Abstract

campo próstata denota alterações moleculares em tecidos histologicamente normais adjacentes ao tumor. Tais alterações incluem desregulada a expressão da proteína, como já anteriormente demonstrado para o factor de transcrição chave resposta de crescimento precoce 1 (Egr-1) e a enzima lipogénica sintase de ácido gordo (FAS). Aqui nós adicionamos os dois fatores secretados macrófagos inibidora das citocinas 1 (MIC-1) e de plaquetas fator de crescimento derivado A (PDGF-A) à crescente lista de marcadores proteicos de cancerização de campo próstata. Expressão de MIC-1 e PDGF-A foi medido quantitativamente por imunofluorescência e exaustivamente analisados ​​utilizando dois métodos de captura do sinal e vários agrupamentos de dados gerados no canceroso humano (n = 25), histologicamente normal adjacente (n = 22), e doença- tecidos livres (n = 6) de próstata. Foram analisados ​​um total de 208 imagens digitalizadas. MIC-1 e PDGF-A expressão em tecidos tumorais foram elevados 7,1 vezes a 23.4x e 1,7x 3,7x em comparação com os tecidos livres de doença, respectivamente (p 0,0001 e p = 0,08 e p 0,01 e p = 0,23, respectivamente ). Em apoio do campo de cancerização, MIC-1 e PDGF-A expressão em tecidos adjacentes foram elevados 7,4x a 38.4x e 1,4x a 2,7x, respectivamente (p 0,0001 e p 0,05 e P 0,05 e p = 0,51, respectivamente ). Além disso, a MIC-1 e PDGF-A expressão foram semelhantes em tecidos tumorais e adjacentes (0,3x a 1,0x; p 0,001 e p = 0,98 para o MIC-1; 0,9x a 2,6x; p 0,01 e P = 1,00 para PDGF-A). Todas as análises indicaram um elevado nível de heterogeneidade inter e intra-tecido em todos os tipos de tecidos (coeficiente de variação de 86,0% média). Os nossos dados mostram que o MIC-1 e PDGF-A expressão é elevada em ambos os tumores da próstata e tecidos adjacentes estruturalmente intacto quando comparado com as amostras livres de doença, a definição de cancerização campo. Estes factores segregados poderia promover a tumorigénese em tecidos histologicamente normais e conduzir a multifocalidade tumor. Entre as várias aplicações clínicas, eles também poderiam ser exploradas como indicadores de doença em biópsias negativas falsas, identificar áreas de repetição de biópsia, e adicionar informações molecular para margens cirúrgicas

Citation:. Jones AC, Antillon KS, Jenkins SM, Janos SN, Overton HN, Shoshan DS, et al. (2015) Prostate campo de cancerização: Expressão desregulada de Macrófago inibidoras de citocina 1 (MIC-1) e Factor de Crescimento Derivado de Plaquetas A (PDGF-A) no tumor tecido adjacente. PLoS ONE 10 (3): e0119314. doi: 10.1371 /journal.pone.0119314

Editor do Academic: Tanya V. Kalin, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, United States |

Recebido: 02 de outubro de 2014; Aceito: 12 de janeiro de 2015; Publicação: 13 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Jones et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH) Grant RR0164880 e NIH Grant R03CA136030-02 (a M. Bisoffi), da Universidade do Novo México Cancer Support Center Grant NIH /NCI P30CA118110 e um Verão Graduação Research Fellowship (SURF, para DS Shoshan) do Gabinete do programa de Iniciação Científica da Universidade Chapman. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Adenocarcinoma da próstata se desenvolve através de estágios cada vez mais malignas. Estes podem incluir ou ser suportado por atrofia inflamatória proliferativa (PIA), uma possível ligação entre os processos inflamatórios e a transformação maligna de tecidos prostáticos [1], e por neoplasia intraepitelial prostática baixo ou alto grau (PIN), um precursor do cancro da próstata [ ,,,0],2]. PIA e PIN são lesões histologicamente evidentes que são claramente identificáveis ​​por patologistas cirúrgicos formados em distúrbios urológicos. PIA é caracterizado principalmente por um aparecimento hipercromático global de componentes glandulares com calibres variáveis ​​acinares em microscopia de baixa ampliação, e a presença distinta de células inflamatórias [3]. Todas as formas de PIN partilhar a presença de proliferação intra-luminal das células secretoras do sistema de condutas acinar e características citológicas anormais, tais como a relação da área nuclear-a-citoplasmático, teor de cromatina, e o tamanho dos nucléolos [4]. É concebível que as alterações morfológicas celulares que conduzem a uma aparência histologicamente anormal dos componentes glandulares de tecidos da próstata são precedidas por uma fase durante a qual ocorrem alterações moleculares em completa ausência de qualquer alteração citológica ou histológica. Este tipo de pré-malignidade é congruente com o conceito de “cancerização de campo” ou “efeito de campo”, um termo que foi introduzido por Daniel Slaughter em 1953 no contexto de carcinoma epidermóide oral [5], e que agora podem excluir qualquer celular e partida histológica da normalidade e se concentra em aberrações moleculares apenas [6]. Deste modo, um número de genética, epigenética, e alterações bioquímicas nas células estruturalmente intactas, tanto de origem epitelial e estromal que residam tecidos em histologicamente normais adjacentes para adenocarcinomas da próstata ( “campo malignizado” tecidos) foram recentemente identificados por nós e outros e postulados como ser de valor como indicadores clínicos da doença (revisto em [7-10]). Temos anteriormente identificada, entre outros, o factor de transcrição chave resposta de crescimento precoce 1 (Egr-1) e a enzima lipogénica sintase de ácido gordo (FAS) como marcadores distintos de cancerização campo da próstata [11,12]. De nota, factores de crescimento e citocinas não ter sido anteriormente descrito no contexto de cancerização campo. Demonstramos aqui pela primeira vez que a expressão dos factores excretados citoquina inibidora de macrófagos 1 (MIC-1) (também chamado não esteróide droga anti-inflamatória activada gene-1 [NAG-1], factor de crescimento /diferenciação 15 [GDF-15 ], e o factor derivado de próstata [PDF]), bem como plaquetas derivadas do factor de crescimento a (PDGF-a) são desregulados na evidentes tecidos humanos adjacentes cancerosas e de tumor, quando comparado com os tecidos doadores de indivíduos sem a doença, proporcionando assim evidência adicional de cancerização de campo de próstata

Materiais e Métodos

amostras de pacientes

Um grupo de 16 casos identificados-de foram obtidos a partir da Rede Cooperativa de Tecidos Humanos (CHTN;. Divisão Ocidental, Nashville TN; https://www.chtn.nci.nih.gov/; 5 casos) e do Departamento de Cirurgia, Urologia Division da Universidade de New Hospital México (UNMH) em Albuquerque NM; https://hsc.unm.edu/som/surgery/urology/; 11 casos. De acordo com todas as leis federais, estaduais e universitários, as amostras de tecido UNMH foram coletadas de pacientes submetidos à prostatectomia e após consentimento informado por escrito, a doação de cerca de 100-500 mg de seu tecido para análises moleculares. O Conselho de Revisão Institucional da Universidade do Novo México Health Sciences Center aprovado especificamente, o presente estudo (# 05-417). A coorte continha 16 adenocarcinomas da próstata, dos quais 13 foram combinados para tecidos da próstata tumor-adjacente. A idade média deste grupo de doentes foi de 58,7 anos com uma gama de 44-68 anos. Estas amostras destaque escores de Gleason de 6 a 9 e patológico nó tumor metástase (TNM) etapas (de acordo com a Comissão Americana conjunta sobre Câncer) de T2c para T3b. Para 3 tecidos tumorais, os correspondentes tecidos adjacentes eram de qualidade insuficiente para inclusão nos resultados finais. Seis espécimes de próstata de-identificados e inteiramente livre de doença de casos de autópsia de indivíduos que morreram devido às condições não relacionadas ao câncer foram obtidos a partir da CHTN. A média de idade dos casos de autópsia foi de 48,7 anos com uma gama de 26-79 anos. Todos os tecidos foram histologicamente analisadas pela nossa colaborando patologista cirúrgico (por exemplo Fischer), em especial para excluir a presença de células cancerosas crípticas no tumor tecidos da próstata adjacentes. Um microarray tecido da próstata humana com 9 tecidos histologicamente normais combinados para seus tumores correspondentes foi comprado da Novus Biologicals (catálogo # NBP2-30169; San Diego CA). A idade média dos casos tissue microarray era 64,2 anos com uma gama de 44-70 anos. Estas amostras destaque escores de Gleason de 7 a 10 e estágios patológicos TNM de T2c para T3b. A Tabela 1 mostra todos os dados demográficos e patológicas.

Quantitative imunofluorescência

imunofluorescência quantitativa foi realizada como descrito em nosso trabalho anterior [12]. Resumidamente, secções de tecido de próstata embebidas em parafina foram desparafinadas com xileno e re-hidratadas com concentrações decrescentes de etanol. A recuperação de antígenos foi realizada em ebulição Tris 10 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de Tween 20, pH 9,0 (por HCl) durante 20 minutos, lavados rapidamente com água da torneira, seguido por agitação suave em tampão salino Tris (TBS; Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6 com HCl) contendo 0,025% de Triton X-100 (TBST). Os tecidos foram bloqueadas em 10% de soro de cabra normal (sc-2040, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) em TBS contendo antigénio de soro bovino 1% (BSA) durante 2 horas à temperatura ambiente, em seguida, incubadas com os anticorpos primários em TBS contendo 1% BSA, a 4 ° C durante a noite. MIC-1 foi detectada com 3 ug /ml de anticorpo policlonal de cabra ab39999 de Abcam (Cambridge MA; de tecidos de UNMH e CHTN) ou anticorpo policlonal de coelho SC-66905 a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA; o para microsséries de tecido). PDGF-A foi detectado com anticorpo de 3 ug /ml de anticorpo policlonal de coelho SC-7958 da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). IgG de coelho normal ou IgG normal de cabra (10500C e 10200, respectivamente, a partir de Invitrogen, Carlsbad CA) foi utilizado como controlo negativo para assegurar a especificidade. As secções de tecido foram lavadas em TBST e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com IgG anti-cabra de coelho 633 conjugado com Alexa Fluor (A21086 para MIC-1 nos tecidos UNMH /CHTN) ou Alexa Fluor anti-IgG de coelho 488 de cabra conjugado com ( A11008 para MIC-1 para as micromatrizes de tecido), e com IgG de cabra Alexa Fluor 633 conjugado com anti-coelho (A21070 para PDGF-a) (todos da Invitrogen, Carlsbad CA). Todos os anticorpos secundários foram a 3.3μg /ml e em TBS contendo BSA a 1% e 10%, quer de coelho normal ou soro de cabra normal a 10% (para os anticorpos criados em coelho ou cabra, respectivamente). Após lavagem em TBS, as secções de tecido foram contrastadas para núcleos com diamidino-2-fenilindole (DAPI; 900nm) durante 2 minutos à temperatura ambiente. Após a lavagem com TBS, as células e secções foram montadas em meio de montagem aquoso VAB (Genemed Biotechnologies, San Francisco, CA) ou Fluoroshield meio de montagem (Sigma, St. Louis, MO). Os tecidos UNMH /CHTN foram analisados ​​por aquisição de imagem espectral e desmistura linear realizado na Universidade do Novo México recursos partilhada Health Sciences Center microscopia de fluorescência Núcleo Facilidade usando um microscópio confocal Zeiss LSM510 META com uma Plan-Apochromat 63x de óleo 1.4 objetivo NA, e usando modo de lambda do software Zen (Carl Zeiss MicroImaging LLC, Thornwood NY). 405 nm e 633 nm foram utilizados lasers para excitar DAPI e Alexa Fluor 633, respectivamente, e uma gama de emissão de 433nm a 690nm foi usada para adquirir pilhas lambda e para capturar a informação espectral dos fluoróforos. lâminas de controlo apenas com DAPI, único anticorpo secundário e tecidos sem corante foi visualizada para adquirir pilhas lambda separada de cada componente fluorescente, ou seja, DAPI, Alexa Fluor 633, e autofluorescência. foram seleccionados pixels representativos de cada uma dessas imagens, criando os espectros de emissão de cada componente. Estes espectros foram então usadas para unmix linearmente as imagens usando a mesma configuração no software Zen, um processo que foi igualmente aplicado a todas as imagens espectrais para assegurar a validade de comparações intra e inter-tecido. Espectralmente imagens confocal não misturados foram então importados para o software de imagem de microscopia digital de Slidebook (Slidebook, Denver CO) para a quantificação. O micro-arranjo de tecido foi analisada por microscopia de imunofluorescência convencional, utilizando um microscópio invertido Zeiss Axiovert equipado com um 35 470 excitação /emissão 525 Dotar filtro passa-banda e um dicróico 360 DAPI excitação /emissão 460 de filtro. Foram utilizados dois métodos de quantificação: (A) Análise de slides inteiro (WSA); intensidades de sinal (contagem de pixeis) foram medidos especificamente para Alexa Fluor 633 (ou Alexa Fluor 488 do tissue microarray). Para os tecidos de UNMH /CHTN, análise WSA foi dirigido especificamente para áreas citoplasmáticos através da exclusão de áreas definidas por DAPI. (B) Regiões de análise do interesse (ROI); 3 ROI representante (definidos como áreas com imunocoloração robusta) por lâmina foram escolhidos e as intensidades de sinal (soma de contagem de pixeis por área) foi determinada. O tamanho de cada ROI foi ~ 100 um

2; para o UNMH /CHTN ROI tecidos foram escolhidos por dois co-trabalhadores cegos para a natureza do tecido (F. Bisoffi e S. Jones) para evitar a polarização; para o tissue microarray, eles foram colocados em posições iguais através de cada imagem e as intensidades de sinal foram determinados usando software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda MD). Para as imagens aqui apresentados todos os sinais (vermelho e verde) foram pseudo-cor amarela para uma melhor visibilidade

Estatísticas

Para a quantificação, os tecidos de uma espécie foram agrupados em quatro categorias diferentes:. (I ) Todos combinada, (ii) acima e abaixo da mediana para contrariar o efeito de heterogeneidade, e (iii) não emparelhado para neutralizar a possibilidade de um efeito de polarização jogo. As diferenças na expressão de MIC-1 e PDGF-A entre os grupos foram analisadas por dois testes estatísticos padrão, ou seja, o teste t de Student bilateral no Microsoft Excel (Redmond WA) e, para controlar parcialmente para tamanho de amostra pequeno e uma distribuição com variância infinita devido à heterogeneidade do tecido, o teste de Wilcoxon Rank somas no pacote de software de análise de Jumpin (Jumpin software, Cary NC). Os níveis correspondentes de significância (P) são indicados como P (t) e p (WRS), respectivamente. heterogeneidade de tecido Inter dentro de um tipo de tecido (tumoral, adjacente, ou livre de doença) foi avaliada por cálculo do coeficiente de variação (CV), expressa em% com base na média de todas as medições. heterogeneidade do tecido intra para a coorte UNM /CHTN foi avaliada calculando a média CV expressa em por cento com base dos currículos individuais derivados a partir de imagens de casos individuais. heterogeneidade do tecido intra para a coorte de micromatriz de tecido foi avaliada calculando a média CV, expressa em percentagem com base dos CV individuais derivados a partir dos valores de ROI dos casos individuais. correlações potenciais de intensidades de sinal entre os tecidos combinados foram analisadas por determinação do coeficiente de correlação (r) e confirmado por determinação da independência dos grupos de dados por parte do χ

2 de teste. Associações com parâmetros clínicos foram analisados ​​utilizando t-teste do estudante. A significância estatística para todas as análises foi definido em p ≤ 0,05.

Resultados

Detecção de MIC-1 e PDGF-A em tecidos da próstata humana por imunofluorescência (IF)

Ao assegurando que os anticorpos IgG de controlo não específicos não gerar qualquer fluorescência mensurável, todas as colorações imunológicas com anticorpos primários específicos foram realizados sob condições idênticas. As Figs. 1A-C mostram imunomarcações representativos para MIC-1 em tumores (cancerosos), tumor adjacente, e os tecidos livres da doença, respectivamente. A inspecção visual indicou que tipicamente, uma MIC-expressão, foi semelhante no tumor e tecidos adjacentes, bem como elevada em comparação com tecidos da próstata livre de doença de indivíduos sem cancro. Embora tenha sido observada uma coloração preferencial em compartimentos epiteliais, a coloração foi difundir na aparência, aparentemente, tanto intra- e extra-celular na natureza, o que está em conformidade com o MIC-1 sendo uma citocina segregada [13,14] (Figs. 1A e B). Muito pouca, se alguma, MIC-1 imunocoloração foi observada em tecidos da próstata livre de doença de autópsias não relacionadas com o cancro (Fig. 1C). Da mesma forma, a imunocoloração para PDGF-A foi semelhante no tumor e tecidos adjacentes (Fig. 1D, E), elevada em comparação com tecidos livres da doença (Fig. 1F), e predominantemente epiteliais mas difusas, de acordo com um factor de crescimento segregado [15 ]

casos representativos de tumores de próstata (a e D) e tecidos adjacentes (B e e), bem como casos de tecidos de controle livres de doenças não relacionadas ao câncer (C e F) são mostrados.; imagens representam sobreposições de coloração nuclear por DAPI (azul) e Alexa Fluor 633 imunocoloração (amarelo /branco); as inserções são Alexa Fluor 633 imunocoloração única; barras brancas representam 10 micrômetros. Os diamantes, fechou flechas e setas abertas em B e E denotam um lúmen típicos, o compartimento de células epiteliais, e compartimento de células do estroma, respectivamente.

A quantificação do MIC-1 e PDGF-A expressão em humanos tecidos da próstata

Usando o nosso protocolo estabelecido de fluorescência quantitativa com base na aquisição de imagem espectral e desmistura linear [12], um total de 190 imagens digitalizadas foram submetidos a uma quantificação abrangente das intensidades de sinal que representa MIC-1 e PDGF- Uma expressão de (Tabela 1). As diferenças de expressão no tumor, tumor adjacente, e tecidos da próstata livre de doença foram determinados em amostras agrupados em quatro categorias diferentes, ou seja, (i) todas combinadas, (ii) acima e abaixo da mediana para contrariar o efeito de heterogeneidade, e (iii ) não pareado para neutralizar a possibilidade de um viés efeito jogo. Estas categorias foram analisados ​​usando imagens digitalizadas capturadas no modo WSA e ROI (ver Materiais e Métodos).

Os níveis de expressão para MIC-1 em tecidos tumorais foram significativamente elevados (10.2x para 23.4x pela WSA e 7,1 vezes a 9.4x por ROI) em comparação com tecidos livres de doença (p 0,05 e P 0,0001). Em apoio do campo de cancerização, MIC-1 expressão no tumor tecidos adjacentes era semelhante e significativamente elevados (19.2x para 38.4x por WSA e 7,4x a 20.5x por ROI) em comparação com tecidos livres de doença (p 0,05 e P 0,0001 ), e MIC-1 expressão foi semelhante (0,3x a 1,1x 0,5x e WSA por a 1,0x por ROI) no tumor e tecidos de tumor adjacentes (p 0,05 para a maioria das análises) (Tabela 2). representação visual dos dados de suporte de campo da próstata cancerização para MIC-1 é dada na Fig. 2. Análise WSA indicou que MIC-1 expressão foi significativamente diferente entre tecidos tumorais e livre de doença (p (t) 0,01; p (WRS) 0,01) e entre tumor tecidos adjacentes e livre de doença (p (t ) 0,001; p (WRS) 0,0001). Em contraste, MIC-1 expressão era altamente semelhante (p (t) = 0,94; p (WRS) = 0,21) no tumor e tecidos de tumor adjacentes (Fig. 2A). Para enfrentar a possibilidade que combinava com o status pode influenciar a semelhança de expressão no tumor e os seus tecidos adjacentes, determinou-se o coeficiente de correlação de intensidades de sinal derivadas de tecidos combinados, que indicaram nenhum preconceito jogo (r = 0,27). Além disso, analisamos também a diferença no MIC-1 expressão entre as imagens pertencentes a casos não-correspondido. Embora esta análise composta menos pontos de dados, a diferença entre o tumor e os tecidos livres de doença (p (t) 0,01; p (WRS) 0,05), bem como entre tumores tecidos adjacentes e livre de doença (p (t) 0,05; p (WRS) 0,0001) permaneceu significativo, enquanto MIC-1 expressão no tumor e tecidos de tumor adjacentes (p (t) = 0,97; p (WRS) = 0,95) foi semelhante (Figura 2B).. As Figs. 2C e 2D mostram resultados semelhantes para imagens analisadas pelo método ROI. MIC-1 expressão foi significativamente diferente entre os tecidos tumorais e livre de doença (p (t) 0,001; p (WRS) 0,01) e entre tumor tecidos adjacentes e livre de doença (p (t) 0,001; p (WRS) 0,0001). Em contraste, MIC-1 expressão foi semelhante (p (t) = 0,30; p (WRS) = 0,16) no tumor e tecidos de tumor adjacentes (Fig. 2C). Houve novamente nenhuma correlação na expressão entre os tecidos combinados (r = 0,12) e em casos não-correspondidos, a diferença entre os tecidos tumorais e livre de doença (p (t) 0,001; p (WRS) 0,05), e entre tumorais tecidos adjacentes e livre de doença (p (t) 0,001; p (WRS) 0,001) manteve-se significativa, enquanto MIC-1 em tecidos tumorais e de tumores adjacentes (p (t) = 0,69; p ( WRS) = 0,56) foi semelhante (Fig. 2D). É de notar que o nível de heterogeneidade inter e intra-tecido para ambos os tipos de medições foi elevada (coeficiente de variação = 86,1%). Porque MIC-1 expressão parecia apoiar claramente o conceito de cancerização de campo em tecidos da próstata, determinou-se a sua expressão em um conjunto independente de 9 tumor combinados e tecidos adjacentes destaque em microarrays de tecido comercialmente disponíveis (Fig. 3A e 3B). A quantificação de ambas as ROI e WSA métodos (. Figuras 3C e 3D) revelaram níveis de expressão semelhantes MIC-1 em tecidos de tumor e do tumor (0,9x-adjacente por WSA [P (t) = 0,47; p (WRS) = 0,76] e 1,0x por ROI [P (t) = 0,59; p (WRS) = 0,82]) (Tabela 2). Não houve correlação entre o tumor e os seus tecidos adjacentes, indicando a ausência de um viés jogo (r 0,1). Ea inter e intra-tecido heterogeneidade foi notavelmente inferior (16,9%), provavelmente devido ao método de imunofluorescência convencional

(AD) MIC-1 níveis de expressão (indicado como intensidades de sinal [contagem de pixels]) em livre de doença, tumor adjacente e tecidos tumorais; os tipos de análise foram os seguintes (como por Materiais e Métodos): (B) correspondentes não casos na coorte UNMH /CHTN (A e B) Análise Total corrediça (WSA) para todos (A) e; (C e D) região de interesse (ROI) de análise para todos (C) e (D) casos não correspondida na coorte UNMH /CHTN. pontos de dados individuais são mostrados como pequenos quadrados pretos (parcialmente sobrepostas); as caixas representam as medianas do grupo (linha através do meio) e quartis (percentis 25 e 75) nas suas extremidades; linhas acima e abaixo caixas indicam os percentis 10 e 90, respectivamente. Para cada análise, o número de imagens e de casos é indicada; valores de p acima dos painéis denotar o nível de significância estatística para as diferenças entre os grupos, conforme calculado pelo teste t de Student (p (t)) e pela Wilcoxon Rank somas de teste (p (WRS)).

(AB) de imunofluorescência com anticorpos anti-MIC-1 anticorpo num tumor da próstata representativo (a) e tumor de tecido adjacente (B); imagens representam sobreposições de coloração nuclear por DAPI (azul) e Alexa Fluor 488 imunocoloração (amarelo /branco); as inserções são Alexa Fluor 488 imunocoloração única; barras brancas representam 10 micrômetros. O diamante, fechou seta, e flecha aberta no B denotam um lúmen típica, o compartimento de células epiteliais, e compartimento de células do estroma, respectivamente. (C-D) os níveis de expressão do MIC-1 (indicado como intensidades de sinal [de contagem de pixeis]) em tumor combinado tecidos adjacentes e tumorais; os tipos de análise foram os seguintes (como por Materiais e Métodos): (c) Análise de corrediça Total (WSA), (D) região de análise de interesse (ROI). pontos de dados individuais são mostrados como pequenos quadrados pretos (parcialmente sobrepostas); as caixas representam as medianas do grupo (linha através do meio) e quartis (percentis 25 e 75) nas suas extremidades; linhas acima e abaixo caixas indicam os percentis 10 e 90, respectivamente. Para cada análise, o número de imagens e de casos é indicada; valores de p acima dos painéis denotar o nível de significância estatística para as diferenças entre os grupos, conforme calculado pelo teste t de Student (p (t)) e pela Wilcoxon Rank somas de teste (p (WRS)).

PDGF-a expressão em tecidos tumorais foi elevada em menor escala e menos robusto do que o MIC-1 (2,1x para 3,7x por WSA e 1,7x para 3,1x por ROI) em comparação com os tecidos livres da doença (p 0,01 e p = 0,23). A sua expressão nos tecidos tumorais adjacentes era ligeiramente elevado e menos robusto (1,4x a 2,2x 1,6x e WSA por a 2,7x por ROI) em comparação com tecidos livres de doença (p 0,05 e P = 0,51) (Tabela 2). PDGF-A expressão foi analisada como uma função da média de dados (Fig. 4). Por conseguinte, a análise WSA indicou que o PDGF-A expressão foi significativamente diferente entre os tecidos de tumor e livre de doença (p (t) = 0,06; p (WRS) 0,05), mas não entre tumorais tecidos adjacentes e livre de doença (p (t ) = 0,12; p (WRS) = 0,13) para os níveis de expressão acima da mediana (Figura 4A).. Os níveis de expressão abaixo da mediana, não revelaram qualquer distinção entre estes tipos de tecidos (p = 0,16 e p = 0,23) (Fig. 4B). Análise pelo método ROI revelou um quadro mais favorável para a cancerização de campo. PDGF-A expressão foi significativamente diferente para os dois conjuntos de dados acima e abaixo da média entre tecidos tumorais e livre de doença (p (t) 0,05; p (WRS) 0,05) e entre tumor tecidos adjacentes e livre de doença ( P (t) 0,05; p (WRS) ≤0.05), enquanto que a expressão foi semelhante no tumor e do tumor tecidos adjacentes (p (t) = 0,61-0,65;. p (WRS) = 0,64 a 0,66) (Figuras 4C e 4D e quadro 2). Semelhante a MIC-1, o nível de heterogeneidade inter e intra-tecido para todos os tipos de medições foi elevada (coeficiente de variação = 85,9%).

(AD) PDGF-A níveis de expressão (indicado como sinal intensidades [contagem de pixeis]) em livre de doença, de tumor adjacente e tumorais tecidos; os tipos de análise foram os seguintes (como por Materiais e Métodos): análise corrediça Total (WSA) (A e B) para valores de (A) acima e abaixo (B) a média dos valores de todos os casos na UNMH /CHTN coorte; (C e D) região de interesse análise (ROI) para valores de (A) acima e abaixo (B) a média dos valores de todos os casos na coorte UNMH /CHTN. pontos de dados individuais são mostrados como pequenos quadrados pretos (parcialmente sobrepostas); as caixas representam as medianas do grupo (linha através do meio) e quartis (percentis 25 e 75) nas suas extremidades; linhas acima e abaixo caixas indicam os percentis 10 e 90, respectivamente. Para cada análise, o número de imagens e de casos é indicada; valores de p acima dos painéis denotar o nível de significância estatística para as diferenças entre os grupos, conforme calculado pelo teste t de Student (p (t)) e pela Wilcoxon Rank somas de teste (p (WRS)).

Discussão

cancerização de campo em tecidos da próstata é bem reconhecido, seja como um estado de pré-malignidade molecular anterior alteração histológica ou como uma reação à presença de um tumor na glândula. Este conceito interessante inclui uma multiplicidade de células e as funções celulares, e uma lista de factores de crescimento [7-10,16] caracterização. Temos relatado anteriormente no comprimento dos telômeros, um marcador de instabilidade genómica [17,18], e têm-se centrado mais recentemente sobre a desregulamentação de expressão de fatores de proteína [11,12]. O presente estudo representa uma contribuição para essa linha de pesquisa e adiciona dois fatores proteína secretada à lista de marcadores e /ou potenciais mediadores da cancerização de campo, isto é, MIC-1 e PDGF-A. Relatórios anteriores por nós e outros mostraram a sua desregulamentação ao nível da transcrição, sem informações sobre a expressão da proteína [11,19,20]. Em contraste, nós fornecemos uma quantificação aqui detalhada das expressões da proteína correspondentes em tecidos da próstata humanos.

MIC-1 e PDGF-A são factores segregados com um papel estabelecido na tumorigénese da próstata e progressão do cancro [21-25] . O papel de MIC-1 é menos claro e é relatado como tanto um promotor e um supressor de [13,25,26] cancro. Curiosamente, MIC-1 foi descoberta pela primeira vez em macrófagos [27], mas quando secretada por células de cancro da próstata, pode promover um ambiente pró-tumorigénico por suprimir a actividade anti-cancro de células imunes [23]. O papel do PDGF-A no câncer de próstata é mais estabelecida. PDGF-A é uma das quatro isoformas que formam dímeros funcionais e se ligam aos receptores de quinase de tirosina e PDGFRα PDGFRβ. PDGFs estimular o crescimento, a sobrevivência, a motilidade e de vários tipos de células e têm funções importantes durante o desenvolvimento embrionário e no controlo da homeostase do tecido. sinalização de PDGF hiperativo está associada ao desenvolvimento e progressão do câncer de próstata através parácrina e autócrina [21,22], e constitui um alvo molecular maior para agentes terapêuticos clinicamente estabelecidos, como imatinib [28]. Secretado, ao contrário de intra-celular, marcadores e mediadores de campo de cancerização encaixar dois modelos principais para explicar o desenvolvimento de campos de molecularmente alteradas [9]. Assim, as células com sobre-regulada MIC-1 e PDGF-A expressão pode agir localmente de forma autócrina, induzindo pequenos consórcios de células hiperproliferativas propensas a outra alteração genética e bioquímica para a transformação. Alternativamente, quando secretada por células cancerosas, que poderiam influenciar as áreas mais distantes da glândula prostática, desse modo induzindo campos secundários de células alterados molecularmente e talvez induzindo a multifocalidade bem descrito de cancro da próstata [29].

Com respeito a pesquisa biomédica, nossas observações apoiar noções anteriores que os tecidos adjacentes aos tumores podem não representar os controles mais ideais para estudos moleculares [30]. Além disso, nós e outros já anteriormente argumentado que os marcadores da cancerização de campo pode ter potenciais aplicações clínicas [7-10]. Uma limitação potencial é a heterogeneidade destaque entre e até dentro dos tecidos. Isto pode ser devido, em parte, ao método de quantificação sofisticado e sensível utilizada neste estudo, e não deve impedir o estabelecimento de valores de clinicamente informativos em estudos futuros. Embora o presente estudo não foi desenhado nem alimentado para determinar conclusivamente a associação da MIC-1 e PDGF-A com parâmetros clínicos, observou-se que os níveis de MIC-1 expressão diferenciada significativamente patológica estágio T2 a partir T3 em tecidos tumorais (p 0,001 e p 0,05), e foram moderadamente associados com Gleason pontuação ≤6

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. 6 e ≤7

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. 7 (P 0,05-0,13). Isto está de acordo com a capacidade anteriormente relatado de MIC-1 para actuar como um marcador de prognóstico no cancro da próstata [31-33] e corrobora a coloração e quantificação abordagem. Em contraste, o MIC-1 expressão em tumores tecidos adjacentes não mostrou qualquer associação com estágio patológico ou grau Gleason. Uma associação de PDGF-A expressão com parâmetros clínicos era menos óbvio, mas vale ressaltar que em ambos os tumores e tumores tecidos adjacentes, PDGF-A expressão tenderam a distinguir entre a pontuação de Gleason ≤6

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. 6 (p 0,05-0,13). Embora a via de sinalização do PDGF /PDGFR é fortemente implicado no desenvolvimento e progressão do cancro da próstata [21,22], a sua capacidade como biomarcador independente de prognóstico no cancro da próstata não tenha sido completamente descrita. O nosso trabalho indica que os marcadores proteicos de cancerização campo pode ser mais explorados como marcadores de diagnóstico em vez de prognósticos [12].