‘e inverso 5′-GCAGTGAGGGCAAGAAAAAG-3’; GAPDH, frente 5’GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘e reverso 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’. Após normalizadas para GAPDH gene, os níveis de expressão de cada gene alvo foram calculados usando o método comparativo ciclo limiar (CT). Os valores Δct foram calculados de acordo com a fórmula Δct = CT (gene de interesse) -ct (GAPDH) em análise de correlação, e calculou-se a 2-ΔΔct de acordo com a fórmula ΔΔct = Δct (grupo de controlo) -Δct (grupo experimental) para a determinação da relação. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (DP) de três experiências independentes.

Western blotting

As células foram lavadas três vezes com solução de tampão fosfato arrefecida em gelo (PBS) e em seguida lisadas em tampão de lise contendo Tris-HCl 50 (pH 7,6), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP-40 a 1%, 0,5% na-desoxicolato, 5 ug /mL de aprotinina, 5 ug /ml de leupeptina, e 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo. Lisados ​​foram clarificados por centrifugação e desnaturadas por fervura em tampão de Laemmli. Quantidades iguais de amostras de proteína foram carregadas por cavidade e separado em géis de SDS-poliacrilamida, e, em seguida, transferidas electroforeticamente para membranas de PVDF. Após o bloqueio com leite magro a 5% à temperatura ambiente durante 2 h, as membranas foram incubadas com anticorpos primários (diluição 1:1,000) a 4 ° C durante a noite e, em seguida, incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP (1:5,000 diluição) para dois h à temperatura ambiente. imunocomplexos específicos foram detectados utilizando Western Blotting Além disso Reagente de Quimioluminescência (Life Science).

Imunofluorescência

As células foram cultivadas em lâminas de câmaras, privadas de soro durante 12 h, em seguida, expostos a TNFa para a indicada Tempo. As células foram lavadas três vezes com PBS, fixadas com 4% de paraformaldeído durante 20 min e permeabilizadas com 0,3% de Triton X-100 durante 10 min. Após bloqueio com soro de cabra durante 2 h à temperatura ambiente, as células foram incubadas com anticorpos contra a E-caderina, N-caderina, fibronectina, ZO-1 ou Snail (1:100 diluição) a 4 ° C durante a noite. As lâminas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas com Alexa Fluor 488 ou Alexa Fluor 594 anticorpos secundários conjugados (1:1,000 diluição) durante 1 h à temperatura ambiente. Os núcleos foram coradas com DAPI (10 ug /ml) durante 10 min. As amostras foram examinadas com Confocal Laser Scanning Microscopy (Zeiss) para analisar a expressão da caderina-E, N-caderina, fibronectina, ZO-1 e translocação nuclear de caracol.

Immunoprecipitation

As células foram lavou-se três vezes com PBS arrefecido em gelo e colhidas a 4 ° C em tampão de lise imunoprecipitação contendo HEPES 50 mM, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,5% de NP-40, EDTA 2 mM, glicerol a 10%, de na 1 mM de

3VO

4, NaF 1 mM, ditiotreitol 1 mM, 1 mM de 4- (2-aminoetil) benzenossulfonilo fluoreto, 1 ug /mL de leupeptina, 1 ug /mL de pepstatina e 1 ug /mL de aprotinina. Quantidades iguais de proteína foram imunoprecipitadas utilizando anticorpos anti-Snail ou anticorpo anti-GSK-3β, e os complexos imunes foram ligados a proteína A-Sepharose /L. As esferas foram lavadas com tampão de lise e sujeita a transferência de Western com anticorpo anti-ubiquitina, anticorpo anti-GSK-3β anti-Snail ou.

Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± DP de três experiências independentes a menos que especificado de outra forma. Os dados foram analisados ​​pelo teste t bicaudal de Student não pareado entre quaisquer dois grupos. One-way ANOVA análise de variância foi utilizado para avaliar a diferença de médias entre os grupos. Estas análises foram realizadas utilizando GraphPad Prism Software Versão 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

TNFa Promove migração e invasão de células HCT116

As células tumorais com um fenótipo agressivo adquirir migratória e invasiva. capacidades. Isto irá promover a disseminação de células tumorais para órgãos distantes [8]. As capacidades de migração e invasão de células HCT116 afetadas por TNFa foram medidos usando transpo� ensaios de migração e invasão. Como mostrado na Figura 1A e C, o tratamento de TNFa resulta em um aumento significativo na migração celular e invasão. Em comparação com o controlo, o número de células que migraram e invasivos aumentou cerca de quatro vezes (migração) e 20 vezes (invasão) após o tratamento com TNFa (Fig. 1B e D).

(A) As células HCT116 foram deixadas migrar câmaras Transwell durante 24 h na presença ou ausência de TNFa (20 ng /ml). Após 24 h, as células migradas foram fixadas, coradas, e fotografados. Ampliação, 100 ×. (B) O número de células que migraram. Os dados representam a média de três experiências independentes. (C) após o tratamento com ou sem TNFa (20 ng /ml) durante 48 horas, as células HCT116 que se espalhou através da matrixgel e no lado inferior do filtro foram fixadas, coradas, e fotografados. Ampliação, 200 ×. (D) O número de células invasivas. Os dados representam a média de três experiências independentes. * P . 0,05 comparado com o controle

TNFa induz EMT em células HCT116

O aumento das capacidades de migração e invasão de células tumorais são uma reminiscência dos eventos no EMT, durante o qual, o makers epiteliais e-cadhein e ZO-1 são regulados negativamente, enquanto que os marcadores mesenquimais N-caderina e fibronectina está regulado para cima [27]. A EMT de células HCT116 foi observado após estimulação com 20 ng /mL de TNFa durante 4 dias. As células resultou numa alteração significativa na morfologia, da morfologia de paralelepípedos para mesenquimais fusiformes e fusiformes características (Fig. 2a). Análise por imunofluorescência mostrou que esta alteração morfológica foi associada com a regulação para baixo de características epiteliais de E-caderina, ZO-1 de expressão e a regulação positiva de características mesenquimais fibronectina e a expressão de N-caderina (Fig. 2A). Da mesma forma, a análise de transferência de Western confirmou ainda a expressão crescente de fibronectina e N-caderina, e a expressão decrescente de E-caderina e ZO-1 nos níveis de proteína (Fig. 2B). Além disso, a análise de qRT-PCR mostrou que o tratamento com TNFa regulada negativamente E-caderina e supra-regulados N-caderina em níveis de ARNm (Fig. 2C). Colectivamente, estas observações sugerem que as células HCT116 foram submetidos a um EMT depois tratada por TNFa.

células HCT116 (A) foram tratados com ou sem TNFa (20 ng /ml) durante 4 dias. alterações morfológicas celulares associadas com EMT são mostrados na imagem de contraste de fase. A expressão de E-caderina, ZO-1, fibronectina, N-caderina foram analisados ​​por coloração de imunofluorescência. Os núcleos foram visualizados com coloração DAPI. Barras de escala: 20 pm. (B) As células HCT116 foram tratadas com ou sem TNFa (20 ng /ml) durante 4 dias, e a expressão de E-caderina, ZO-1, fibronectina, N-caderina, Snail, ZEB1, torção, Slug foram analisadas por western mata-borrão. p-actina servidores como o controlo da carga. (C) As células HCT116 foram tratadas com ou sem TNFa (20 ng /ml) durante 4 dias. Os níveis de ARNm de caderina-E, N-caderina, Snail, ZEB1, torção, Slug foram analisados ​​por qRT-PCR. * P . 0,05 comparado com o controle

Snail é crucial para mediada por TNFa EMT

Uma vez que fatores de transcrição Snail, ZEB1, Twist and Slug desempenham um papel essencial na regulação EMT [14] , que, em seguida, investigaram se as suas expressões foram regulados positivamente em células HCT116 depois tratados com TNF. Em comparação com células não tratadas, TNFa aumentou significativamente o nível de proteína Snail, mas não o nível de ARNm (Fig. 2B e C). No entanto, o tratamento TNFa alterada nem mRNA nem os níveis de proteína de ZEB1, Twist, Slug (Fig. 2B e C).

Nós overexpressed Snail para investigar ainda mais os seus papéis na EMT induzida por TNFa de células HCT116. As células foram transfectadas com pcDNA-caracol e controlo do vector pcDNA-3.1, respectivamente. A expressão de Snail e EMT marcadores foram detectados por imunofluorescência e Western blotting. Os resultados revelaram que a expressão aumentada do caracol alterações morfológicas induzidas como EMT-e causou uma mudança de E-caderina para a expressão de N-caderina nas células HCT116 (Fig. 3A e B). Estes resultados demonstraram que a expressão ectópica de Snail pode desencadear EMT em células HCT116. Com base nestas observações, avaliamos que Snail-regulação pode ser crucial para EMT induzida por TNFa em células HCT116.

(A) pcDNA-Snail (caracol) ou vetor de controle pcDNA-3.1 (Vector) foram expressos em células HCT116 por 48 h. alterações morfológicas celulares associadas com EMT são mostrados na imagem de contraste de fase. A expressão de E-caderina e N-caderina foram analisados ​​por coloração de imunofluorescência. Os núcleos foram visualizados com coloração DAPI. Barras de escala: 20 pm. (B) A expressão de E-caderina, N-caderina e caracol a partir de células HCT116 transfectadas com o vector de controlo de pcDNA-caracol ou foram examinados por transferência Western. p-actina servidores como o controlo da carga. Foram observadas (C) Células HCT116 transfectadas com Snail controlo SI-ARN (Si-caracol) ou negativo específico SI-ARN (Si-NC) foram estimuladas com ou sem TNFa (20 ng /ml) durante 48 h, e as alterações morfológicas com uma microscopia de contraste de fase. células (D) HCT116 transfectadas com Snail Si-Si-CN ou foram estimuladas com ou sem TNFa (20 ng /ml) durante 4 dias, e a expressão de E-caderina e caracol foram detectados por Western blotting. servidores de β-actina como o controle de carregamento.

Nós ainda realizados ensaios de knockdown para verificar se Caracol é um regulador chave na EMT induzida por TNFa. As células HCT116 foram transfectadas com não segmentação de controlo SI-ARN ou Si-caracol durante 24 h, e, em seguida, tratada com TNFa de tempo diferente. As alterações morfológicas foram observadas sob um microscópio de contraste de fase. As expressões de Snail e E-caderina foram detectados por Western blotting. Comparado com o grupo controle, as alterações morfológicas fusiformes não foram observados após a TNFa disso em si-Snail células transfectadas (Fig. 3C). Silenciamento de caracol também atenuou a infra-regulação da caderina-E, o que não foi observado no controle de células si-RNA-transfectadas (Fig. 3D) induzida por TNFa. Em conjunto, estas observações demonstraram que Snail é essencial para EMT induzida por TNFa em células HCT116.

TNFa Regula Estabilização e subcelular Localização de Caracol

Nós já descobriram que TNFa aumento do nível de proteína Snail, mas não mRNA de nível (Fig. 2B e C). Este resultado sugeriu que a regulação positiva de caracol por TNFa estava ocorrendo no nível pós-transcricional. Para verificar ainda mais este ponto de vista, HCT116 e células Caco-2 foram tratadas com TNF durante 0-8 h, e proteína Snail e ARNm foram detectados por Western blotting e qRT-PCR, respectivamente. Os resultados mostraram que o nível de proteína de Snail foi melhorada depois de 1 h de estimulação de TNFa e aumento dependente do tempo (Fig. 4A). No entanto, o nível de ARNm de Snail não teve uma alteração significativa após o tratamento com TNFa (Fig. 4B). Estes resultados sugerem que a supra-regulação de Snail por TNFa pode ser devido a estabilização da proteína.

células (A-B) e HCT116 Caco-2 foram tratadas com TNFa (20 ng /mL) durante os tempos indicados, e a proteína (a) e ARNm (B) os níveis de Snail foi analisada por transferência western e qRT-PCR, respectivamente; (C) As células HCT116 foram tratadas com ou sem TNFa (20 ng /ml) durante 6 h. Após a fixação, a localização celular do Caracol (verde) foi examinado por imunofluorescência e os núcleos foram coradas com DAPI (azul). Barras de escala: 20 mm

Uma vez que fatores de transcrição só pode ter efeito quando transferem para o núcleo [28], que também determinou a actividade de translocação nuclear de Snail por imunofluorescência.. A localização nuclear de Snail foi avaliada em células HCT116 estimuladas com ou sem TNFa durante 8 h. Como mostrado na Fig. 4C, em comparação com o grupo controle, TNFa aumentou significativamente a translocação nuclear de caracol.

TNFa medeia Snail Estabilização através da ativação da AKT e inibição da GSK-3β

Para investigar os mecanismos moleculares subjacentes TNFa mediada caracol estabilização, foram utilizados inibidores de NF-kB (BAY11-7082), PI3K /AKT (LY294002), MAPK (PD98059), p38 (SB-203580), uma vez que TNFa pode induzir a activação destas vias. células HCT116 e células Caco-2 foram pré-tratados com inibidores durante 1 h antes da estimulação de TNFa, e, em seguida, a expressão de Snail foi determinado por western blotting. Verificou-se que inibidores de PI3K /AKT (LY294002), mas não os outros, completamente bloqueada Snail (Fig. 5A), o que sugere que a activação da via PI3K /AKT é responsável pela estabilização do caracol mediada por TNFa estabilizado-TNFa.

via. As células HCT-116 (A) foram pré-tratados com o SB-203580 (20 uM), PD98059 (20 uM), BAY11-7082 (10 uM), LY294002 (20 uM) durante 1 h, respectivamente, seguido por estimulação com TNFa (20 ng /ml) durante 6 h. A expressão de Snail foi analisada por Western blotting. células Caco-2 foram pré-tratados com o SB-203580 (20 uM), BAY11-7082 (10 uM), LY294002 (20 uM) durante 1 h, respectivamente, seguido por estimulação com TNFa (20 ng /ml) durante 6 h. A expressão de Snail foi analisada por Western blotting. (B) As células HCT116 foram pré-tratadas com ou sem LY294002 (20 uM) durante 1 h, seguido de estimulação com ou sem TNFa (20 ng /ml) durante 6 h. A expressão de Snail e a activação de AKT e GSK-3β foram examinados por transferência Western. (C) HCT116 e células Caco-2 foram tratadas com TNFa (20 ng /mL) durante os tempos indicados. A expressão de pGSK-3β e GSK-3β foram examinados por transferência Western. (D) de controlo e de GSK-3β SI-ARN foram expressos em células HCT116 por 42 h, seguida tratou-se com ou sem TNFa (20 ng /ml) durante mais 6 h. A expressão de Snail e a GSK-3β foram examinados por transferência Western. As células HCT-116 (e) foram tratadas com TNFa (20 ng /ml) ou LiCl (40 mM) durante 6 h. A expressão de Snail, pGSK-3β, a GSK-3β, e β-catenina foram analisadas por western blotting. (F) Depois de células HCT116 tratados com ou sem TNFa (20 ng /ml) durante 6 h, e caracol β-catenina localizados na membrana nuclear e foram isoladas, respectivamente, e, em seguida, analisadas por western blotting.

Snail é um regulados principalmente por GSK-3β, uma quinase localizado a jusante da via PI3K /AKT [24], [29], [30]. GSK-3β mantém um estado ativo em forma desfosforilado. Para determinar se a estabilização de Snail por TNFa é mediado pela regulação da actividade de GSK-3β, que trataram células HCT116 com LY294002 antes de TNFa tratamento, e, em seguida, a expressão de p-AKT, p-GSK-3β, e caracol foram determinados pela western blotting. Descobrimos que os níveis de p-AKT, p-GSK-3β, e caracol foram aumentadas após o tratamento de TNFa em 6 h, enquanto que estes efeitos foram revertidas após o tratamento com LY294002, sozinho ou em combinação com TNF (Fig. 5B). A seguir, mediu os cursos de tempo para a fosforilação por GSK-3β e descobriu que a expressão da p-GSK-3β aumentou de uma forma dependente do tempo após estimulação de TNFa em HCT116 e células Caco-2 (Fig. 5C). Estes resultados indicaram que a estabilização de Snail por TNFa é devido à inibição da actividade de GSK-3β. Para confirmar ainda mais nossos resultados, derrubado a expressão de GSK-3β em células HCT116 utilizando específica GSK-3β si-RNA (Fig. 5D). Em comparação com o controlo, regulação negativa da GSK-3β marcadamente elevados os níveis de expressão de Snail (Fig. 5D). No entanto, o TNFa mediada estabilização Snail não foi mais elevada após o knockdown de GSK-3β (Fig. 5D). Do mesmo modo, quando se trataram células HCT116 com LiCl, um potente inibidor de GSK-3β, em conformidade com o tratamento com TNFa, a expressão de Snail, p-GSK-3β, e β-catenina (uma proteína regulada pela GSK-3β) foram aumentados ( Fig. 5E). No entanto, a sobre-regulação de β-catenina não era tão evidente como caracol. Isso pode ser devido a localizações intracelulares entre β-catenina e caracol são diferentes. Para verificar esta hipótese, foram isoladas e caracol β-catenina e da membrana nuclear de células HCT116 tratados com ou sem o TNFa. Os resultados revelaram que diferente de caracol, β-catenina existe na membrana plasmática, e TNFa aumenta a translocação nuclear de Snail e β-catenina, mas não afecta a membrana β-catenina (Fig. 5F). Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram que o TNFa sobre-regulada Snail em células HCT116 através da activação de sinalização de AKT que conduzem à fosforilação de GSK-3β e posteriormente estabilizar caracol.

TNFa Suprime ubiquitinação de Snail por inibição da Associação de Snail e GSK-3β

Uma vez que a estabilidade da proteína de caracol é regulada através de processos de degradação proteossómica mediada por ubiquitina, nós especulamos se a estabilização do caracol por TNFa é mediada por supressão de Caracol ubiquitinação. Para testar esta hipótese, as células HCT116 foram tratadas com TNFa ou o MG132 inibidor de proteassoma durante 6 h, e, em seguida, Snail foi imunoprecipitada a partir de lisados ​​de igual quantidade. O estado ubiquitinação de Snail foi detectada por transferência Western com um anticorpo anti-ubiquitina. Os resultados revelaram que, em comparação com MG132, TNF suprimiu drasticamente a ubiquitinação de Caracol, apesar de proteínas totais estabilizadas caracol eram paralelas (Fig. 6A). Desde GSK-3β é o principal quinase que fosforila Caracol e, em seguida, induz a degradação da proteína de caracol [24], o próximo examinaram a associação de Caracol e GSK-3β. As células HCT116 foram tratadas com TNFa ou MG132 durante 6 h, e, em seguida, Snail foi imunoprecipitada a partir de lisados ​​de uma quantidade igual, e a GSK-3β associada foi medido por transferência de Western. Como mostrado na Fig. 6B, a associação de caracol com a GSK-3β foi diminuída em células tratadas com TNFa, em comparação com as células tratadas com MG-132. Da mesma forma, quando a GSK-3β foi imunoprecipitada a partir de células HCT116, a Associated Snail foi marcadamente reduzida em células tratadas com TNFa, em comparação com as células tratadas com o MG-132 (Fig. 6B). Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram que o TNFa inibiu a associação do caracol com a GSK-3β e posteriormente suprimida ubiquitinação de caracol.

(A) As células HCT116 foram tratadas com TNFa (20 ng /ml) ou MG132 (10 uM ) durante 6 h. Depois de Snail foi imunoprecipitada a partir de quantidades iguais de lisados ​​(dois pains inferiores), a ubiquitinação de Snail foi analisada por Western blotting. (B) As células HCT116 foram tratadas com TNFa (20 ng /ml) ou MG132 (10