Abstract
Fundo
A evidência recente liga a activação aberrante de Hedgehog (Hh) de sinalização com a patogênese de vários cancros, incluindo meduloblastoma, basocelular, pulmão de pequenas células, pâncreas, próstata e ovário. Esta investigação foi projetado para determinar se a inibição desta via pode inibir o crescimento do câncer de ovário seroso.
Metodologia
Nós utilizamos um
in vivo
modelo pré-clínico de câncer de ovário seroso para caracterizar a actividade anti-tumoral dos inibidores da via de Hh ciclopamina e um derivado clinicamente aplicável, IPI-926. serosa do tecido do tumor do ovário humano primário foi usado para gerar os xenoenxertos de tumor em ratinhos que foram tratados subsequentemente com ciclopamina ou IPI-926.
principais conclusões
Ambos os compostos demonstraram actividade anti-tumor significativa como agentes únicos . Quando IPI-926 foi utilizado em combinação com paclitaxel e carboplatina (T /C), foi observado nenhum efeito sinérgico, apesar do tratamento contínuo com IPI-926 após a cessação do T /C continuaram a suprimir o crescimento tumoral. atividade da via Hh foi analisado por RT-PCR para avaliar mudanças no
GLI1
níveis de transcrição. Uma única dose de IPI-926 estromal rato inibido
GLI1
níveis de transcrição às 24 horas com intra-tumoral humana inalterada
GLI1
níveis. terapia crónica IPI-926, durante 21 dias, no entanto, inibiu a sinalização de Hh em ambos estromal do rato e as células de tumores humanos. dados de expressão do estroma dissecados-micro em tumores de ovário seroso humanos confirmaram a presença de
Gli1
transcrição e uma associação significativa entre o
Gli1
níveis de transcrição elevados e agravou a sobrevivência.
conclusões /Significado
tratamento IPI-926 inibe o crescimento do tumor seroso sugerindo a via de sinalização Hh contribui para a patogênese do câncer de ovário e podem ser uma esperança como um novo alvo terapêutico, especialmente no cenário de manutenção.
Citação: McCann CK, Growdon WB, Kulkarni-Datar K, Curley MD, Friel AM, Proctor JL, et al. (2011) Inibição da Hedgehog sinalização Irrita Serous Crescimento cancro do ovário em um xenoenxerto modelo primário. PLoS ONE 6 (11): e28077. doi: 10.1371 /journal.pone.0028077
editor: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 24 de junho de 2011; Aceito: 31 de outubro de 2011; Publicação: 29 de novembro de 2011
Direitos de autor: © 2011 McCann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado por doações do Fundo Ovarian Cancer Research (BRR), Fundação de Pesquisa médica avançada (BRR) e dos Fundos de Pesquisa Memorial Vincent (BRR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Jennifer L. Proctor, Hana Sheikh, Igor Deyneko, Jeanne A. Ferguson, e John R. MacDougall são funcionários da infinidade Pharmaceuticals. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
Nos Estados Unidos, o câncer de ovário é estimada para afligir aproximadamente 22.000 mulheres e causar quase 14.000 mortes por ano. O risco de desenvolver câncer de ovário é de 1 em 70 e é o quinto câncer mais letal em mulheres [1]. A maioria dos pacientes com câncer de ovário apresentam doença em estágio final que é tratado com debulking cirúrgico e quimioterapia à base de platina. Embora 70-80% das mulheres conseguir uma resposta clínica completa, a maioria desses pacientes irá desenvolver doença recorrente que é freqüentemente resistente à quimioterapia. novo tratamento aproximações utilizando terapias citotóxicas convencionais em combinação com terapias direcionadas molecularmente dirigidos contra vias de sinalização específicas necessárias para o desenvolvimento e progressão tumoral potencialmente promissora como estratégias para o tratamento de câncer de ovário durável primária e recorrente [2].
The Hedgehog (hh) via de transdução de sinal compreende uma família de proteínas altamente conservadas que actuam principalmente durante a embriogénese para regular o destino de células-tronco e a organogénese, e promover a proliferação, regeneração e diferenciação de tecidos somáticos no adulto [3]. Patched 1 (Ptch1), um receptor de membrana, normalmente inibe a proteína de membrana de Smoothened (Smo) de activação Gli1. A ligação do ligando de Hh (Sonic, índio ou deserto) para Ptch1 anula os seus efeitos repressivos SMO sobre permitindo a translocação de Gli1 para o núcleo onde induz a expressão de genes alvo [4], [5]. activação aberrante da via de Hh em idade adulta tem sido associada com o desenvolvimento de transformação maligna em uma variedade de cancros humanos [4], [6], [7], [8], [9], [10], [11] , [12]. Além disso, as células tumorais em iniciar alguns cancros têm sido mostrados para ser dependente de Hh a sinalização induzida sustentada e a activação subsequente de Gli1 resultante do ligando sobre-expressão ou activação mutacional da via de Hh [6], [13]. Os regimes de tratamento com antagonistas de Hh via em combinação com terapias moleculares e citotóxicos convencionais demonstraram
in vitro
e
in vivo
atividade contra a proliferação de meduloblastoma, basocelular, mama, pulmão de pequenas células, próstata e modelos de câncer pancreático [10], [11], [12], [14], [15], [16], [17]. Estes antagonistas são actualmente na Fase I e Fase II dos ensaios clínicos.
A activação da via de Hh tem sido documentada em cancro do ovário como um mecanismo potencial envolvida na neoplasia. gene alterado e expressão de proteínas dos membros da via Hh GLI1, smo, Ptch1, Desert Hedgehog (Dhh) e Sonic hedgehog (Shh) no câncer de ovário tem sido relatada, embora a prevalência exata e padrão ainda precisa ser esclarecida [18], [19 ], [20], [21]. Embora muitos estudos sugerem que 50-60% dos tumores de ovário invasivos manifesto a activação da via de Hh, outros investigadores têm argumentado que a activação significativa através de expressão alterada de várias proteínas da via ocorre em menos de 20% das amostras testadas clínicos [19], [20]. Enquanto uma correlação directa entre a expressão de Dhh e estádio clínico, subtipo histológico ou sobrevivência foi relatado, não está claro se a expressão do ligando de Dhh está associada com a diminuição da sobrevivência [20]. Outras análises de amostras de carcinoma de ovário têm sugerido que a elevada expressão da proteína Gli1 é um fator independente associado com a sobrevivência diminuída quando o ajuste para idade, estágio, grau e tipo histológico [18].
In vitro
e limitados
in vivo
estudos fornecem evidências que sugerem que via de sinalização Hh desempenha um papel importante na proliferação de células de cancro do ovário. Shh foi detectada num certo número de linhas de células de cancro do ovário e da adição de um anticorpo monoclonal contra o Shh resultou num decréscimo dependente da dose na proliferação das células [21]. Da mesma forma, o tratamento de células de cancro do ovário em cultura com o inibidor ciclopamina Smo foi encontrada para induzir a paragem do ciclo celular em G1 e promovem a apoptose [20]. Além disso, a expressão ectópica de Gli1 em células de cancro do ovário resultou em proliferação celular aumentada, a mobilidade e as propriedades invasivas [18]. xenotransplantes derivados de células de carcinoma do ovário de linha são também susceptíveis a inibição da via de Hh como o seu crescimento é diminuída acentuadamente após o tratamento com ciclopamina [21]. A maioria dos dados disponíveis sugerem que uma cascata de sinalização Hh ativado pode ser um driver potencial de neoplasia em uma proporção significativa de cânceres de ovário epiteliais tornando-se um alvo atraente para a inibição terapêutica.
Nós exploramos essa possibilidade usando o Hh inibidor da via de IPI-926, um derivado de ciclopamina com o aumento da biodisponibilidade oral e uma meia-vida mais longa [22]. IPI-926 antagoniza a via de Hh através da inibição da Smo. IPI-926 induz uma redução dependente da dose na
Gli1
expressão de ARNm e a remissão do tumor durável em um modelo murino meduloblastoma [22]. Embora IPI-926 não teve qualquer efeito como um agente único, num modelo de ratinho de cancro do pulmão de pequenas células antes da quimioterapia, os animais tratados com IPI-926 após quimioterapia exibiram uma inibição dramática no re-crescimento do tumor [22]. Tendo em conta estes dados pré-clínicos, procurou-se determinar se a inibição da via de Hh por ciclopamina ou IPI-926 tinha um efeito sobre o crescimento de xenoenxertos humanos seroso papilar do cancro do ovário derivadas a partir de tecido humano primário obtidas no momento da cirurgia inicial. Em seguida, avaliada a actividade anti-tumoral de IPI-926 no nosso modelo de xenoenxerto em combinação com paclitaxel e carboplatina e como um único agente de terapia de manutenção. Finalmente, o efeito de uma dose única e tratamento IPI-926 prolongada em atividade da via de Hh foi determinada em ambas as populações de células estromais e tumores. Os resultados suportam a hipótese de que a via de sinalização Hh contribui para a patogênese do câncer de ovário seroso e inibição desta via pode ter benefícios terapêuticos.
Materiais e Métodos
A análise imunohistoquímica
Uma tissue microarray do cancro do ovário (T8235725, Biochain, Hayward, CA), que compreende 64 tumores humanos de ovário benignos e malignos foi utilizado para análise imuno-histoquímica da expressão da proteína Shh. A recuperação de antígenos foi realizada em tampão de citrato de recuperação alvo usando uma panela de pressão durante 40 minutos e as secções foram tratadas com peróxido de hidrogénio a 3% e incubou-se no fundo atirador (Biocare, Concord, CA) para bloquear qualquer ligação não específica. A incubação das secções com o anticorpo anti-anticorpo monoclonal de Shh ab53281 (Abcam, Cambridge, MA), diluída no 1:2000 Vinci verde diluente (Biocare médica, Concord, CA) foi realizada à temperatura ambiente durante 90 minutos. As secções foram então incubadas com o coelho no sistema de polímero roedor (Biocare médica, Concord, CA) durante 45 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram então tratada com 3, 3’cromogénio diaminobenzidina (DAB) durante 5 minutos para visualização. As secções foram então contrastadas com hematoxilina, desidratadas e montadas. IgG total coelho substituído por os anticorpos primários serviu como controle negativo.
coleção tumor e propagação
in vivo
amostras de tumor ou ascite humanos em excesso foram obtidos através de um IRB aprovado infra-estrutura bancária centralizada no Hospital Geral de Massachusetts (MGH). consentimento informado por escrito é recebido de todos os participantes. Não houve amostras derivadas de menores neste estudo. O protocolo repositório de tecido MGH Gyn (07-049) foi revisto e aprovado pela Dana-Farber Cancer Center Harvard (DFHCC). Além disso, utilizou-se amostras arquivados derivados de MGH patologia sob um protocolo aprovado institucional (2008P001695).
suspensões de células isoladas a partir de qualquer tecido de tumor sólido enzimaticamente processado ou ascite foram então depletados de componentes hematológicas, como descrito [23]. Um número específico de células foram suspensos em PBS:Matrigel® (01:01) e injectado por via subcutânea (s.c.) em 6-8 semanas de idade NOD fêmea /SCID (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Os animais foram monitorizados regularmente para determinar a formação de tumores e sacrificados quando se tornaram moribundo ou teve a carga tumoral excessiva. Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Sub-Comité Massachusetts General Hospital de Investigação e cuidado de animais (número de protocolo 2005N000273). Todo esforço foi feito para minimizar o sofrimento.
Para propagação continuada em ratos, os tumores de xenoenxerto foram excisadas e enzimaticamente processado para uma suspensão única célula. A suspensão foi esgotado de rato H-2K
d + células utilizando MACS grânulos (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha) e as células derivadas de tumor remanescentes foram re-injectados subcutaneamente em ratinhos novo destinatário NOD /SCID. Todos os tumores papilares humanas primárias seroso do ovário utilizados neste estudo foram submetidos 4-5 passagens
in vivo
ea histologia serosa de cada foi mantida durante o processo de transplantação de série. Os animais foram alojados e mantidos de acordo com as diretrizes institucionais.
O tratamento de ratos com inibidores da via Hh
ciclopamina.
Ratos portadores de tumores de tamanho combinados (300-600 mm
3) a partir da amostra seroso de cancro do ovário humano SOC11 foram divididos aleatoriamente em dois grupos de seis ratinhos. Cada grupo recebeu 25 mg /kg ciclopamina ou veículo (30% (w /v) de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPBCD) em tampão fosfato de citrato de sódio 0,1 M, pH 3,0) por gavagem oral diariamente. O período de tratamento durou 13 dias. As medições do tumor e os pesos dos animais foram avaliados a cada 4 dias. Os tumores foram medidos semanalmente com compassos de calibre e o volume do tumor (mm
3) foi determinada usando a fórmula [comprimento (mm) x largura (mm) x largura (mm)] /2. pesos de rato foram avaliados a cada 4-7 dias para monitorizar a toxicidade potencial associada com cada tratamento. No final do período de tratamento os animais foram sacrificados e os tumores foram colhidos para análise posterior
IPI-926:.
Vinte e quatro ratinhos com SOC12, SOC13 ou SOC14 tumores de xenoenxerto foram randomizados em quatro coortes com volumes tumorais combinadas (300-600 mm
3). O paclitaxel /carboplatina (T /C) sozinho coorte recebeu semanal intraperitoneal (ip) de injecção de 15 mg /kg de paclitaxel e 50 mg /kg de carboplatina e IPI-926 veículo 5% (w /v) (HPBCD) administrado em dias alternados por sonda oral. O IPI-926 sozinho coorte recebeu 40 mg /kg de IPI-926 cada dois dias, por gavagem oral e Cremophor:ethanol (01:01, veículo paclitaxel) e solução salina (veículo carboplatina) por injecção i.p. semanal injecção. Os ratinhos nos /C + IPI-926 coorte T recebeu paclitaxel semanal (15 mg /kg, i.p.) e carboplatina (50 mg /kg, i.p.) e 40 mg /kg de IPI-926 (todos os outros dias, sonda oral). O grupo de controlo recebeu o paclitaxel, carboplatina e IPI-926 veículos ao esquema de dosagem adequada para cada um. Os volumes tumorais e os pesos do rato foram avaliados a cada 4-7 dias, tal como descrito acima.
a última dose na coorte de T /C foi administrada no dia 14. Aos 21 dias, os ratinhos no controlo e IPI-926 sozinho coortes foram sacrificados e os seus tumores foram colhidos. Porções de cada tumor foram congelados para análise de RNA e embebidos em parafina para análise histológica.
Após a conclusão do tratamento T /C, ratos no T /sozinho e T /C + IPI-926 coortes C continuou para receber ou veículo IPI-926 (T /C grupo sozinho) ou 40 mg /kg de IPI-926 (/C + T IPI-926) a cada dois dias, por gavagem oral. Este tratamento de manutenção foi realizada durante 18-30 dias. No final do período de manutenção, os animais foram sacrificados e os tumores foram colhidos e processados para o RNA e as análises histológica, tal como descrito acima.
aguda IPI-926 tratamento
Ratos abrigando xenoenxertos (300-600 m
3) derivada de SOC12, SOC13 ou SOC14 foram tratados com 40 mg /kg de IPI-926 ou IPI-926 veículo por sonda oral. Após 24 horas os animais foram sacrificados. Os tumores foram colhidos e as porções de cada foram congelados para análise de ARN e embebidos em parafina.
análise de RT-PCR
O ARN foi isolado a partir de tecido tumoral congelado usando o GenElute ™ kit de extracção de ARN de mamífero (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) seguindo as instruções do fabricante. Dois microgramas de RNA isolado foi utilizado para sintetizar ADNc utilizando o kit Invitrogen Superscript ™ VILO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Primers e sondas para rato
Gli1
foram adquiridos da Applied Biosystems Inc. (Carlsbad, CA, número de catálogo Mm00494645_m1). Primers e sondas para humana
Gli1
foram concebidos in-house: frente: 5′-CTTTCATCAACTCGCGATGC-3 ‘; reverso: 5’-GCTCATGGTGCCAATGGAG-3 ‘; sonda: 5’FAM-CATCTCCAGGAGGCTCCTACGGTCA TC- TAMRA-3 ‘. Os iniciadores foram concebidos para abranger as junções exão-exão para impedir a detecção do ADN genómico. Os níveis do ser humano e do rato
GLI1
genes foram normalizados para GAPDH e quantificadas como descrito por Applied Biosystems Inc.
Além de expressão
Gli1
mRNA, analisamos
SHH
,
SMO
,
e Ptch1
níveis de ARNm nas 4 amostras de pacientes utilizados para gerar explantes tumorais para testar a inibição da via Hhog. Primers e sondas para humana
SHH
(número de catálogo Hs00179843_m1),
SMO
(número de catálogo Hs00170665_m1), e
Ptch1
(número de catálogo Hs00970980_m1) foram adquiridos da Applied Biosystems Inc . (Carlsbad, CA).
os níveis do ser humano expressão
SHH
,
SMO
,
e Ptch1
genes foram normalizados para GAPDH e quantificados como descrito por Applied Biosystems Inc.
Análise do
expressão Gli1
no estroma tumor ovariano humano
em estágio final serosa espécimes tumores ovarianos primários de alto grau foram obtidos antes da quimioterapia a partir de 19 pacientes com câncer ovariano internados no Hospital Brigham and Women entre 1990 e 2000. a classificação foi determinada de acordo com a Federação Internacional de normas de ginecologia e obstetrícia. Todas as amostras e seus correspondentes informações clínicas foram obtidas ao abrigo de protocolos IRB-aprovados. Microdissecção e Isolamento de RNA foram realizadas como anteriormente descrito [24]. Resumidamente, os fibroblastos a partir de 7 uM secções congeladas foram microdissecadas usando um microscópio MD LMD microdissecting laser (Leica, Wetzlar, Alemanha) e lisadas em tampão de lise RLT (Qiagen, Valencia, CA). O ARN foi extraído e purificado utilizando o kit RNeasy Micro (Qiagen, Valencia, CA). amostras de RNA total foram quantificados e verificada a sua qualidade com um sistema Bioanalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, CA) e, em seguida, amplificado como descrito anteriormente [24]. Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR) foi realizada em 50 ng de produto amplificado a partir de duas vezes as 19 amostras, utilizando conjuntos de iniciadores específicos para
Gli1
(ACCCCCTGGACTCTCTTGAT para a frente, reverso GACACTCATGTTGCCCACAG). Um iCycler iQ real-time PCR System Detecção (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) foi usada em conjunção com o SuperScript III platina SYBR Green One-Step kit de qRT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. testes Rank sum Wilcoxan
Análise
estatística
não-paramétricos para amostras não pareadas foram utilizados para comparar tamanhos tumorais no cyclopamine e experiências de tratamento de IPI-926. teste t de Student foram utilizados para determinar a significância estatística dos resultados obtidos na experiência tratamento agudo e prolongado IPI-926. Significância foi estabelecido em p ≤ 0,05. STATA (College Station, TX) foi utilizado software v10. A análise de sobrevida foi realizada utilizando GraphPad Prism versão 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA).
Resultados
expressão Shh e Gli1 em tumores do ovário humano
Recentes estudos puseram em evidência o papel da via de sinalização Hh no desenvolvimento e progressão de tumores sólidos [25]. Foi avaliada a expressão relativa dos membros da via de Hh Shh e GLI1 em um subconjunto de tumores ovarianos. Como mostrado na Figura 1A, a análise immuohistochemical de expressão de Shh em uma micromatriz de tecido que compreende tumores benignos e malignos determinado que 47% dos tumores de ovário epiteliais malignos avaliados tinham níveis detectáveis de expressão Shh. Em comparação, a expressão de Shh foi detectada em apenas um de cinco tumores do ovário não epiteliais. Como evidenciado pelos exemplos mostrados na Figura 1A, tanto o nível e distribuição de expressão Shh variaram amplamente entre os tumores analisados. Em seguida, examinaram a expressão de
Gli1
ARNm nos tumores humanos primários individuais papilares serosos ovarianos SOC1-SOC10 (ver Tabela S1 para detalhes do paciente) por RT-PCR. Observou-se uma vasta gama de
Gli1
expressão de ARNm entre os tumores analisados (Figura 1B). Além disso, analisamos
SHH
,
SMO
,
Ptch1
,
e GLI1
níveis de mRNA nas 4 amostras individuais dos pacientes foi utilizado para gerar tumor xenoenxertos para analisar o efeito da inibição da via de Hh sobre o crescimento do tumor do ovário
in vivo
(Figura 2). Em cada um dos tumores,
Gli1
e
SMO
foram mais abundantemente expresso em relação ao
Ptch1
. Houve pouco ou nenhum
SHH
mRNA expresso nestas amostras. Tomados em conjunto, estas análises de expressão sugerem que a via de sinalização de Hh é activada em um subconjunto de tumores do ovário humano, como anteriormente relatados.
. análise imunohistoquímica da expressão Shh foi realizado em um tissue microarray transportando 64 tumores ovarianos primários individuais para avaliar tanto a frequência e nível de expressão Shh no cancro do ovário humano. A coloração de Shh num cistadenocarcinoma seroso pouco diferenciado (painel superior esquerdo), um cistoadenocarcinomas pouco diferenciado (painel superior direito), um cistadenocarcinoma bem diferenciado (painel inferior esquerdo), e um adenocarcinoma fracamente diferenciado (painel inferior direito) é mostrado. A tabela resume a frequência de coloração Shh nos tumores benignos e doenças malignas não-epiteliais e epiteliais presentes no microarray tumor de ovário. B. em tempo real Q-PCR foi realizada por análise de
GLI1
níveis de mRNA em 10 tumores de cancro humanas primárias papilares serosos ovarianos. Primers específicos para o ser humano
Gli1
e
GAPDH
foram utilizados. Para cada amostra, o nível de
Gli1
mRNA em relação ao nível de
GAPDH
mRNA é mostrado.
A expressão de
Gli1
,
Ptch1
,
SHH
e
SMO
foi analisado por RT-qPCR em 4 tumores primários humanos seroso do ovário (SOC11-SOC14) estabelecidas como xenoenxertos em NOD /SCID . Primers específicos para cada gene humano e humanos
GADPH
foram utilizados. Para cada tumor, os níveis de cada parente gene para
GADPH
mRNA são mostrados.
A inibição da Hh sinalização bloqueia o crescimento de xenoenxertos de tumor de ovário seroso humanos
para avaliar o significado funcional da via de Hh na progressão de cancro do ovário, tratámos ratinhos albergando xenoenxertos ovarianos serosas humanos de tumor gerados a partir do SOC11 tumor sensível platina quer com o ciclopamina Hh inibidor da via ou veículo e avaliada regularmente o efeito de cada tratamento sobre o volume do tumor. Nos ratinhos tratados com cyclopamine, o crescimento do tumor foi impedido durante o período de tratamento de treze dias, resultando em um aumento significativo (p 0,004) diminuiu o volume do tumor no dia 13 relativamente ao observado nos animais tratados com veículo (Figura 3). o mínimo de toxicidade foi observada em animais tratados com cyclopamine não observados estatisticamente diferentes alterações no peso do mouse (Figura S1).
Ratos portadores de xenoenxertos seroso papilar humanos ovarianos tumorais de amostra SOC11 foram randomizados em 2 grupos com volumes tumorais combinados e tratados com veículo ou ciclopamina. Os volumes tumorais foram avaliados regularmente. A mudança do volume do tumor é mostrada em relação ao volume do tumor no início da experiência. As barras de erro representam o erro padrão da média (S.E.M). A significância foi determinada utilizando um teste de Wilcoxon.
A nossa análise do efeito cyclopamine no crescimento de xenotransplante tumoral sugeriu que a inibição da sinalização de Hh pode ser uma abordagem eficaz para controlar a progressão do tumor de ovário. A seguir, realizou experiências semelhantes usando o quimicamente mais potente e clinicamente aplicável Hh inibidor da via do IPI-926 atualmente em Fase I /II de ensaios clínicos em tumores sólidos não-ovarianos. IPI-926 é derivado de ciclopamina e tem propriedades farmacêuticas melhoradas, incluindo maior potência, uma meia-vida mais longa e uma maior biodisponibilidade. Ficamos especialmente interessados em examinar a utilidade potencial de IPI-926 em combinação com o padrão de quimioterapia de primeira linha. Realizou-se três experiências separadas utilizando serosas tumores humanos primários independentes de ovário de xenoenxerto (SOC12, SOC13, e SOC14) para analisar a actividade anti-tumoral de IPI-926 sozinho ou em combinação com paclitaxel e carboplatina (T /C). Os xenoenxertos de tumor foram derivados a partir de 2 pacientes com a doença resistente a platina (SOC12, SOC13) e de um paciente com doença sensível platina (SOC14) e os resultados destas análises são mostrados na Figura 4. Os ratinhos portadores de xenoenxertos humanos primários serosos ovarianos tumorais foram randomizados em quatro grupos de tratamento que receberam quer o controle do veículo, IPI-926 sozinho, T /C sozinho ou IPI-926 e T /C. Durante o período de tratamento inicial (dias 0-21), o volume do tumor em ratinhos tratados com o controlo do veículo aumentou dramaticamente (Figuras 4A, 4B, 4C). Tratamento de SOC12, SOC13 e SOC14 com xenoenxertos de T /C sozinha resultou numa diminuição significativa no volume do tumor (p 0,05; p 0,007; p 0,001, respectivamente) em relação à testemunha. Como ciclopamina, IPI-926 como um agente único, tiveram um efeito estatisticamente significativo inibitório sobre o crescimento do tumor em relação ao controlo do veículo, tanto para SOC13 (Figura 4B, p 0,007) e SOC14 (Figura 4C, p 0,01). A combinação de IPI-926 e T /C não demonstrou nenhum maior actividade anti-tumoral do que T /C sozinho para todos os tumores testados. Nestas análises, observamos nenhuma perda significativa de peso em animais tratados com IPI-926 como um agente único em comparação com veículos animais tratados (Figura S2).
Os ratos com tumores derivados de pacientes com diagnóstico de câncer de ovário seroso foram randomizados em 4 grupos (n = 4-6 animais por grupo de tratamento) com volumes de tumor combinados e submetidos aos regimes de tratamento indicados. Três amostras de cancro independente de papilares serosos ovarianos, SOC12 (A), SOC13 (B) e SOC14 (C) foram utilizados como réplicas biológicas. Coortes foram inicialmente tratadas com o veículo sozinho (controlo), o paclitaxel e carboplatina (T /C) por si só, IPI-926 sozinho ou T /C + IPI-926, tal como indicado. A última dose de T /C foi entregue no dia 14 (indicado pela linha ponteada). A alteração percentual no volume do tumor representa a alteração no volume do tumor em relação ao volume do tumor no início da experiência. As barras de erro representam o erro padrão da média (S.E.M). A significância foi determinada utilizando um teste de Wilcoxon.
A seguir, examinaram a atividade anti-tumoral de IPI-926 após a interrupção do tratamento T /C. Para estas análises, aqueles ratinhos que receberam, quer T /C por si só ou em combinação com IPI-926 foram administrados a dose semanal terceiro e último de T /C no dia 14 do regime de tratamento (linha a tracejado, Figura 4). Os animais foram então mantidos em cada veículo (T /C coorte tratada sozinho) ou IPI-926 (T /C + IPI-926 coorte tratada) e os volumes dos tumores foram avaliados em intervalos regulares. Como mostrado nas Figuras 4A, 4B e 4C, a administração continuada de IPI-926, após a conclusão do tratamento mantida a regressão do tumor T /C, e num caso (SOC13, Figura 4B), resultou numa diminuição adicional do volume do tumor para níveis que eram virtualmente indetectável. Em contraste, foi observado o aumento constante do crescimento do tumor em ratinhos tratados com veículo após a cessação da administração de T /C. Assim, o tratamento continuado IPI-926 resultou em um aumento significativo (p 0,02). Diferença do volume do tumor em relação ao observado em ratinhos tratados veículo para todos os três tumores primários individuais
IPI-926 inibe a actividade da via de Hh em ambos o estroma do tumor e
dados recentes sugerem que a sinalização de Hh no estroma é necessário para o desenvolvimento do tumor em modelos de xenoenxerto de ratinho pâncreas e cancro do cólon (25). Para avaliar o local de ação do IPI-926 em nosso sistema, analisamos
Gli1
expressão de mRNA em ambos os estroma mouse e células tumorais humanas, quer após o tratamento agudo ou prolongado com IPI-926. Para os estudos de toxicidade aguda, ratinhos albergando xenoenxertos gerados a partir de SOC12, SOC13 e SOC14 foram tratados quer com veículo ou IPI-926 durante 24 horas. Após a colheita do tumor, a expressão relativa de rato e humano
Gli1
foi avaliada por RT-PCR utilizando iniciadores específicos para cada espécie. A aguda tratamento IPI-926 levou a uma rápida diminuição significativa no rato
Gli1
sem inibição da humana
Gli1
expressão (Figura 5, painel superior). Foram também analisadas estroma tumoral e específica
expressão Gli1
nos xenoenxertos de SOC12, SOC13 e SOC14 colhidas dos ratinhos tratados com veículo ou IPI-926 durante 21 dias nos estudos mostrados na Figura 4. Tal como no aguda ambiente, tratamento prolongado IPI-926 conduziu a uma inibição significativa de
Gli1
expressão do mRNA no estroma (p 0,05) do compartimento (Figura 5, painel inferior). Em contraste com o que também foi observado em casos agudos, a inibição moderada da
Gli1
expressão de ARNm foi observada no tumor (p 0,03). Após o tratamento prolongado
Gli1
os níveis de expressão de mRNA em tumores de xenoenxerto de derivados de SOC12, SOC13, e SOC14 foram analisadas por PCR em tempo real quantitativo após tratamento de ratinhos com IPI-926 durante 24 horas (painel superior) ou 21 dias (painel inferior). Os níveis relativos de humano (painel da esquerda) e de murganho (painel da direita)
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expressão de mRNA foram analisados usando primers específicos para cada espécie. As barras de erro representam o erro padrão da média (S.E.M). O significado (# p≤0.03, * p = 0,05, ** p≤0.001) foi determinada utilizando teste t de Student.
High
expressão Gli1
no estroma de humano tumores de ovário seroso papilífero se correlaciona com a sobrevivência pobre
a fim de validar que
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mRNA é expressa no estroma de tumores do ovário seroso humanos, examinamos a expressão relativa da
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no estroma microdissectados de um segundo grupo de 19 tumores humanos primários de ovário seroso (Tabela S2). O estroma microdissecadas destes tumores demonstraram uma gama completa de
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expressão de ARNm de (dados não mostrados). análise de sobrevida univariada revelou que a alta
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expressão de mRNA no estroma correlacionada com uma piorou significativamente a sobrevivência (Figura 6).
Os dados de análise de sobrevivência obtida para
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expressão de mRNA em amostras do estroma microdissecadas de 19 pacientes usando a validação de qRT-PCR. Superior
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expressão de mRNA correlacionada com a diminuição da sobrevida (-rank log de teste, p 0,015), com uma sobrevida média de 26.50 meses para pacientes com baixa
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expressão de mRNA contra 16 meses para os pacientes que tinham tumores com maior
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expressão de mRNA no estroma.
Discussão
Numerosos investigadores documentaram o papel da via de sinalização Hh no desenvolvimento e manutenção de tumores sólidos [4], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Evidências recentes sugerem que a activação desta via está envolvida na patogénese do cancro do ovário (18, 20, 21). No nosso estudo, a segmentação terapêutico desta via conduziu à inibição do crescimento do tumor seroso papilar humano.