(PCA) metástases ósseas têm sido acreditado

Abstract

O câncer de próstata ser osteoblástica por causa do osso remodelação que conduz à formação de osso novo. No entanto, estudos recentes têm mostrado aumento da atividade osteolítica nos estágios iniciais de metástases ósseas APC, sugerindo que a segmentação tanto osteolíticas e osteoblásticas mediadores provavelmente inibir a remodelação óssea e PCA metástase óssea. Neste estudo, descobrimos que as células CaP poderia estimular a diferenciação dos osteoclastos e osteoblastos através do aumento da regulação do RANKL, Runx2 e osteopontina, promovendo a remodelação óssea. Curiosamente, verificou-se que formulada de isoflavona e 3,3′-diindolylmethane (BR-DIM) foram capazes de inibir a diferenciação de osteoclastos e osteoblastos por meio da inibição da transdução de sinal celular em RANKL, osteoblástica, e a sinalização celular CaP. Além disso, descobrimos que a isoflavona e BR-DIM regulada negativamente a expressão de miR-92a, que é conhecido por estar associado com a sinalização de RANKL, EMT e progressão do cancro. Por via e análise de rede, também observamos os efeitos regulatórios da isoflavona e BR-DIM em várias vias de sinalização como a AR /PSA, NKX3-1 /Akt /p27, MITF, etc. Portanto, isoflavona e BR-DIM com seus múltiplos efeitos -targeted poderia ser útil para a prevenção da progressão da APC, especialmente por meio da atenuação mecanismos de metástase óssea

Citation:. Li Y, Kong D, Ahmad a, Bao B, Sarkar FH (2012) Segmentação remodelação óssea pela isoflavona e 3,3-Diindolylmethane no Contexto do cancro da próstata metástase óssea. PLoS ONE 7 (3): e33011. doi: 10.1371 /journal.pone.0033011

editor: Muzaffer Cicek, Mayo Clinic College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 21 Dezembro, 2011; Aceito: 02 de fevereiro de 2012; Publicação: 07 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do National Cancer Institute, National Institutes of Health (5R01CA083695, 5R01CA108535, 5R01CA132794 e 5R01CA131151 atribuído a FHS). Os autores agradecem Puschelberg e Guido bases para a sua contribuição financeira generosa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Autor Fazlul Sarkar e co-autor Aamir Ahmad são PLoS ONE membros do Conselho Editorial. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de próstata (PCA) é um câncer comum e a segunda principal causa de câncer relacionado mortes em homens nos Estados Unidos com uma estimativa de 241,740 novos casos e 28,170 mortes são esperadas em 2012 [1]. A elevada taxa de mortalidade de PCA é devido, principalmente, para o desenvolvimento de metástases. CaP comumente exibe suas características progressivas através das cascatas de dependência de andrógenos para castrar resistência com a eventual metástase. Mesmo que a APC, pode ser considerado localizado na próstata, não é ainda de 15% a 20% de incidência de metástases subsequente [2]. Tem sido relatado que 35% dos pacientes com CaP desenvolver metástases hematogênica e que a metástase óssea de PCA é o mais frequente (~ 90%) entre as metástases hematogênica [3]. metástases ósseas CaP têm sido desde há muito que se acredita ser osteoblástica, devido à formação de osso novo. Por conseguinte, moléculas de direccionamento osteoblásticas tais como endotelina-1, a sinalização de BMP, e Wnt tem sido considerada como estratégias para inibir a metástase óssea CaP [2]. No entanto, estudos recentes encontraram maior atividade osteolítica nos estágios iniciais de metástases ósseas CaP [4], [5]. Vários factores de crescimento foram encontrados para ser libertado a partir da matriz óssea durante a degradação quando as células CaP metastizado para o osso. Além disso, as células cancerosas poderia espalhar para o osso e utilizar a maquinaria local de citocinas para estimular a osteoclastogénese, resultando em crescimento a reabsorção óssea e de células de cancro [6]. Estes achados sugerem que a remodelação óssea incluindo processos osteolíticas e osteoblásticas ocorre durante CaP metástase óssea e, por sua vez, favorece o crescimento de células CaP no osso recém-formado. Portanto, a segmentação molecular de ambos osteolíticas e osteoblásticas mediadores provavelmente inibir a remodelação óssea, o que poderia tornar-se uma estratégia terapêutica mais recente para a inibição de metástase CaP óssea.

Para inibir processo osteolítico, várias estratégias têm sido desenvolvidas, incluindo a utilização de bisfosfonatos e segmentação dos reguladores biológicos de osteoclastogênese, como osteoprotegerina (OPG), ativador do receptor do fator nuclear-kB (RANK) e ativador do receptor do ligando fator nuclear-kB (RANKL). O mais importante máquinas de citocinas, a qual está envolvida na remodelação óssea e CaP metástase óssea, é OPG /RANK /RANKL sinalização [7], [8]. RANKL é expressa por osteoblastos, e que é necessário e suficiente para a osteoclastogénese [9]. RANKL se liga ao seu receptor RANK que está presente na superfície de precursores de osteoclastos, induzindo a formação de osteoclastos e activação [9], [10]. Estudos têm demonstrado que as células RAW264.7, um dos macrófagos precursoras de osteoclastos, poderia diferenciar-se para osteoclastos, quando cultivadas na presença de RANKL [10]. As principais características de osteoclastos incluem a capacidade de absorver o osso, para expressar fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP), e para expressar proteases, incluindo as metaloproteinases de matriz (MMPs), que facilitam a invasão e metástase [10] do cancro, [11]. Importante, a expressão de RANKL também foi encontrado em algumas células cancerosas, bem como em células T activadas [6], [11], [12]. Por isso, a sinalização RANKL foi acredita-se ser um alvo terapêutico para a inibição da remodelação óssea e metástases ósseas [13].

Além disso, várias moléculas, incluindo a endotelina-1, BMP, e Wnt foram acreditado como o importante reguladores para a diferenciação de osteoblastos e formação de osso [2], [14] – [16]. Os estudos histológicos demonstraram que as lesões osteoblásticas de CaP metástases ósseas são caracterizadas pela deposição de novos ossos, que são produzidos por osteoblastos, desorganizados e entrelaçados entre focos de células cancerosas. Em osteoblastos, a endotelina-1, BMP, e as moléculas de sinalização de Wnt são altamente expressas. Além disso, níveis de soro elevados de fosfatase alcalina específica do osso, um marcador de diferenciação dos osteoblastos e a proliferação, são muitas vezes observada em paciente com cancro com metástases ósseas [17], o que sugere a importância destas moléculas em CaP metástase óssea. Portanto, tendo como alvo estas moléculas osteoblásticas poderia inibir a remodelação óssea e metástase óssea CaP.

Recentemente, agentes naturais têm recebido muita atenção na área da investigação oncológica. genisteína isoflavona encontrada principalmente em soja tem demonstrado sua capacidade de inibir o crescimento de células de câncer

in vitro

e

in vivo

sem toxicidade. Temos encontrado anteriormente que a isoflavona genisteína pode inibir NF-kB e activação da Akt em células de câncer [18]. Além disso, têm relatado que a genisteína pode inibir dietético CaP na metástase óssea experimental num modelo SCID-humano [19], e que a genisteína pode potenciar os efeitos de indução da apoptose por meio de agentes quimioterapêuticos a sub-regulação de NF-kB [20]. 3,3′-diindolylmethane (DIM) é outro agente natural e encontrada principalmente nos membros da família Cruciferae, tais como brócolos. Nós e outros descobriram que DIM e do seu produto formulado (BR-dim fabricado por bioresposta, LLC. Com biodisponibilidade aumentada) pode regular negativamente a expressão de AR, Akt e NF-kB, que conduz à inibição do crescimento de APC e a indução de apoptose

in vitro

e

in vivo

[21], [22]. DIM também foi encontrada para potenciar a eficácia terapêutica de quimioterapias [23]. Neste estudo, nós investigamos se mistura isoflavona G2535 contendo 70,5% de genisteína, e BR-DIM poderia inibir a diferenciação de osteoclastos e osteoblastos mediadas através da regulação de vias de sinalização celular que estão envolvidos na remodelação óssea e PCA metástase óssea.

Resultados

a diferenciação dos osteoclastos e osteoblastos no sistema de co-cultura com células CaP

Para investigar o papel da sinalização celular relacionados com o osso na remodelação óssea durante CaP metástase óssea, foi desenvolvido pela primeira vez um co -cultura sistema para permitir que as células APC e osteoclastos ou de osteoblastos crescido sob as mesmas condições de meio de cultura. Descobrimos que as células de cancro da próstata PC-3 pode crescer bem com pré-células osteoclastos (RAW264.7) (Figura 1A) e que ambas as células C4-2B e pré-osteoblastos (células hFOB1.19) pode crescer em conjunto (Figura 1B) . Em seguida, tratado co-cultura de células PC-3 RAW264.7 e com RANKL ou TGF-β para induzir a diferenciação de osteoclastos. Incubámos a co-cultura de células e C4-2B hFOB1.19 a 39 ° C para induzir a diferenciação dos osteoblastos. coloração TRAP foi conduzido para detectar diferenciação dos osteoclastos, enquanto a coloração da fosfatase alcalina foi realizada para detectar diferenciação dos osteoblastos. Observou-se a formação de células gigantes multinucleadas e os grânulos castanhos escuros nos osteoclastos diferenciados rodeadas por células PC-3 (Figura 2A), sugerindo que a diferenciação de osteoclastos pode ser induzida por RANKL ou TGF-β em ambiente de crescimento CaP. Observou-se também grânulos azuis escuros em células hTOB1.19 cercados por células C4-2B (Figura 2B), sugerindo que osteoblastos pode ser diferenciado quando cultivada em conjunto com células APC.

A. As células PC-3 (indicada pelo triângulo preto) foram co-cultivadas com células RAW264.7 (indicado pela seta preta) em baixa densidade celular (a, b) e densidade celular elevada (C, D). células B. C4-2B (indicados por triângulo branco) foram co-cultivadas com células hFOB1.19 (indicado pela seta branca) em baixa densidade celular (E, F) e elevada densidade celular (g, h). × 100.

A. RAW264.7 células foram co-cultivadas com células PC-3 (indicado pela seta preta) e tratou-se com 100 ng /ml de RANKL (a, b) ou 10 ng /ml de TGF-β (c, d) durante 8 dias. coloração TRAP mostrou grânulos castanho escuro (indicado pela seta branca) em osteoclastos diferenciados rodeadas por células PC-3. células B. hFOB1.19 foram cultivados sozinhos (E, F) ou de co-cultura (g, h) com células C4-2B (indicados por triângulo preto) em 39 ° C durante 5 dias. coloração fosfatase alcalina mostrou grânulos azuis escuros (indicados pelo triângulo branco) em osteoblastos diferenciados. × 200.

TGF-β induzida a diferenciação dos osteoclastos através de RANKL

Uma vez que observou-se a diferenciação de osteoclastos por TGF-β, testou-se o efeito de TGF-β sobre a expressão de RANKL . Verificou-se que o nível de expressão de RANKL foi significativamente aumentada por tratamento TGF-β em C4-2B e células PC-3 (Figura 3A), o que sugere que a indução de diferenciação de osteoclastos por TGF-β foi mediada através da sobre-regulação de RANKL e que as células CaP poderia produzir RANKL para induzir a diferenciação de osteoclastos. Observou-se também que o nível de CXCR-4, um dos genes críticos para a metástase, a expressão foi significativamente aumentada por tratamento TGF-β. Estes resultados sugerem que o aumento do nível de TGF-β por células tumorais ou do estroma poderia promover a remodelação óssea e CaP metatstasis através de RANKL e CXCR-4 sinalização

a:. C4-2B e células PC-3 foram tratados com 100 OPG ng /ml ou 10 de TGF-β ng /ml durante 24 horas. A expressão da proteína RANKL e CXCR-4 foi medido por análise de Western Blot. B e C: células RAW246.7 (B) e hFOB1.19 (C) em câmaras inferiores foram co-cultivadas com C4-2B (C4), PC-3 (PC), Arcap

M (M) e Arcap

E (E) células cancerosas da próstata em câmaras superiores para 48 horas. análise de Western Blot foi realizado para medir a expressão de osteoclastos ou de osteoblastos marcadores em células RAW264.7 ou hFOB1.19.

Co-cultura com células de câncer de próstata aumentou a diferenciação de osteoclastos e osteoblastos

Para investigar se as células CaP poderia promover a diferenciação dos osteoclastos e osteoblastos, que cultivaram células RAW264.7 ou hFOB na câmara inferior do sistema de cultura e de várias células CaP cultivadas incluindo C4-2B, PC-3, Arcap

M , e Arcap

e células na câmara superior de modo que as proteínas segregadas a partir de células cancerosas pode entrar na câmara inferior da câmara superior através de uma membrana com um poro. A análise Western Blot foi realizado para medir os marcadores de diferenciação de osteoclastos e osteoblastos. Descobrimos que a co-cultura de células com células RAW264.7 CaP aumentou a expressão de TRAcP, um dos principais marcadores de diferenciação de osteoclastos em células RAW264.7 (Figura 3B). A expressão de fibronectina também foi aumentada quando co-cultivadas com C4-2B e células PC-3 (Figura 3B). Observou-se também um aumento da expressão de RUNX2, um dos marcadores de osteoblastos, em células hFOB1.19 (Figura 3C). A expressão de osteopontina, um dos genes importantes para a remodelação óssea, também foi induzida quando co-cultivadas com células de CaP (Figura 3C). Estes resultados sugerem que as células de CaP pode produzir algumas moléculas que contribuem para a indução de diferenciação de osteoclastos e osteoblastos, remodelação óssea causando.

isoflavona e BR-DIM inibiu a diferenciação de osteoclastos e osteoblastos

para investigar os efeitos da isoflavona e BR-DIM no differntiation de osteoclastos e osteoblastos, que trataram células RAW264.7 ou hFOB1.19 com 10 a 25 G2535? M ou BR-DIM durante os processos de osteoclastos e diferenciação dos osteoblastos. Realizamos TRAP ou fosfatase alcalina coloração para detectar a diferenciação de osteoclastos ou osteoblastos. Observou-se que o TGF-β formação de osteoclastos induzida multinucleadas e que as isoflavonas e BR-dim tratamentos diminuiu significativamente os grânulos castanhos escuros em células RAW264.7 (Figura 4A) e os grânulos azuis escuras em células hFOB1.19 quando cultivadas isoladamente (Figura 4B ) ou co-cultivada com C4-2B (Figura 4C). Estes resultados sugerem claramente que a isoflavona e BR-DIM pode inibir a diferenciação de osteoclastos e osteoblastos, que poderiam atenuar a remodelação óssea durante CaP metástase e seria altamente desejável para a inibição de metástase óssea CaP

A:. RAW246. 7 As células foram tratadas com 10 ng /ml sozinho ou combinado com 10 G2535 uM por 8 dias de TGF-β. coloração TRAP foi realizado. grânulos marrom escuro indicaram a diferenciação de osteoclastos. × 100. B e C: as células foram cultivadas hFOB1.19 sozinho (B) ou co-cultivadas com células C4-2B (C) a 39 ° C. As células foram também tratadas com G2535 20 pM ou 10 pM BR-DIM durante 5 dias. coloração fosfatase alcalina mostrou grânulos azuis escuros em osteoblastos diferenciados. × 200.

isoflavona e BR-DIM RANKL regulamentado e sinalização do câncer de próstata, o que poderia inibir a osteoclastogênese e câncer de próstata crescimento

Uma vez que descobrimos que isoflavona e BR-DIM inibiu a diferenciação de osteoclastos, investigamos ainda mais o mecanismo molecular da isoflavona e BR-DIM ação sobre osteoclastgenesis. Realizamos a análise de microsséries de perfil de células C4-2B tratados com G2535 ou BR-DIM expressão do gene. Ao utilizar Engenho Pathway Analysis, verificou-se que a isoflavona e BR-DIM inibiu a transdução de sinal celular na via de sinalização de RANKL (Figura 5A e Tabela 1) e CaP de sinalização (Figura 5B e Tabela 1). BR-DIM e isoflavona inibiu significativamente a expressão de MITF, um dos factores importantes transcrption envolvidos na regulação da expressão do gene osteoclástica (Figura 5A e Tabela 1). BR-DIM e isoflavona também inibiu as transduções de sinal em CaP sinalizando com a regulação positiva de p27 e para baixo-regulação da PSA e ciclina D (Figura 5B e Tabela 1). Além disso, a isoflavona e BR-DIM regulada as moléculas nas redes de transdução do sinal com a infra-regulação da Akt, NKX3-1, STK-4, e CDK13 MITF (figura 5C, 5D e Tabela 1), que conduz à inibição da osteoclastogénese e crescimento CaP. Além disso, foi realizada em tempo real, análise de Western blot RT-PCR e confirmar os resultados de microarray e Ingenity Análise Caminho. Observou-se que a BR-DIM e isoflavona regulada a expressão de MITF, Akt, NKX3-1, ciclina D e PSA, e up-regulada a expressão da p27, p38 e CREB no mRNA (Figura 6 A e 6B) e proteína (Figura 6C e 6D) níveis. Estes resultados são consistente com os dados de microarrays, sugerindo que a BR-DIM e isoflavona pode inibir a osteoclastogênese e crescimento CaP.

BR-dim regulados as moléculas de RANKL de sinalização (A), de sinalização cancro da próstata (B), e o sinal redes de transdução (C, D) analisadas por microarray e análise Ingenuity Pathway em células C4-2B. O vermelho indica-regulada moléculas enquanto especifica verdes moléculas regulada para baixo. Os números foram criados automaticamente pelo software Ingenuity Pathway Analysis.

BR-DIM e isoflavona regulada a expressão de MITF, p38, Akt, NKX3-1, p27, ciclina D, CREB e PSA em mRNA e Os níveis de proteína testados por PCR em tempo real (A, B) e análise de Western Blot (C, D). células C4-2B (A, C) e PC-3 (B, D) foram tratados com 25 G2535 mM ou 25 mM BR-DIM durante 24 horas (para extração de RNA) ou 48 horas (para extração de proteínas). . (BD: BR-DIM)

RANKL-regulada a expressão de miR-92a enquanto isoflavona e BR-DIM abragated o aumento da regulação do miR-92a estimulada por RANKL

por previsão computadorizada de miRNAs alvo, descobrimos que RANKL poderia regular vários miRNAs como miR-92a e miR-155, levando ao aumento da osteoclastogênese. Para confirmar se o miR-92a é um alvo legítimo de RANKL ou não, que trataram células C4-2B com 100 ng /ml de RANKL durante 24 horas. Observou-se que o tratamento de RANKL expressão induzida miR-92a em células PCA (Figura 7A). Mais importante, verificou-se que o tratamento de células com isoflaone ou BR-DIM diminuiu a expressão de miR-92a e atenuou a indução da expressão de miR-92a estimulada por RANKL em CaP células (Figura 7A), sugerindo uma ligação mecânica entre a RANKL, miR- 92a e a actividade biológica de isoflavonas ou Br-DIM

a:. C4-2B células foram tratadas com 100 ng /ml de RANKL, 25 G2535 uM, 25 uM BR-DIM, ou combinação de RANKL e G2535 ou BR-DIM durante 24 horas. O ARN total foi extraído e a expressão de miR-92a foi detectada nas células tratadas C4-2B. B: células C4-2B foram cultivadas em câmara inferior do sistema de co-cultura. células RAW246.7 e hFOB1.19 foram cultivadas em câmara superior. As células foram tratadas com G2535 25 uM ou 25 uM BR-DIM durante 48 horas. A expressão de E-caderina e vimentina foi medida por análise de Western Blot. C: As células foram tratadas com hFOB1.19 G2535 25 pM ou 25 pM BR-DIM durante 48 horas. A expressão de periostina foi detectada por análise de Western Blot.

isoflavona e BR-DIM regulada epitelial-a-mesenquimal Transição (EMT) marcadores, E-caderina e vimentina

Uma vez que observou que isoflavona e BR-DIM poderia inibir a expressão de miR-92a, que poderia promover metástase e regular EMT, visando a regulação negativa da expressão da caderina-e [24], investigamos ainda mais os efeitos da isoflavona e BR-DIM em a expressão de e-caderina e vimentina, os dois marcadores EMT mais importantes e bem aceites que estão diretamente associados a EMT fenótipo. Nós cultivaram células C4-2B na câmara inferior de um sistema de co-cultura em que cultivaram células RAW264.7 e hFOB1.19 na câmara superior para simular o microambiente do tumor de células APC e interação dos osteoclastos /osteoblastos. Subsequentemente, foram tratados com as células G2535 25 pM ou 25 pM BR-DIM durante 48 horas. Descobrimos que a isoflavona ou BR-DIM tratamento aumentou a expressão de E-caderina e diminuiu a expressão de vimentina (Figura 7B), sugerindo que a isoflavona e BR-DIM poderia prevenir a indução de EMT através da regulação da expressão de miR-92a, E -cadherin e vimentina.

isoflavona e BR-DIM inibiu a expressão do gene

osteoblástica

Uma vez que observamos que isoflavona e BR-DIM poderia inibir a diferenciação de osteoblastos, investigamos ainda mais o alvo molecular da isoflavona e ação BR-DIM na diferenciação dos osteoblastos. Nós tratada células hFOB1.19 com G2535 25 mM ou 25 mM BR-DIM durante 48 horas. Descobrimos que a isoflavona ou tratamento BR-DIM inibiu a expressão de periostina (Figura 7C), um dos genes importantes para a diferenciação dos osteoblastos. Estes resultados sugerem que a inibição da periostina poderia ser um dos mecanismos moleculares pelos quais as isoflavonas e BR-DIM inibiram a diferenciação dos osteoblastos.

Discussão

É bem conhecido que as células frequentemente metastizar para CaP O osso. No osso, células CaP metástase poderia utilizar os nutrientes de sangue na medula óssea, interagir com pré-osteoclastos e pré-osteoblastos e estimular a remodelação óssea, [25], [26]. A interação entre as células APC e pré-osteoclastos /pré-osteoblastos é um passo crítico para a remodelação óssea durante CaP metástase óssea [26]. Portanto, o desenvolvimento de um sistema de co-cultura com células APC e pré-osteoclastos /pré-osteoblastos é importante para investigar interacções moleculares das vias de sinalização durante CaP metástase óssea e remodelação óssea. Nossos dados mostraram que as células CaP andrógeno-insensitive incluindo PC-3 e C4-2B células poderia crescer bem com pré-osteoclastos ou pré-osteoblastos na mesma placa de cultura com meio definido, que imita

in vivo

ambiente com interação direta de células APC e células ósseas locais. No nosso sistema de co-cultura, as células APC, pré-osteoclastos, e pré-osteoblastos pode também crescer em câmaras individuais, que foram separados por uma membrana permitindo que as proteínas de distribuição (factores solúveis) entre as duas câmaras enquanto separa tipos diferentes de células em câmaras individuais . Desta forma, o efeito de proteínas segregadas (factores solúveis) a partir de células do APC em células de osso ou os efeitos das proteínas segregadas a partir de células ósseas em células CaP poderiam ser investigados. Usando co-cultura, nós testamos as alterações moleculares em osteoclastos ou osteoblastos estimulados por células APC. Estudos recentes realizados por outros investigadores mostrou que a co-cultura de osteoclastos e dos osteoblastos podia ser útil para examinar o metabolismo ósseo e osteoclastog�ese [27], [28]. Estes achados sugerem que o sistema de co-cultura é muito útil para investigar as alterações moleculares quando as células CaP são teleguiados para o osso, o que permitirá avaliar alterações nas transduções sinais entre as células APC e as células ósseas locais durante CaP metástase óssea e osso remodelação como documentado pelos nossos resultados.

a diferenciação de osteoclastos ou osteoblastos é um passo importante na metástase do câncer à remodelação óssea e osso. Ao utilizar o nosso sistema de co-cultura, descobrimos que os pré-osteoclastos podem se diferenciar em amadurecer osteoclastos, quando co-cultivadas com células APC. Além disso, pré-osteoblastos também poderia diferenciar em osteoblastos para amadurecer quando co-cultivadas com células APC. Além disso, verificou-se que a co-cultura de osteoclastos e osteoblastos com CaP células poderia aumentar a diferenciação de osteoclastos e osteoblastos. Estes resultados sugerem que as moléculas produzidas por células CaP poderia induzir a diferenciação de osteoclastos e osteoblastos. Mais importante, verificou-se que a isoflavona e BR-DIM pode inibir a diferenciação de osteoclastos e osteoblastos, quando co-cultivadas com células APC, sugerindo que a isoflavona e BR-DIM seria útil para a inibição de CaP metástase do osso e remodelação óssea (Figura 8) . Tem sido conhecido que as células APC da metástase óssea estimular a remodelação óssea, enquanto facilita a remodelação óssea CaP metástase óssea e invasão no osso [29] – [31], que é conhecido como um ciclo vicioso de remodelação óssea e metástases ósseas. Nossos resultados mostraram que isoflavonas e BR-DIM inibiu a diferenciação de células ósseas, sugerindo que a isoflavona e BR-DIM poderia inibir CaP metástase óssea através da ruptura da remodelação óssea.

Tem sido relatado que a diferenciação dos osteoclastos ocorrer primeiro durante a remodelação óssea quando as células CaP metastizar para o osso [4], [5]. Por conseguinte, a inibição da diferenciação de osteoclastos é importante para interromper CaP metástase óssea e homing. É bem sabido que a sinalização de RANK /RANKL /OPG é o regulador chave para a diferenciação de osteoclastos [32]. Os nossos resultados mostraram que o tratamento de RANKL pode induzir significativamente diferenciação de osteoclastos, o que é consistente com o relatório de publicada [33]. Mais importante, verificou-se que o TGF-β pode sobre-regular a expressão de RANKL, levando à diferenciação de osteoclastos. Estes resultados também são consistentes com o relatório de outro investigador [31], o que sugere que a activação de TGF-β, que é frequentemente observado em CaP avançada, pode estimular a diferenciação de osteoclastos, o que leva à reabsorção do osso e remodelação óssea. Além disso, é bem sabido que o TGF-β também poderia induzir EMT [34], o que facilita a progressão CaP incluindo invasão e metástase óssea. Importantemente, os nossos dados mostraram que a isoflavona poderia atenuar TGF-β induzida a diferenciação dos osteoclastos, e que a isoflavona e BR-DIM poderia regular a expressão de marcadores EMT (Figura 8), sugerindo que estes agentes naturais poderia ser útil para a prevenção da progressão da APC e metástase óssea.

Novas evidências sugerem que microRNAs (miRNAs) regular muitos processos fisiológicos e patológicos [35]. Os nossos resultados mostraram que, além de osteoclastos que regulam, RANKL poderia também sobre-regular a expressão de miR-92a. O miR-92a foi encontrado para regular negativamente a expressão de genes anti-tumorais, resultando na proliferação de células cancerosas [36]. relatório recente mostrou que a caderina-E é um alvo direto de miR-92a e que a expressão de miR-92a promovido metástases linfonodais de carcinoma epidermóide de esôfago humano por meio de infra-regulação da caderina-E [24]. Portanto, RANKL também pode promover a progressão PCA através de aumento da regulação do miR-92a e, consequentemente, pela infra-regulação da caderina-E. Curiosamente, a isoflavona e BR-DIM foram capazes de atenuar o aumento da regulação de miR-92a estimulada por tratamento RANKL, sugerindo a importância destes agentes naturais (isoflavona e BR-DIM) na inibição da progressão da APC e metástase óssea (Figura 8 )

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Em adição aos efeitos inibitórios sobre osteoclastos, isoflavona e BR-DIM inhibted também a diferenciação de osteoblastos com a sub-regulação de periostina, um dos genes importantes para a diferenciação dos osteoblastos. Portanto, visando tanto osteoclastos e diferenciação de osteoblastos, isoflavona e BR-DIM pode efetivamente interromper a remodelação óssea, proporcionando micoenvironment desfavorável para o homing das células APC aos ossos. Embora ambos isoflavona e BR-DIM mostraram efeitos inibitórios na diferenciação de células ósseas, as moléculas envolvidas e níveis alterados de isoflavona ou tratamento BR-DIM não eram os mesmos, sugerindo que mecanismos reguladores complexos estão envolvidos. Por via e análise de rede, descobrimos que isoflavona e BR-DIM poderia afetar múltiplas vias de sinalização como a AR /PSA, NKX3-1 /Akt /p27, LEF1 /ciclina D1, MITF /NR3C1, etc. Na BR-DIM tratada C4 células -2b, encontramos mais potente a sub-regulação de PSA que foi encontrado para modular genes envolvidos na remodelação óssea e na diferenciação de osteoblastos [37]. Estes resultados sugerem que os efeitos a segmentação de vários de isoflavona e BR-DIM, o que tornará isoflavona e BR-DIM poderosos agentes para inibir o crescimento CaP no microambiente ósseo.

Em conclusão, isoflavona e BR-DIM foram capazes de como alvo tanto a diferenciação de osteoclastos e osteoblastos, e também poderia ter como alvo várias moléculas em células APC; Por conseguinte, estes agentes podem inibir a remodelação óssea e crescimento de APC, o que sugere que a isoflavona e BR-DIM poderia ser muito útil para a prevenção da progressão da APC, especialmente metástases ósseas. A actividade biológica de isoflavona e BR-DIM é mediada através da sub-regulação de várias vias de sinalização, incluindo RANKL, AR /PSA, e a sinalização de Akt, que os torna agentes muito promissores para a prevenção e /ou tratamento de APC e das suas metástases ósseas em combinação com a quimioterapia convencional.

Materiais e Métodos

As linhas celulares, reagentes e anticorpos

PC-3 (ATCC, Manassas, VA), C4-2B, Arcap

e e Arcap

H (Novicure, Birmingham, AL), células de cancro da próstata e RAW264.7 de pré-células osteoclastos (ATCC) foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino , 50 U /ml de penicilina, e 50 ug /ml de estreptomicina, numa co 5%

2 atmosfera a 37 ° C. hFOB1.19 pré-osteoblastos células (ATCC) foram mantidas em DMEM /F12 sem vermelho de fenol (Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 50 U /ml de penicilina, e 50 ug /ml de estreptomicina numa atmosfera de 5% de CO

2 atmosfera a 34 ° C. G2535 mistura de isoflavona (70,5% de genisteína, daidzeína e 26,3% 0,31% glycetein fabricado pela Technologies orgânicos e obtido a partir de NIH) foi dissolvido em DMSO para fazer uma solução de reserva contendo 50 mM de genisteína. As concentrações de isoflavona nós descritos neste artigo referem-se a concentração de genisteína na mistura de isoflavona. BR-DIM (bioresposta, LLC, Boulder, CO;. Formulado-DIM com maior biodisponibilidade

in vivo

[38]) foi generosamente fornecidos pelo Dr. Michael Zeligs e foi dissolvido em DMSO para fazer um estoque de 50 mM solução. (Santa Cruz, Santa Cruz, CA), anti-fibronectina (Santa Cruz), anti-RUNX2 (Santa Cruz), anti-osteopontina (Santa Cruz), anti-periostina (Santa Cruz) anti-CXCR-4, anti-E -cadherin (Santa Cruz), anti-vimentina (DAKO), anti-RANKL (R D, Danvers, MA), anti-TRAcP (Sigma, St. Louis, MO), anti-MITF (Santa Cruz), anti- p27 (Santa Cruz), anti-PSA (Santa Cruz), D anti-ciclina (Santa Cruz), anti-p38 (Santa Cruz), anti-β-actina (Sigma) e anti-GAPDH (Sigma) foram utilizados anticorpos primários por análise Western Blot.

co-cultura de células APC com os osteoclastos e os osteoblastos

para emular CaP células cultivadas num ambiente osteoclástica, PC-3 e células RAW264.7 foram co-cultivadas na proporção 1:01 em meio RPMI 1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10%, 50 U /ml de penicilina, e 50 ug /ml de estreptomicina numa atmosfera de CO2 a 5% a 37 ° C. As células foram tratadas com 100 ng /ml de RANKL ou 10 ng /ml de TGF-β durante 8 dias para estimular a diferenciação celular RAW264.7. Da mesma forma, para imitar células cultivadas em ambiente de CaP osteoblástica, células C4-2B e hFOB1.19 foram co-cultivadas a 01:02 proporção em RPMI 1640 /F12 (01:01) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 50 U /ml penicilina, e 50 ug /ml de estreptomicina numa atmosfera de CO2 a 5% a 39 ° C durante 5 dias para estimular a diferenciação de osteoblastos de células hFOB1.19.